Method Article
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.
La transfection, la délivrance d'acides nucléiques étrangers dans une cellule, est un puissant outil pour la recherche de protéines. Grâce à cette méthode, les canaux ioniques peuvent être étudiés par analyse électrophysiologique, la caractérisation biochimique, des études mutationnelles et leurs effets sur les processus cellulaires. Des transfections transitoires proposent un protocole simple dans lequel la protéine est disponible pour l'analyse au bout de quelques heures à quelques jours. Bien que cette méthode présente un protocole efficace relativement simple et le temps, l'un des éléments essentiels est l'étalonnage de l'expression du gène d'intérêt à des niveaux pertinents physiologiques ou des niveaux qui sont adaptés à l'analyse. A cet effet, de nombreuses approches différentes qui offrent la possibilité de contrôler l'expression du gène d'intérêt sont apparus. Plusieurs protocoles de transfection de cellules stables constituent un moyen d'introduire de façon permanente un gène d'intérêt dans le génome cellulaire sous la régulation d'une transcriptase tétracycline contrôléeactivation tional. Bien que cette technique produit des niveaux d'expression fiables, chaque gène d'intérêt nécessite quelques semaines de travail qualifié y compris l'étalonnage d'une courbe de mise à mort, la sélection des colonies de cellules, et dans l'ensemble plus de ressources. Ici, nous présentons un protocole utilisant une transfection transitoire de l'élément de potentiel sous-famille V du canal de cation 1 (TRPV1), le gène transitoire de récepteur dans un système inductible comme un moyen efficace pour exprimer une protéine de manière contrôlée ce qui est essentiel dans l'analyse du canal ionique. Nous démontrons que l'utilisation de cette technique, nous sommes en mesure d'effectuer l'imagerie calcique, cellules entières, et l'analyse de canal unique avec des niveaux de canaux contrôlés requis pour chaque type de collecte de données avec une seule transfection. Dans l'ensemble, cela fournit une technique réplicable qui peut être utilisée pour étudier les canaux ioniques structure et fonction.
Systèmes exprimant hétérologue est l' une des techniques les plus couramment utilisées pour étudier une multitude de fonctions cellulaires 1. Leur faible profil endogène des protéines, un minimum d'entretien, la croissance fiable, et la capacité de prendre et d' exprimer l' ADN étranger ont fait des lignées cellulaires telles que rein embryonnaire humain (HEK293) et ovaire de hamster chinois (CHO) presque indispensable à la recherche biologique 2, 3. Les domaines de recherche en utilisant des systèmes hétérologues comprennent des protéines membranaires, la signalisation intracellulaire, et l'activité enzymatique. Après la transfection d'ADN étranger dans la cellule, de nombreuses formes différentes d'analyse peuvent être effectués, y compris l' électrophysiologie, l' imagerie calcique ratiométrique, western blot, etc. 4, 5.
En raison de la vaste gamme d'applications potentielles pour les systèmes d'expression hétérologues, beaucoup différedes réactifs et des produits nt ont été développés pour utiliser ces cellules et leurs qualités 6. systèmes de délivrance d'ADN qui transitoirement ou définitivement intégrer l'ADN étranger dans des cellules pour étudier la protéine exogène est devenu l'un des outils les plus populaires et utiles pour la recherche biologique. Plus précisément, la transfection transitoire d'ADN dans une cellule est largement utilisé comme un processus simple et directe qui nécessite relativement peu de temps et de matériaux. En outre, le taux de succès des cellules qui subissent une transfection 7 est élevée. Cette technique est très fiable lorsqu'elle est associée à un gène marqueur tel que la protéine fluorescente verte (GFP), et peut être utilisé pour de nombreuses techniques différentes telles que l' imagerie du calcium et 5 électrophysiologie. Malheureusement, cependant, exprimant de manière transitoire l'ADN dans des cellules hôtes est livré avec quelques écueils majeurs, pas le moins que le niveau d'expression par cellule est peu fiable. Le nombre de copies d'ADN de plasmide prise up par cellule est incontrôlable, donc l'expression entre les expériences individuelles peut varier considérablement 2. Cette question devient importante lorsque l'essayer de reproduire les conditions physiologiques, ou d'effectuer des techniques de collecte de données précises.
