Reconstruction de signatures de fluorescence innées unicellulaires par microscopie confocale

Ici, un protocole est présenté pour extraire optiquement et cataloguer les signatures de fluorescence cellulaire innée (c’est-à-dire l’autofluorescence cellulaire) de chaque cellule vivante individuelle distribuée dans un espace tridimensionnel. Cette méthode convient à l’étude de la signature de fluorescence innée de divers systèmes biologiques à une résolution unicellulaire, y compris les cellules de bactéries, de champignons, de levures, de plantes et d’animaux.

L’analyse de fluorescence innée unicellulaire (CRIF) assistée par microscopie confocale assistée par microscopie à réflexion confocale est décrite ici, une méthode mini-invasive pour reconstruire la signature de fluorescence cellulaire innée de chaque cellule vivante individuelle dans une population distribuée dans un espace tridimensionnel (3D). La signature de fluorescence innée d’une cellule est une collection de signaux de fluorescence émis par diverses biomolécules à l’intérieur de la cellule. Des études antérieures ont établi que les signatures de fluorescence innées reflètent diverses propriétés cellulaires et différences d’état physiologique et constituent une riche source d’information pour la caractérisation et l’identification cellulaires. Les signatures de fluorescence innées ont traditionnellement été analysées au niveau de la population, nécessitant une culture clonale, mais pas au niveau de la cellule unique. CriF est particulièrement adapté aux études qui nécessitent une résolution 3D et/ou une extraction sélective des signaux de fluorescence de cellules individuelles. Parce que la signature de fluorescence est une propriété innée d’une cellule, CRIF convient également à la prédiction sans étiquette du type et / ou de l’état physiologique des cellules intactes et uniques. Cette méthode peut être un outil puissant pour l’analyse cellulaire rationalisée, où le phénotype de chaque cellule dans une population hétérogène peut être directement évalué par sa signature d’autofluorescence sous un microscope sans marquage cellulaire.

Diverses biomolécules au sein d’une ^cellule1 émettent des signaux d’autofluorescence, et la signature de fluorescence innée d’une cellule consiste en l’assemblage de ces signaux. Cette fluorescence caractéristique reflète diverses propriétés cellulaires ainsi que des différences d’état physiologique. L’analyse de la fluorescence innée est peu invasive et peut compléter les sondes microbiologiques traditionnelles plus invasives qui laissent une gamme de traces allant d’une légère modification métabolique à la destruction cellulaire complète. Bien que les techniques traditionnelles telles que l’extraction de l’ADN ou du contenu ^{cellulaire2,3}, l’hybridation fluorescente in ^situ4 et l’introduction de gènes rapporteurs fluorescents dans le génome soient efficaces pour déterminer le type de cellule ou l’état physiologique, elles nécessitent généralement une manipulation des cellules ou un marquage invasif.

Des études sur la fluorescence innée de diverses colonies microbiennes vivantes et intactes, y compris les suspensions de culture microbienne en ^vrac5,6, les boues ^actives7, les tissus de ^{mammifères8,9} et les cellules de ^{mammifères1,10}, ont montré que l’analyse de fluorescence innée facilite l’analyse sans étiquette des types de cellules et de l’état physiologique. Les signatures de fluorescence innées ont été traditionnellement analysées au niveau de la population et non au niveau de la cellule unique, et nécessitent donc une culture clonale. En revanche, la technique d’analyse de fluorescence inéscence unicellulaire assistée par microscopie unicellulaire assistée par réflection confocale11 décrite ici reconstruit et catalogue la signature de fluorescence cellulaire innée de chaque cellule microbienne vivante individuelle. De plus, criF peut systématiquement rassembler la signature de fluorescence innée d’une seule cellule microbienne au sein d’une population distribuée dans un espace tridimensionnel (3D).

1. Préparation de l’échantillon

1. Placez un joint en silicone de 1 mm d’épaisseur avec des puits sur une lame en verre.
2. Placez une dalle d’agarose de 1 mm d’épaisseur à 0,8 % (p/v) dans le puits du joint en silicone.
3. Diluer la densité cellulaire d’une culture cellulaire microbienne arbitraire à une densité optique de 600 nm (_OD660) = 1,0.
4. Placer une aliquote de 5 μL de suspension cellulaire sur la dalle d’agarose.
5. Couvrir doucement avec un couvercle en verre.

