Method Article
Nous présentons un protocole pour créer journalistes neurotransmetteur fluorescents à base de cellules modifiées (CNiFERs) pour la détection optique de la libération de neurotransmetteurs volumétrique.
Reporters base de cellules fluorescentes neurotransmetteur d' ingénierie (CNiFERs) fournissent un nouvel outil pour les neuroscientifiques pour détecter optiquement la libération de neurotransmetteurs dans le cerveau in vivo. Un CNiFER spécifique est créé à partir d' une cellule de rein embryonnaire humain qui exprime de manière stable un récepteur spécifique G couplé à la protéine, qui couple à G q / 11 protéines G, et un Ca 2+ -detector à base de FRET, TN-XXL. L'activation du récepteur conduit à une augmentation du signal FRET. CNiFERs ont une sensibilité nM et une réponse temporelle de secondes parce qu'un clone CNiFER utilise le récepteur natif pour un neurotransmetteur particulier, par exemple, D2R pour la dopamine. CNiFERs sont directement implantés dans le cerveau, ce qui leur permet de détecter la libération des neurotransmetteurs avec une résolution spatiale inférieure à cent um, ce qui les rend idéales pour mesurer la transmission de volume in vivo. CNiFERs peut également être utilisé pour dépister d' autres médicaments pour la réactivité croisée potentielle dans vivo. Nous avons récemment élargi la famille de CNiFERs pour inclure GPCR ce couple à G i / o protéines G. CNiFERs sont disponibles pour la détection de l'acétylcholine (Ach), la dopamine (DA) et la norepinephrine (NE). Étant donné que toute GPCR peut être utilisé pour créer un roman CNiFER et qu'il ya environ 800 GPCR dans le génome humain, nous décrivons ici la procédure générale pour concevoir, réaliser et tester tout type de CNiFER.
Pour bien comprendre comment les neurones communiquent dans le cerveau, il est nécessaire d'avoir une méthode pour mesurer la libération de neurotransmetteurs in vivo. Il existe plusieurs techniques bien établies pour la mesure in vivo des neurotransmetteurs. Une technique couramment utilisée est microdialyse, dans laquelle une canule est insérée dans le cerveau et un faible volume de liquide céphalorachidien est recueillie et analysée par chromatographie en phase liquide à haute performance et détection électrochimique 1. Microdialyse a une résolution spatiale de l'ordre de quelques diamètres de la sonde, par exemple environ 0,5 mm pour un diamètre microsonde 200 um. La résolution temporelle de cette technique, cependant, est lente en raison des intervalles d' échantillonnage qui durent généralement environ 5 minutes ou plus 1. En outre, les analyses ne sont pas faites en temps réel. Une autre technique consiste à balayage rapide voltamétrie cyclique (FSCV), qui utilise une sonde en fibre de carbone qui est insérée dans le cerveau. FSCV a une excellente températurerésolution orale (subsecond), haute sensibilité (nanomolaire), et la résolution spatiale avec des diamètres de sonde de 5 à 30 um. Cependant, FSCV est limitée aux émetteurs qui produisent une oxydation caractéristique et le profil de réduction avec la tension sur une sonde potentiométrique de carbone 2.
Une troisième technique pour mesurer les neurotransmetteurs est directement à travers neurotransmetteurs génétiquement codés (NT) biocapteurs 3. Avec cette méthode, une protéine de fusion est créée qui contient un domaine de liaison de ligand pour un émetteur couplé à un transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) paire à base de fluorophores 4 ou 5 permuté une GFP. Contrairement aux deux procédés précédents, ces biocapteurs sont génétiquement codées et exprimées sur la surface d'une cellule hôte, telle qu'un neurone, grâce à la production d'animaux transgéniques ou aiguë avec l'utilisation d'agents viraux pour infecter des cellules. À ce jour, les biocapteurs génétiquement codés ont été seulement développé pour detecting de glutamate et de GABA 05/03. Limitations avec ces techniques ont été la faible sensibilité, dans la gamme nM, et l'incapacité à élargir la détection du grand nombre d'émetteurs, par exemple, les neurotransmetteurs classiques, neuropeptides et neuromodulateurs, qui signalent par G récepteurs couplés aux protéines (RCPG). En fait, il y a près de 800 GPCR dans le génome humain.