En tant que solution aux complications mentionnées ci-dessus, des protocoles de transfection stables ont été conçues dans lesquelles un gène d'intérêt peut être inséré dans le génome d'une cellule sous le contrôle étroit d'un promoteur inductible, tel qu'un système de tetracycline répresseur de l'expression, assurant une seule copie du plasmide intègre dans le génome de chaque cellule et est exprimé uniquement après l'induction du mécanisme de transcription, par exemple, en présence de doxycycline. Bien que cela résout les obstacles de niveaux d'expression de protéines incompatibles, cette méthode perd la commodité du protocole rapide et relativement simple de transfections transitoires. L'établissement d'une lignée cellulaire stable prend au moins quelques semaines à which on doit étalonner une courbe de mise à mort fixé par des antibiotiques spécifiques pour maintenir l'expression de protéines et d'assurer l'intégration du vecteur et habilement sélectionner et cultiver des colonies de cellules. Dans l' ensemble cela prend beaucoup plus de temps et d' effort avec un taux de réussite inférieur 8.
Ici, nous présentons un protocole intermédiaire qui appuie sur les points forts des deux options de transfection populaires pour fournir un moyen simple et efficace pour contrôler les niveaux d'expression dans toute lignée cellulaire inductible. Tout en conservant les cellules avec un système Tet inductible, nous transfecter transitoirement notre gène d'intérêt, le récepteur transitoire canal cationique sous-famille V membre potentiel 1 (TRPV1), ligaturé dans un vecteur qui peut se combiner avec l'homologue système répresseur. De cette manière, le gène peut être introduit dans les cellules sans commencer à exprimer. Seulement avec l'ajout de doxycycline ne le gène commence à exprimer, ce qui nous permet d'étalonner les niveaux de protéines expression selon la technique ou à des niveaux observés dans des conditions physiologiques. Notre protocole permet également d'éviter de longues complications associées à la génération d'une lignée cellulaire exprimant de manière stable. Nous commençons par montrer l'évolution des niveaux d'activation de TRPV1 en imagerie de calcium à travers quatre heures d'induction et comment la hausse des taux de calcium intracellulaire est corrélée induite non. Nous avons ensuite dupliquer le protocole dans la configuration cellule entière de la technique du patch clamp, montrant le courant augmente avec le temps de l'induction de plus en plus. Enfin, nous présentons des exemples d'enregistrements individuels d'électrophysiologie de canal, et de montrer que cette technique est particulièrement utile pour l'expression contrôlée lors de la recherche pour la collecte de données précises sur la base de différentes unités de la protéine. Grâce à notre protocole, nous offrons un moyen pratique pour contrôler l'expression des protéines dans des systèmes hétérologues, tout en évitant de longues complications de culture cellulaire, fournissant ainsi un moyen de contrôler les conditions entre les expériences et fournir des more des résultats reproductibles.
1. ligaturer le gène d'intérêt dans le site répressible de Vector
2. Lignes de culture de cellules exprimant TetR
3. transfectant le plasmide d'intérêt dans les cellules
4. Les cellules de placage sur Poly-D-Lysine (PDL) Lamelles / Wells
5. Induire Expression génique
6. Calibrage Chronologie de l'expression des protéines
Pour créer rapidement un modèle d'expression inductible, nous avons utilisé des cellules HEK293 qui expriment la protéine tétracycline répresseur (TR) (par exemple, T-REx-293) et des vecteurs qui contiennent des séquences d'opérateur de tétracycline (TetO) entre le promoteur CMV et le site de clonage multiple (par exemple, pcDNA4 / TO). Lorsqu'il est transfecté dans des cellules 293-trex, l'expression du gène d'intérêt dans pcDNA4 / TO est réprimée, TR se lie à TetO. L'addition de doxycycline au milieu empêche l'interaction TR TetO, permettant ainsi l'expression de la protéine transfectée. Pour contrôler l'expression de rat TRPV1 (rTRPV1) nous avons inséré le gène de ce canal dans un pcDNA4 / TO vecteur en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Ensuite, T-REx-293 cellules ont été transfectées avec le rTRPV1- pcDNA4 / TO plasmide selon les étapes au point 3 du protocole. Après la transfection, l'expression rTRPV1 a été induite par incubation des cellules en présence de doxycycline (1 μg / ml) pendant 1-4 heures. Surtout, différentes concentrations de doxycycline peuvent être utilisés pour atteindre le taux d'expression