2. Installation d’un microscope

REMARQUE: La technique CRIF combine la microscopie confocale par réflexion (CRM) et la microspectroscopie confocale multicanal. Le CRM sert de source d’information pour la morphologie cellulaire et la localisation spatiale, qui est indépendante de la fluorescence cellulaire innée. La microspectroscopie confocale multicanal fournit l’information spectrale de la fluorescence cellulaire innée. Dans le protocole suivant, toute image acquise avec crm ou microspectroscopie à fluorescence confocale est appelée image CRM ou image de microspectroscopie confocale multicanal, respectivement.

1. Connectez un microscope confocal avec des canaux spectraux décannés à un tube photomultiplicateur (PMT) ou à un détecteur GaAsP.
   REMARQUE: Ces configurations sont disponibles auprès de plusieurs fabricants.
2. Équipez le microscope d’un objectif à grande ouverture numérique (NA) avec un grossissement adéquat.
   REMARQUE: Un objectif 63x avec NA > 1.4 est recommandé pour l’analyse des cellules bactériennes.
3. Équipez le microscope d’un miroir à demi-réflexion (p. ex., NT 80/20) pour s’adapter au CRM, qui repose sur la diffusion cellulaire de la lumière incidente pour visualiser la morphologie cellulaire.
4. Pour la microspectroscopie confocale multicanal, équipez le microscope de miroirs dichroïques. Par exemple, utilisez des séparateurs de faisceau MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 ou MBS 488/543/633 pour une excitation de 405, 458, 488, 514, 543 ou 633 nm, respectivement.
5. Ajustez l’intensité de l’éclairage pour chaque longueur d’onde d’excitation à l’aide d’un capteur de puissance laser. Gardez la sortie sous le microscope constante grâce aux longueurs d’onde d’excitation (par exemple, utilisez 50 μW avec l’objectif 63x).

3. Acquisition d’images

1. Réglez la taille du sténopé sur 1 UA à l’aide du logiciel de microscope.
2. Réglez le temps de séjour des pixels (c’est-à-dire la vitesse de balayage) pour chaque longueur d’onde d’excitation.
   REMARQUE: Un temps de séjour en pixels excessivement long peut endommager les cellules. Évitez le temps de séjour des pixels excessivement long pour minimiser les dommages photo aux cellules. Pour les échantillons bactériens, un temps de séjour en pixels <55,6 μs/^μm2 (lorsque la sortie d’irradiance au microscope est d’environ 17 μW/^cm2) est généralement approprié pour éviter l’inhibition de la croissance. Ce paramètre peut varier en fonction des organismes et des configurations expérimentales.
3. Définissez la résolution de numérisation. Pour les petites cellules telles que les bactéries, utilisez une zone de balayage de 1 024 x 1 024.
4. Définissez la plage de balayage Z de sorte que la région d’intérêt soit couverte.
   REMARQUE: Pour les échantillons de cellules bactériennes et de levure distribués sur une dalle d’agarose, une plage de balayage Z d’environ 15 μm est généralement suffisante.
5. Réglez le détecteur désenchanté pour qu’il capture la gamme de longueurs d’onde visible (p. ex., 416−691 nm). Utilisez une fenêtre spectrale de 8−10 nm.
6. Acquérir des images de microspectroscopie confocale multicanal dans une séquence allant des longueurs d’onde d’excitation les plus longues aux plus courtes pour créer des piles Z d’images de fluorescence.
7. Acquérir des images CRM.
8. Enregistrez les images acquises en tant que fichiers tiff 16 bits dans un répertoire. Nommez les fichiers à l’aide de la convention de dénomination XXXcYYzZZ.tif, où XXX est la longueur d’onde d’excitation, YY est le numéro de canal du détecteur, ZZ est le numéro de tranche Z et « c » et « z » sont des préfixes pour le numéro du détecteur et le numéro de tranche Z, respectivement.
   1. Par exemple, si une image de microspectroscopie confocale multicanal est prise avec une longueur d’onde d’excitation de 405 nm, 1er canal de détection du réseau de ^détecteurs, et est la ^5ème tranche de la pile Z, nommez-la « 405c01z05.tif ». Pour les images CRM, utilisez la chaîne « CRM » à la place de XXX (par exemple, « CRMc01z05.tif »).
      REMARQUE: Décidez si la segmentation 2D ou 3D est la plus appropriée pour les données d’image. Utilisez une méthode de segmentation 2D dans les situations où les petites cellules sont contraintes à un plan 2D (par exemple, une population bactérienne adhérant à une surface de verre). Utilisez la méthode de segmentation 3D dans les situations où la population cellulaire est distribuée dans un espace tridimensionnel (p. ex., biofilms et échantillons de tissus) ou où la taille des cellules est supérieure à l’épaisseur de la tranche optique (p. ex., cellules de levure, cellules de mammifères). Pour la segmentation 2D, reportez-vous à la section 4; pour la segmentation 3D, reportez-vous à la section 5.