Pour combler ces lacunes, nous avons développé un outil innovant pour mesurer optiquement la libération de tout neurotransmetteur qui signale par un GPCR. CNiFERs (fluorescente neurotransmetteur à base de cellules rapporteurs modifiés) sont des cellules HEK293 clonales modifiées pour exprimer un GPCR spécifique qui, lorsqu'il est stimulé, provoque une augmentation intracellulaire [Ca 2+] , qui est détecté par un capteur à base de Ca 2+ FRET codé génétiquement, TN-XXL. Ainsi, CNiFERs transformer la liaison en un changement de fluorescence, en fournissant un r optique en temps réel directe et récepteur neurotransmetteuread-out de l'activité des neurotransmetteurs local. En utilisant le récepteur natif pour un neurotransmetteur donné, CNiFERs conserver la spécificité chimique, l' affinité et la dynamique temporelle des récepteurs endogènes exprimés. À ce jour, nous avons créé trois types de CNiFERs, un pour la détection de l' acétylcholine en utilisant le récepteur M1, un pour la détection de la dopamine en utilisant le récepteur D2 et une pour la détection de la norépinéphrine à l' aide du 6,7 récepteur α1a. La technologie CNiFER est facilement extensible et évolutive, ce qui rend prête à tout type de GPCR. Dans cet article JoVE, nous décrivons et illustrons la méthodologie pour concevoir, réaliser et test CNiFERs in vivo pour toute application.
Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude sont conformes à Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) des lignes directrices, et ont été approuvés par les IACUC à l'École Icahn de médecine Mount Sinai et l'Université de Californie, San Diego.
1. Générer GPCR exprimant lentivirus pour transformer des cellules HEK293
2. Choisir HEK293 / TN-XXL type Backbone cellulaire pour la culture in vitro
Note: Déterminer la protéine G spécificité de couplage, par exemple, G i / o, G q / 11, ou G protéines Gs, du GPCR, que ce dicTates si une protéine G chimère est nécessaire pour la CNiFER. Pour G q récepteurs -coupled, par exemple M1 récepteurs muscariniques, choisissez HEK293 / TN-XXL (# 3G8) comme l'épine dorsale HEK293 type de cellule. Pour G i / o -coupled récepteurs, la protéine G chimère G qi5 est nécessaire 10. Pour le récepteur -coupled de G, le G QS5 chimère est nécessaire 10. Dans ce protocole, la construction d'un D2R CNiFER est utilisé à titre d'exemple. Signaux D2R par G i / o protéines G et nécessite des cellules HEK293 qui expriment de manière stable la protéine chimère G, G qi5, par exemple, HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6.
3. Lentiviral transduction de HEK293 / TN-XXL Cellules / Gqi5
4. FACS et Isolement de simples CNiFER Clones
5. la mise en culture et l'expansion de classement, CNiFERs clonales
6. Identifier CNiFERs candidats basée sur la réponse FRET utilisant fluorométrique lecteur de plaque
Note: Avec quatre plaques à 96 puits suivant FACS, il devrait y avoir> 100 clones testables qui survivent et se dilatent à l'étape de plaque de 24 puits, puisque la plupart des clones originaux ne parviennent pas à se développer. Pour identifier CNiFERs candidats potentiels, utiliser une analyse de 3 points pour la réponse de FRET avec agoniste apparenté, par exemple, la dopamine pour D2R.
7. Sélection finale de CNiFER Clones Utilisation fluorométrique lecteur de plaque
Clones CNiFER 8. Gel-back sélectionnés
9. CNiFER Implantation dans Souris Cortex
10. imagerie in vivo de CNiFER Clones
Remarque: l'imagerie en direct est réalisée avec des souris en utilisant un microscope à deux photons et un appareil de tête fixe. Aucune anesthésie est nécessaire pendant les séances d'imagerie. Lorsque l'imagerie des animaux à l'état éveillé, limiter l'appuie-tête à seulement quelques heures à la fois pour réduire les niveaux de stress. Retour à l'animal de la maison cage entre les séances d'imagerie pour la nourriture et l'eau. le stress potentiel est réduit au minimum en assombrissant les lumières de la pièce et entourant une partie de la souris dans une enceinte.
11. Analyse des données
Un CNiFER est dérivé d'un rein embryonnaire (HEK293) cellule humaine qui est modifiée pour exprimer de façon stable au moins deux protéines: une protéine G spécifique des récepteurs couplés (GPCR) et une [Ca2 +] capteur codé génétiquement, TN-TTG. TN-XXL subit un transfert de résonance de fluorescence d'énergie (FRET) entre cyan et jaune fluorescent protéines, ECFP et Citrine, respectivement, en réponse à des ions Ca 2+ 6,15. L' activation de GPCR endogène qui couplent à des protéines G Gq déclencher une augmentation cytosolique [Ca 2+] par la voie PLC / IP 3, ce qui conduit à une augmentation du FRET 2+ détecteur TNXXL Ca (figure 1).