souhaité. Nous avons utilisé des méthodes d'imagerie électrophysiologiques et de calcium pour évaluer rTRPV1 niveau d'expression à chaque point de temps en appliquant son agoniste, la capsaïcine. Comme on le voit sur la figure 1, en utilisant l' imagerie calcique des cellules vivantes, le taux de calcium intracellulaire après l' application de la capsaicine est augmentée graduellement avec de plus longs temps d'induction. L'activation des cellules non induites peut être attribuable à une fuite de base de l'activité de RT, la surexpression du plasmide, ou à la tetracycline résiduel dans les cellules des composants multimédias. Ensuite, nous avons enregistré des courants à partir de cellules en utilisant la configuration de cellule entière de la technique du patch clamp appliquant des rampes de tension entre -80 mV à +80 mV. La figure 2 montre que les amplitudes de courant élevées sont obtenues avec de plus longs temps d'induction. La saturation de l'amplitude de courant à 4 h d'induction est Consistent à la saturation vu dans la réponse au calcium (figure 1). Enfin, nous avons analysé les niveaux d'expression rTRPV1 dans la configuration de sortie à l'extérieur de la technique de patch-clamp. L'une des difficultés majeures dans l'étude de canal ionique structure-fonction est d'atteindre des niveaux appropriés pour l'analyse à canal unique expression. En fonction de la conductance unitaire rTRPV1 publié 4, l'amplitude du courant nominal est utilisé pour déterminer le nombre de canaux dans le patch excisé. Comme on le voit sur la figure 3, le nombre de canaux dans le patch augmente proportionnellement au temps d'incubation de la doxycycline. Après une heure d'induction, nous ne sommes pas en mesure de détecter toute activité de canal (0 sur 8). Cependant, dans les deux points dans le temps de deux ou trois heures, nous avons enregistré une activité de canal unique dans les taux de succès similaires. Il faut noter que tandis que dans les deux heures la plupart des taches ne répondent pas, en trois heures, la plupart des patchs ont montré unique à multi-activité -channel. Les chances de l'enregistrement de plusieurs canaux, après trois heures d'induction est élevé, donc le temps d'induction optimale pour enregistrer le courant d'une seule voie est de deux à trois heures dans les conditions présentées. Ensemble, ces résultats démontrent que l'expression de canaux ioniques peut être étroitement contrôlée et régulée après transfection transitoire en utilisant ce protocole.
Figure 1. Réponse des augmentations d'activation TRPV1 selon Induction Time, comme visualisés par Imagerie calcique. (A) images pseudo-couleur de T-REx-293 cellules exprimant transitoirement rTRPV1, avant ( «Basal») et après capsaïcine (2 uM) application. Les barres blanches représentent 30 um. La barre d'échelle indique les niveaux de calcium intracellulaire. (B) change avec le temps des taux de calcium intracellulaire dans transfectées T-rex-293 cellules traitées comme indiquéen A. Chaque graphique représente une moyenne de 50 cellules sensibles à la capsaïcine. Notez les pas à pas l'augmentation des réponses de la capsaïcine en fonction du temps d'induction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. TRPV1 de courant augmente en tant que résultat de l' augmentation Induction Temps cellule entière patch clamp Recordings. (A) des enregistrements de cellules entières de T-REx-293 transitoirement transfectées avec rTRPV1 à un potentiel de maintien de -40 mV. Les cellules ont été induites avec la doxycycline (1 pg / ml) pendant le temps indiqué, puis exposé à la capsaïcine ( 'Cap'; barre rouge; 1 uM). Montré est une trace représentative de 6 - 11 enregistrements indépendants. (B) Moyenne / nuage de points-point représentant l'amplitude de cellule entière évoquée comme indiqué dans A. La statistiqueal signification entre les groupes a été déterminée par analyse de variance avec des comparaisons multiples, où p représente *** ≤0.001 et NS- pas statistiquement significatives (n = 6 - 11 cellules). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Taux de réussite de Single Channel Patch en TRPV1 Recordings dépend Induction Time. (A) outside-out des enregistrements de T-REx-293 transitoirement transfectées avec rTRPV1 à un potentiel de maintien de +50 mV. Les cellules ont été induites avec de la doxycycline (1 ug / ml) pendant le temps indiqué et ont été exposés à la capsaïcine ( «cap»; barre rouge; 1 pM). Montré est une trace représentative de 6 - 9 enregistrements indépendants. (B) Moyenne / nuage de points-point représentant le nombre de canaux dans le patch excisée commemontré dans A. La signification statistique entre les groupes a été déterminée par analyse de variance avec des comparaisons multiples, où p représente *** ≤0.001 et NS- pas statistiquement significatives (n = 6 - 9 cellules). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Transfection est un protocole largement utilisé pour l'expression des protéines et de la recherche, avec de nombreuses variantes différentes pour améliorer la cohérence et la stabilité expression. réactifs de transfection transitoire offrent un moyen simple, facile à utiliser le protocole où la cellule et la protéine d'intérêt peuvent être analysés dans les heures durant la nuit à partir du moment de la transfection. Malheureusement , cette approche peut être imprévisible lorsque le mode d'analyse requiert un niveau constant de l' expression des protéines, tels que les enregistrements de canal unique en électrophysiologie 2. Alternativement, les lignées cellulaires stables dans le système d'expression répressible tétracycline ont été développés pour offrir un moyen de contrôler le niveau de la protéine d'intérêt 12 d'expression. Cette approche permet l'expression cohérente de toutes les cellules dans une culture avec l'introduction d'un supplément de tétracycline dérivés, tels que la doxycycline. Bien que cela permet un contrôle constant et précis des teneurs en protéines, tIl temps et les efforts qui vont à l'établissement d' une lignée cellulaire stable, il est peu pratique et désavantageux lors de l' étude d' une grande variété de protéines 8.
Le protocole présenté ici offre une solution moyenne-of-the-route des protocoles de transfection actuellement offerts. Par transfecter transitoirement un gène sous un promoteur contrôlable dans les cellules possédant un répresseur Tet, nous pouvons obtenir une expression contrôlable tout en évitant des procédures longues et compliquées. Ici, nous avons utilisé le TRPV1 non sélectif canal cationique avec l'imagerie de calcium et de l'analyse de l'électrophysiologie. Nous avons constaté que le temps d'induction idéale pour l'expression contrôlée de cette protéine spécifique pour l' analyse d' un seul canal est comprise entre 2 à 3 heures d' incubation avec 1 ug / ml de doxycycline (figures 1 - 3). Sur une plus grande échelle, cette technique peut également être appliquée à toute protéine d'intérêt. Ce protocole offre également une solution pour contrôler l'expression quand un large gamme de protéines différentes ou des mutations dans des séquences protéiques sont d'intérêt et en créant une lignée cellulaire stable pour chaque variante est peu pratique. Il est important, alors que les résultats représentent ici le temps optimal et concentrations d' application pour l' expression de TRPV1, chaque gène a sa personne et à la traduction et à la traite rythme spécifique, ainsi les heures d'étalonnage et d' expression de chaque protéine diffèrent grandement 13.
Bien que cette technique offre une solution pratique pour l'expression contrôlée, il ne va pas sans limitations. Seulement des lignées cellulaires commercialement disponibles hébergeant le système Tet peuvent être utilisés avec ce système, ce qui pose un problème si ces lignées cellulaires particulières ne sont pas appropriées pour le type d'analyse qui doit être réalisée. Un autre piège par rapport aux lignées transfectées de façon stable est que toutes les cellules ne subissent pas la transfection, et par conséquent toutes les cellules expriment pas la protéine d'intérêt. Dans l'ensemble, nous offrons un moyen pratique pour contrôler la protéine expression dans un système hétérologue qui peut être appliquée à un large éventail de la recherche biomédicale.
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Ce travail a été soutenu par la Fondation Israël Sciences [Subventions 1721/12, 1368/12 et 1444/16] (AP). AP est affilié à Brettler Center et David R. Bloom Centre, Faculté de Pharmacie, Université hébraïque de Jérusalem.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
NucleoSpin®plasmid | Macherey Nagel | 740588.25 | |
MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
DMEM (1x), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
ApaI | NEB | R0114S | |
CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer | Hausser Scientific | 31000 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL) | Corning | 354210 | |
Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
(E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
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