4. Analyse d’images 2D

1. Équipez un poste de travail d’un logiciel d’analyse d’images (par exemple, MATLAB).
2. Effectuer la segmentation cellulaire et la reconstruction de signatures de fluorescence innées unicellulaires.
   1. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images.
   2. Double-cliquez et ouvrez l’un des scripts fournis « Script2D.m ».
   3. Accédez à l’onglet Éditeur , puis cliquez sur Exécuter. Une fenêtre de sélection de dossier doit apparaître.
   4. Sélectionnez le répertoire créé à l’étape 3.8, puis cliquez sur Ouvrir pour continuer. Une boîte de dialogue qui invite à saisir le paramètre de segmentation apparaîtra automatiquement.
      REMARQUE : À des fins de test, sélectionnez l’ensemble de données fourni (« Sample_2D »). L’exemple de jeu de données est fourni sous forme de fichier compressé et doit être extrait à l’avance.
   5. Entrez les paramètres de segmentation : Seuil de binarisation d’image (0−1) pour binarisation d’image = 0,45, Seuil supérieur pour une région cellulaire (en pixels) = 200, Seuil inférieur pour une région cellulaire (en pixels) = 10 et Nombre de détecteurs = 32. Cliquez sur OK pour continuer.
      REMARQUE: Ces paramètres peuvent nécessiter un ajustement en fonction de la qualité de l’image.
   6. Une nouvelle fenêtre d’image présentant une image CRM doit apparaître. Sélectionnez une région d’arrière-plan arbitraire (c.-à-d. une zone où les cellules sont absentes) à utiliser pour la soustraction d’arrière-plan. Dessinez un rectangle dans l’image CRM en faisant glisser la souris. Double-cliquez dans la région sélectionnée pour confirmer la sélection.
   7. Recherchez un nouveau répertoire nommé Signature dans le même répertoire sélectionné à l’étape 4.2.4.
      Remarque : Le code fourni crée automatiquement ce répertoire. Le répertoire « Signature » stocke la signature de fluorescence innée de chaque cellule microbienne d’une population sous forme de fichiers .png numérotés en série après un préfixe commun « Signature ».

5.3D analyse d’images

1. Équiper un poste de travail du logiciel d’analyse d’images (Table des matériaux).
2. Effectuer la segmentation cellulaire et la reconstruction de signatures de fluorescence innées unicellulaires.
   1. Ouvrez le logiciel d’analyse d’images.
   2. Double-cliquez et ouvrez le script fourni « Script3D.m ».
   3. Accédez à l’onglet Éditeur , puis cliquez sur Exécuter. Une fenêtre de sélection de dossier doit apparaître.
   4. Sélectionnez le répertoire créé à l’étape 3.8, puis cliquez sur Ouvrir pour continuer. Une boîte de dialogue qui invite à saisir les paramètres de segmentation apparaîtra automatiquement.
      REMARQUE : À des fins de test, sélectionnez l’ensemble de données fourni (« Sample_3D »). L’exemple de jeu de données est fourni sous forme de fichier compressé et doit être extrait à l’avance.
   5. Entrez les paramètres de segmentation : Seuil de binarisation d’image (0–1) pour la binarisation d’image = 0,01, Seuil supérieur pour un volume de cellule (en pixels) = 1 000, Seuil inférieur pour une région cellulaire (en pixels) = 20, Taille de pixel X [μm/pixel] = 0,26, Taille de pixel Y [μm/pixel] = 0,26, Taille de pixel Z [μm/pixel] = 0,42 et Nombre de détecteurs = 32. Cliquez sur OK pour continuer; une boîte de dialogue qui invite l’entrée pour le nombre de longueurs d’onde d’excitation apparaîtra.
      REMARQUE: Ces paramètres peuvent nécessiter un ajustement en fonction de la qualité de l’image.
   6. Entrez le nombre de longueurs d’onde utilisées pour l’acquisition d’images (par exemple, si 405, 488, 561, 630 sont utilisées, entrez 4 dans la boîte de dialogue). Cliquez sur OK.
   7. Entrez les longueurs d’onde d’excitation dans une séquence allant de la plus courte (c.-à-d. nom de la boîte : Excitation n° 1) à la plus longue longueur d’onde dans les boîtes de dialogue. Cliquez sur OK pour continuer; une nouvelle fenêtre d’image qui présente une image CRM devrait apparaître.
   8. Sélectionnez la région d’arrière-plan arbitraire (c.-à-d. la zone où les cellules sont absentes) à utiliser pour la soustraction d’arrière-plan. Dessinez un rectangle dans l’image CRM en faisant glisser la souris. Double-cliquez dans la région sélectionnée pour confirmer la sélection.
   9. Recherchez le répertoire nommé Signature dans le répertoire sélectionné à l’étape 5.2.4.
      Remarque : Le code fourni crée automatiquement ce répertoire. Le répertoire « Signature » stocke la signature de fluorescence innée de chaque cellule microbienne d’une population sous forme de fichiers .png numérotés en série après un préfixe commun « Signature ».