Figure 1:. Schéma de développement CNiFERs Top, GPCR-Ca 2+ voie de signalisation pour créer unecellule CNiFER. Bas, les étapes de base pour la construction de CNiFERs utilisant des cellules HEK293. Étape 1. transduction avec génétiquement codé sur la base FRET Ca 2+ -detector (TN-XXL). Etape 2. transduire Ga protéine G chimère, à savoir G QS5, G qi5, le cas échéant. Etape 3. transduction GPCR unique de créer CNiFER. Excitation lumineuse à deux photons (rouge) excite ECFP, qui subit FRET, produisant à la fois une émission de ECFP (cyan) et émission de Citrine (jaune). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
L'augmentation de FRET fournit une lecture optique rapide du changement dans les niveaux de neurotransmetteurs. Pour développer un CNiFER pour un type particulier de neurotransmetteur, d'abord déterminer le type de protéine G que les couples au GPCR. Pour G q -coupled GPCR, le GPCR utilise G q protéines endogènes exprimées dansles cellules HEK293. Pour G i / o -coupled GPCR, une ligne de HEK293 clonale est créée qui exprime une protéine G chimérique qui redirige le GPCR du G q -PLC / IP 3 voie. Ceci est réalisé avec une protéine G chimère, G qi5, qui contient la séquence q principalement Ga et cinq acides aminés de l'extrémité carboxy - terminale de Gi. Ces cinq acides aminés sont suffisants pour G qi5 pour communiquer avec G i / o -coupled GPCR, mais le signal par la voie G q. Pour GPCR -coupled de G, G QS5 chimère est utilisé 10. La stratégie générale pour la production d' un CNiFER consiste à: 1) créer une cellule clonale HEK293 qui expriment de façon stable un détecteur optique Ca2 +, à savoir, TN-TTG, en utilisant un lentivirus transduction des cellules HEK, 2) expriment de façon stable une protéine G chimère , si nécessaire, dans le clone de cellule HEK293 exprimant TN-TTG et 3) créer un GPCR clone exprimant de manière stable dans la cellule HEK293clone exprimant TN-XXL et la protéine G chimère. La ligne de HEK293 clonale qui manque le GPCR mais a le TN-XXL et chimère protéine G sert de «contrôle CNiFER». Le contrôle CNiFER est nécessaire pour confirmer que la réponse CNiFER est due spécifiquement à l' activation des récepteurs modifiés, c. -à- D2R et non pas à l' activation d'autres récepteurs exprimés de manière endogène dans les cellules HEK293.
Pour générer un lentivirus, d' un système d'expression de lentivirus est utilisé, par exemple pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro, qui contient les éléments génétiques responsables de l' emballage, la transduction, l' intégration stable de l'expression virale construction dans l' ADN génomique et l' expression de la cible la séquence du gène. Pour produire un titre élevé de particules virales, vecteurs d'expression et d'emballage sont transitoirement co-transfecté dans des cellules de mammifères de producteurs et le virus est collecté. Il existe plusieurs installations de base virale aux États-Unis qui peuvent générer haute ti ter lentivirus. Après l'infection des cellules HEK293, le gène de résistance à un antibiotique fournit Puro pour identifier des cellules HEK293 transduites.
Afin d'identifier les lignées clonales spécifiques transduit les cellules HEK293 sont triées en utilisant une cellule de tri activé par fluorescence du système (FACS). L'objectif est d'isoler un clone qui contient un niveau élevé d'expression à base de FRET Ca2 + détecteur et la capacité de subir FRET. Dans cet exemple, l'analyse FACS, la fluorescence de l'émission ECFP est tracée en fonction du signal de FRET (ECFP d'excitation et d'émission Citrine). Les boîtes marquent les régions (P2 et P3) qui seront sélectionnés par la suite ( "gated") pour le tri dans des plaques à 96 puits (Figure 2). En général, environ quatre plaques à 96 puits sont suffisantes pour cribler pour la création réussie de CNiFERs. A partir de ces 4 plaques, environ 100 clones sont appropriés pour fluorométrique analyse de lecteur de plaque.
e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">Une fois que les cellules triées sont cultivées à une densité suffisante, la réponse de FRET après l'activation agoniste est déterminée à l'aide d'un système de lecteur de plaque à 96 puits fluorométrique équipé d'une manipulation de la solution. Pour réduire le nombre de clones pour étudier, une courbe d'agoniste "3 points" est utilisé pour dépister ~100 clones et sélectionnez CNiFERs avec les meilleures réponses. Environ 10 clones sont ensuite analysés en outre par la détermination de la relation dose-réponse complète avec l'agoniste idoine, et les réponses non spécifiques, sondées avec 12 d'autres neurotransmetteurs ou modulateurs. Une plaque de drogue de 96 puits est préparé comme trois fois la concentration (concentration finale est diluée à 1: 3 dans la plaque) des médicaments (par exemple, des agonistes, antagonistes, etc.) ACSF. Dans cet exemple, une plaque de médicament est configuré pour tester une D2 CNiFER avec son agoniste apparenté, la dopamine et des réponses non spécifiques potentiels avec une variété d'autres agonistes des récepteurs de neurotransmetteurs et de peptides (figure 3). L'épine dorsale CNiFER, qui manque le GPCR, sert de contrôle important pour le CNiFER nouvellement créé.
Figure 3:. Des exemples de mise en page pour plaques à 96 puits Top, table de l'layout pour charger une plaque de drogue 3x pour lecteur de plaque fluorométrique, en utilisant des concentrations de trois plis de divers neurotransmetteurs et des peptides. Bottom, des exemples de plastique de 96 puits plaque de drogue claire et plaque à 96 puits noir pour l' ensemencement CNiFERs et de mesure dans le lecteur de plaque. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
On prévoit la stimulation de GPCR pour augmenter la réponse du FRET, à la suite d'une élévation de intracellulaire [Ca 2+] , et la détection par TN-TTG. Dans ces conditions, le FRET est produit par la ECFP et citrine se rapprocher, de sorte que l'excitation de la ECFP produit une émission ECFP petites et grandes Citrine émission. Dans cet exemple, l' excitation est réglée à 436 nm et de filtres d' émission sont réglés à 485 ± 7,5 nm pour ECFP et 527 ± 7,5 nm pour citrine (figure 4). Trente secondes de bafluorescence Seline est mesurée et ensuite 50 ul de la "triple" agoniste de la plaque de ACSF est livré à chaque puits contenant 100 ul ACSF (dilution 1: 3). ECFP et d'émission de fluorescence Citrine sont mesurées toutes les 3,8 secondes pour 180 sec. Les mesures de fond sont prises à partir des puits sans cellules et soustraites, si nécessaire. intensités de fluorescence sont normalisées des lignes de base de pré-stimulation (F (t) / F (référence)), et les réponses maximales sont mesurées pour calculer le ratio de FRET (AR / R) en utilisant le F (t) / F (référence) de la 527 nm et 485 nm canaux (équation 1). Une courbe dose - réponse est alors construite en traçant le rapport de FRET en fonction de différentes concentrations d'agoniste et s'adapter avec l'équation de Hill afin de déterminer les CE 50 et le coefficient de Hill (Figure 5) (équation 2). Une CNiFER optimale présente un grand rapport de FRET et une EC appropriée 50 pour l'agoniste apparenté, et présente peu ou pas de fond réponses à d' autres neurotransmitagonistes ter. En revanche, le contrôle CNiFER devrait montrer peu de réponse à l'agoniste apparenté.
Figure 4: Exemple de réponse de FRET FRET Réponse D2R CNiFER induite par l' agoniste mesurée sur un lecteur de plaque avec un système de distribution de solution.. (A) Un tracé de la réponse de FRET, soit ECFP excitation avec des émissions ECFP et Citrine, lors de l' application de la dopamine (barre rouge) à D2 CNiFERs. Notez que les diminutions d'émissions ECFP alors l'augmentation des émissions Citrine avec agoniste (dopamine). (B) Un tracé du rapport de FRET (équation 1) pour la réponse en (A) Figure modifiée de Muller et al., 2014 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Exemples de courbes de réponse de dose pour D2 CNiFER (A) Dose courbes de réponse pour une réponse de D2 CNiFERs à la dopamine (DA, noir) et pour la norépinéphrine (NE, vert). En outre, la réponse de CNiFERs «contrôle» dépourvues du D2R est représenté. (B) Le graphique à barres montre la réponse du rapport FRET pour d' autres neurotransmetteurs et des modulateurs à 50 nM et 1 uM. Les valeurs sont la moyenne ± SEM. Figure modifiée de Muller et al., 2014 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les clones CNiFER peuvent être évalués en outre possible pour la désensibilisation du récepteur-dépendants et de leur résolution temporelle, la présentation de discriminationde deux impulsions agonistes différents (pour plus de détails, voir Muller et al., 2014 7). Après avoir construit un clone CNiFER, l'étape suivante consiste à tester la fonction in vivo. Pour surveiller la fluorescence in vivo, il est nécessaire d'utiliser un microscope à deux photons. Après avoir préparé une fenêtre crâne amincie CNiFERs sont chargés dans une pipette de verre et injecté dans les couches du cortex 2/3. La souris est ensuite préparé pour l' imagerie in vivo en attachant une lamelle de verre sur le crâne amincie, et l' implantation d' une barre de tête pour la fixation de la tête lors de l' imagerie (figure 6).