6. Analyse statistique

REMARQUE : Effectuer des techniques de réduction dimensionnelle (p. ex., analyse en composantes principales [APC]) pour visualiser la distribution des hyperspectres des populations cellulaires. Le script fourni (PCA.py) exécute PCA pour deux populations de cellules (c’est-à-dire deux classes).

1. Équiper un poste de travail du langage de programmation et des bibliothèques et modules qui l’accompagnent (Table des matériaux).
2. Créez un répertoire vide dans le lecteur C (ou équivalent) et nommez le répertoire « Parent_directory » (c’est-à-dire, C:/ Parent_ répertoire).
3. Stockez les signatures de fluorescence (par exemple, les fichiers .png générés à l’étape 4.2.7) de chacune des deux populations cellulaires dans deux répertoires distincts.
   REMARQUE: Les deux répertoires doivent être tous deux situés dans le « Parent_directory ».
   
   C:/Parent_directory/
   putidaKT2440/
    Signature01.png
    Signature02.png
    :
   putidaKT2442/
    Signature01.png
    Signature02.png
    :
4. Téléchargez PCA.py dans le « Parent_directory ».
5. Ouvrez l’interface de ligne de commande du poste de travail.
6. Tapez « python C:/Parent_directory/PCA.py » dans l’interface de ligne de commande.
7. Sélectionnez le « Parent_directory » après l’affichage du message « Sélectionner le répertoire cible ».
8. Dans le « C:/Parent_directory », recherchez « PCA.png », qui contient un graphique PCA résultant.

La figure 1A montre la signature de fluorescence unicellulaire typique d’une cellule bactérienne présentée sous la forme d’un diagramme de spectre traditionnel (en haut) et d’une carte thermique (au milieu). La figure 1B montre le résultat d’une segmentation cellulaire 2D précise superposée à l’image CRM originale d’une population de bactéries du sol (Pseudomonas putida KT2440)¹². Les signatures de fluorescence innées résultantes pour la population sont présentées sous forme de carte thermique dans la figure 1D. Il convient de noter que la variabilité intrapopulation était relativement mineure après une segmentation cellulaire réussie. Un exemple de segmentation cellulaire inexacte est illustré à la figure 1C, qui se superpose à la même population de P. putida que celle illustrée à la figure 1B. L’impact d’une segmentation cellulaire inexacte sur les signatures de fluorescence innées de la population est facilement évident à partir du nombre considérable de valeurs aberrantes (Figure 1E, triangles rouges). Une segmentation cellulaire inexacte a entraîné un amas plus lâche après l’APC par rapport au groupe serré obtenu à la suite d’une segmentation cellulaire précise (figure 1F).

Typiquement, malgré la variabilité intra-espèce, les signatures de fluorescence innées de différents types de cellules forment des grappes distinctes. La figure 2C présente le résultat des analyses DE LCP pour une paire taxonomiquement proche de souches (souche KT2440 et KT244213 de P. putida). Malgré la variabilité mineure observée au sein de chaque population distincte (figure 2A, B), chaque population formait un groupe distinct sur le diagramme d’analyse de l’APC (figure 2C).