Déterminer que les CNiFERs implantés sont viables in vivo, des concentrations connues d' un agoniste peut être injecté à proximité du site d'implantation et le rapport de FRET 7 déterminés. Afin de valider l'activité de CNiFERs implantés, stimulant les neurones d'entrée doit être examinée. Par exemple, avec la norme D2 CNiFER, l'effet dela stimulation électrique des neurones dopaminergiques du mésencéphale qui se projettent vers le cortex a été examiné. A bipolaire 0,1 MQ de tungstène électrode de stimulation avec une séparation de 500 um de pointe a été implanté dans la substantia nigra (-3,2 mm A / P, -1.3 mm M / L, -4.4 mm D / V). La figure 6 montre un exemple de l' électricité la stimulation de la substantia nigra à des intensités différentes et en observant une augmentation du ratio FRET pour D2 CNiFERs 7. On notera que intrapéritonéale (ip) par injection systémique d'un antagoniste des récepteurs D2, éticlopride (1 mg / kg), bloque la réponse D2 CNiFER. D'autre part, l' injection de cocaïne (15 mg / kg), qui bloque la recapture de la dopamine, améliore la réponse D2 CNiFER 7 évoqué électriquement.
Figure 6: Exemple de D2 CNiFER Réponse I ong> n vivo après stimulation électrique du locus niger. (A) Un dessin animé montre une souris de tête fixe préparé pour l'imagerie in vivo à deux photons et la stimulation électrique. la lumière à deux photons (rouge, 820 nm) pour l'excitation et 475 nm émission pour ECFP (bleu) et 530 nm émission pour Citrine (vert). (B) Le tracé de la ligne montre le ratio de FRET pour D2 CNiFER injecté dans le cortex après stimulation électrique du substantia nigra, soit 200 microsecondes impulsions de 50 à 300 uA à 50 Hz pour 500 msec, et après stimulation électrique en présence d'un D2R antagoniste (éticlopride) ou de la cocaïne. Figure modifiée de Muller et al., 2014 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Tableau 1: Liste des produits chimiques et des réactifs pour rendre un milieu de croissance et HEK293 ACSF.
Tableau 2: Les volumes pour les cellules de récolte de différentes plaques Taille de culture ou Flacons.
La création de CNiFERs offre une stratégie innovante et unique pour mesurer optiquement la libération de neurotransmetteurs dans le cerveau in vivo. CNiFERs sont parfaitement adaptés pour la mesure de libération extrasynaptique, à savoir, le volume de conduction, pour les neurotransmetteurs. Surtout, chacun CNiFER possède les propriétés du RCPG natif, fournissant une mesure optique physiologique des changements dans les niveaux de neurotransmetteurs dans le cerveau. À ce jour, CNiFERs ont été créés pour détecter l' acétylcholine (M1-CNiFER) 6, la dopamine (D2-CNiFER) 7 et de la noradrénaline (α1a-CNiFER) 7.
En principe, un CNiFER peut être créé pour tout neurotransmetteur qui signale par un GPCR. Dans le cas où les signaux de GPCR à G q protéines G, aucune modification supplémentaire est nécessaire pour la cellule HEK293. GPCR que le signal à G i / o nécessitent toutefois une co - expression d'un G qi5 chimère protéine Gpour coupler le GPCR du G q / PLC voie 7,10. De même, les GPCR qui signalent à G s , il faudra coexpression d'une chimère G QS5 protéine G 10. Une fois terminée, chaque clone CNiFER est tamisé et seuls les clones CNiFER ayant une affinité comparable au récepteur natif, présentent peu ou pas de désensibilisation et de fournir un rapport signal-bruit qui est suffisant pour mesurer avec in vivo , la microscopie biphotonique, sont sélectionnés pour des études in vivo.