La figure 3A montre le résultat d’une segmentation cellulaire 3D précise superposée à l’image CRM originale d’une population de levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae YM427114. La figure 3B montre les signatures de fluorescence innées résultantes pour la population.

Figure 1 : Précision de la segmentation et variabilité apparente intra-espèces. (A) Signature typique de fluorescence innée unicellulaire d’une cellule bactérienne (P. putida KT2440), présentée sous la forme d’un diagramme de spectre (en haut) et d’une carte thermique (au milieu). La longueur d’onde d’émission est indiquée sous la forme d’une carte de couleur arc-en-ciel (en bas). L’axe Y du diagramme du spectre et la couleur de la carte thermique indiquent tous deux les intensités de fluorescence relatives. Les chiffres en bas indiquent la longueur d’onde d’excitation. Représentation visuelle de la reconnaissance précise (B) et inexacte (C) de la région cellulaire par l’algorithme d’analyse d’image. L’ombrage bleu clair indique les régions cellulaires détectées pour une population de bactérie du sol P. putida KT 2440. Les objets blob avec une numérotation rouge dans le panneau C sont des exemples de fausse détection, où l’algorithme a classé les régions non cellulaires (c’est-à-dire le bruit de fond) comme des régions cellulaires en raison de paramètres de seuil de binarisation inappropriés. Barres d’échelle = 1 μm partout. Les panneaux D et E représentent les signatures de fluorescence innées pour la même population, générées avec une segmentation cellulaire précise et inexacte, respectivement. Chaque colonne montre un hyperspectre unicellulaire reconstruit présenté sous la forme d’une matrice 1 x 192, où la carte des couleurs jaune-bleu indique l’intensité relative de la fluorescence. (F) La variance des signatures de fluorescence innées dans des segmentations précises (bleu clair) et inexactes (rouge) visualisées à l’aide de PCA. Chaque étiquette d’axe indique le numéro de composant et sa contribution cumulative en pourcentage à l’analyse de l’APC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Variabilité intra- et inter-espèces des signatures de fluorescence innées. Signatures de fluorescence innées présentées sous forme de cartes thermiques pour une population de P. putida KT2440 (A) et P. putida KT2442 (B). (C) Projection des deux paires de signatures de fluorescence innées visualisées à l’aide de PCA, correspondant à P. putida KT2440 (rouge, n = 288) et P. putida KT2442 (bleu, n = 373). Les axes X et Y représentent respectivement PC1 et PC2. Le numéro en médaillon indique le centre de chaque amas (1 : P. putida KT2440, 2 : P. putida KT2442). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Exemple de segmentation 3D et d’extraction de signature de fluorescence innée. (A) Projection 3D de régions reconnues comme populations cellulaires de levure bourgeonnante S. cerevisiae YM4271. Les numéros en médaillon sont les numéros d’identification. (B) Carte thermique des signatures de fluorescence innées extraites des régions 3D. Le numéro de l’axe X correspond au numéro d’identification. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Il y a deux points critiques dans cette méthode qui doivent être suivis de près pour obtenir des résultats reproductibles: 1) maintenir la puissance de sortie laser sous l’objectif du microscope cohérente à travers les longueurs d’onde d’excitation et les expériences, et 2) effectuer une segmentation cellulaire précise.

Le premier point est particulièrement important lorsque l’on compare la signature de fluorescence innée entre différentes expériences. Évitez d’appliquer simplement les mêmes paramètres de « pourcentage de sortie » aux longueurs d’onde d’excitation (c.-à-d. en utilisant 5 % de puissance de sortie pour toutes les lignes laser 405, 488, 514 et 530 nm), car la puissance maximale de sortie peut différer jusqu’à un ordre de grandeur entre les lignes laser. En outre, l’objectif et l’optique interne ont généralement des caractéristiques d’absorption optique inégales, qui doivent également être prises en compte. Pour ces raisons, il est recommandé de mesurer la sortie sous l’objectif à l’aide d’un capteur de puissance laser (Table des matériaux). Il est également recommandé de prendre cette mesure toutes les quelques expériences, ou périodiquement, car la sortie des lignes laser peut se désintégrer considérablement en quelques années.

Le deuxième point, la segmentation cellulaire précise, devient particulièrement important dans les situations où la variabilité intra- ou inter-espèces est une préoccupation. Une segmentation cellulaire inexacte (figure 1D) entraîne des points de données aberrants (figure 1E, indiquée par des triangles rouges) et une plus grande variabilité apparente intra-espèce. Les paramètres de segmentation doivent être déterminés avec soin, en vérifiant la précision de la segmentation cellulaire en superposant les résultats de la segmentation sur l’image CRM d’origine, avant de procéder à une analyse supplémentaire ou à des modèles d’apprentissage automatique. Si vous travaillez avec une image de mauvaise qualité, un traitement d’image supplémentaire peut être nécessaire pour obtenir une segmentation précise. L’utilisation d’un « filtre gaussien » ou d’un « filtre médian » peut supprimer les artefacts granuleux, et le traitement bilatéral du filtre contrecarre tout arrière-plan rayé.

Avec une optique de mauvaise qualité (p. ex., un objectif de qualité non confocale) ou une sensibilité insuffisante du détecteur, il peut être difficile de détecter de faibles signatures de fluorescence innées. Notez qu’en utilisant la configuration décrite ici et ^{précédemment11}, nous n’avons rencontré aucun type d’échantillon cellulaire dont la fluorescence innée était trop faible pour reconstruire une signature de fluorescence innée. Bien qu’une sortie d’émission plus élevée pour l’excitation et un temps de séjour des pixels plus long puissent être utilisés pour obtenir des signaux d’émission plus forts, cela peut endommager les échantillons de cellules. Une solution potentielle pour les cas où une faible fluorescence innée est un problème est de réduire l’intensité du signal de fond, par exemple en suspendant les cellules dans un tampon ou un milieu synthétique au lieu de bouillon. Les types de récipients cellulaires, tels que les paraboles à fond de verre et les dispositifs microfluidiques, sont compatibles et appropriés pour cette technique, bien qu’une dalle d’agarose ait été utilisée pour maintenir les cellules en position ici et dans une étude ^{précédente15}.

La méthode du microscope confocal offre une résolution spatiale et une analyse in situ pour les populations de cellules adhérentes, les biofilms et les échantillons de tissus. Un compromis potentiel de cette méthodologie est le débit maximal par rapport à un cytomètre en flux, par exemple. Un ensemble complet de scans confocaux recueillant quelques centaines à mille signatures de fluorescence innées avec un seul ensemble de scans peut prendre jusqu’à quelques minutes. Un cytomètre en flux est moins sensible en raison de sa conception optique, mais peut potentiellement atteindre un débit de plusieurs ordres de grandeur supérieur.

Identifier rigoureusement un composé responsable d’un pic spécifique dans une signature fluorescente innée est généralement difficile, en raison de sa nature compliquée. Cependant, il a été suggéré qu’un certain nombre de molécules biologiquement pertinentes, telles que les vitamines (par exemple, flavine adénine dinucléotide [FAD]), les coenzymes (par exemple, nicotinamide adénine dinucléotide [NADH]) et les pigments lipofuscine pourraient être des fluorophores majeurs dans les ^cellules1,16. Par exemple, le FAD a un maximum d’excitation compris entre 350 et 450 nm et un pic d’émission d’environ 525 ^nm16. Le NADH libre a un maximum d’excitation et un pic d’émission à 340 nm et 460 nm, respectivement, bien que les spectres d’émission du NADH lié aux protéines diffèrent16,17,18. Les lipopigments connus pour s’associer à des cellules stressées ou âgées ont une large plage d’excitation (350-500 nm) et une plage d’émission (450-600 nm)^16,18.

L’utilisation du CRM offre une source d’information indépendante pour identifier les contours des cellules et offre donc un autre avantage significatif du CRIF : l’extraction sélective des signaux de fluorescence à partir de cellules individuelles distribuées dans un espace 3D. Cela représente un pas en avant par rapport à l’analyse traditionnelle des caractéristiques de fluorescence d’une colonie microbienne entière ou d’une suspension de culture en vrac, qui est un mélange moyen de signaux provenant d’un grand nombre de cellules contaminées par des signaux non cellulaires provenant de composants moyens, de métabolites sécrétés et de matrices extracellulaires.  Une analyse des signatures de fluorescence innées unicellulaires permet une caractérisation prédictive de l’état physiologique des cellules intactes, fournissant une solution potentielle pour résoudre le développement temporel de la distribution et de l’état physiologique d’une cellule.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette étude a été soutenue en partie par une subvention pour la recherche scientifique du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports et de la Technologie du Japon (18K04843) à Y. Yawata, du JST ERATO (JPMJER1502) à N. Nomura.