Pour les études in vivo, il est fortement recommandé de traiter les souris avec de la cyclosporine pour minimiser toute réponse immunologique potentiel. Il existe une possibilité de rejet ou d'une réaction immunologique avec l'implantation de cellules humaines CNiFER dans le cerveau des rongeurs. Cela a été étudié précédemment en examinant l' expression de la GFAP et MAC1 7, suivant CNiFER implantation. CNiFERs ne semble pas produire des cicatrices gliales ou de générer toute signisigni- MAC1 coloration 7.
Deux grandes questions à prendre en compte dans la construction de CNiFERs sont la sensibilité et la désensibilisation. Si les CE 50 est trop élevée, soit une faible affinité, par rapport au récepteur natif, alors le CNiFER ne peut pas avoir une sensibilité suffisante pour détecter la libération de neurotransmetteurs in vivo. Une solution est de clones et choisissez Refaire le dépistage d'un clone CNiFER différent qui a une affinité plus élevée. Une stratégie alternative serait de tester d' autres types de codées génétiquement fluorescentes Ca 2+ objets métalliques qui peuvent avoir la sensibilité d'un Ca supérieur, qui peut décaler la CE 50 pour l' activation GPCR. Parce que la conception CNiFER est modulaire, il est facilement adapté à d' autres types de génétiquement codés Ca 2+, d' objets métalliques tels que GCaMP 16. Isoler clones CNiFER avec le même récepteur , mais différents CE 50 pourrait être avantageux pour étendre la gamme dynamique de détection de la libération de neu endogènerotransmitters in vivo.
Désensibilisation du CNiFER limite également son utilisation in vivo. Si la réponse de crête diminue progressivement à chaque impulsion de l'agoniste, le récepteur peut être désensibilisant. Dans ce cas, examiner d'autres clones et de déterminer si elles répondent de la même façon. Les modifications apportées à la séquence d'acides aminés du récepteur ou de l'utilisation d'un autre sous-type de récepteur peuvent être nécessaires pour répondre à la désensibilisation agoniste-dépendante. S'il y a des sites de phosphorylation ou des acides aminés connus identifiés qui associent G kinases des récepteurs de protéines (GRK), il serait souhaitable de construire une variante non-désensibilisation du GPCR par mutation d'un ou plusieurs sites. Le mécanisme de la désensibilisation doit être déterminée pour chaque récepteur sur une base au cas par cas.
Jusqu'à présent, CNiFERs ont été seulement implantés dans les couches superficielles du cortex 6,7, en raison de limitations spectroscopiques avec fluorophores d'imagerie à mi deux photonscroscopy 17,18. À l'avenir, il peut être possible d'adapter la technologie CNiFER avec des mesures à base de fibres de fluorescence 19 de sorte que CNiFERs peut être implanté dans des régions cérébrales sous - corticales.
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Nous remercions B. Conklin (Université de Californie, San Francisco) pour fournir les qi5 G et G QS5 cDNA, A. Schweitzer pour l' assistance à l'électronique, N. Taylor pour l' aide au dépistage des clones, Ian Glaaser et Robert Rifkin pour la relecture et Olivier Griesbeck pour TN-XXL. Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche par le biais de l'Institut national américain sur l'abus des drogues (NIDA) (DA029706; DA037170), l'Institut national d'imagerie biomédicale et Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) et le "Neuroscience liés à la drogue de subvention de formation des abus »par NIDA (DA007315).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A2661 | Flexstation |
Norepinephrine | Sigma-Aldrich | A7256 | Flexstation |
Dopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | PHR1090 | Flexstation |
GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | Flexstation |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | Flexstation |
Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | Flexstation |
Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4642 | Flexstation |
Somatostatin | Sigma-Aldrich | S1763 | Flexstation |
5HT | Sigma-Aldrich | H9523 | Flexstation |
VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
Substance P | Sigma-Aldrich | S6883 | Flexstation |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Flexstation |
Melatonin | Sigma-Aldrich | M5250C | Flexstation |
Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
Pen/Strep antibiotics | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Tissue culture |
CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
Nanoinjector | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
Glass electrodes | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma-Aldrich | surgery and stereotaxic injection | |
Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
xy translational base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
10x and 40x water immersion objectives | Olympus | in vivo imaging | |
air table | Newport | in vivo imaging | |
custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |
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