Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para aislar y cultivar células ciliadas cocleares primarias de ratones. Inicialmente, el órgano de Corti se diseccionó de cócleas murinas neonatales (de 3 a 5 días de edad) bajo un microscopio. Posteriormente, las células se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular y se identificaron mediante inmunofluorescencia después de varios días en cultivo.

Las células ciliadas cocleares son los receptores sensoriales del sistema auditivo. Estas células se encuentran en el órgano de Corti, el órgano sensorial responsable de la audición, dentro del laberinto óseo del oído interno. Las células ciliadas cocleares consisten en dos tipos anatómica y funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. El daño a cualquiera de ellos resulta en pérdida de audición. En particular, como las células ciliadas internas no pueden regenerarse y el daño a ellas es permanente. Por lo tanto, el cultivo in vitro de células ciliadas primarias es indispensable para investigar los efectos protectores o regenerativos de las células ciliadas cocleares. Este estudio tuvo como objetivo descubrir un método para aislar y cultivar células ciliadas de ratón.

Tras la extracción manual de la pared lateral coclear, el epitelio auditivo se diseccionó meticulosamente del modiolo coclear al microscopio, se incubó en una mezcla compuesta por tripsina-EDTA al 0,25 % durante 10 min a 37 °C y se suspendió suavemente en medio de cultivo con una punta de pipeta de 200 μL. La suspensión celular se pasó a través de un filtro celular, el filtrado se centrifugó y las células se cultivaron en placas de 24 pocillos. Las células ciliadas se identificaron en función de su capacidad para expresar un complejo de mecanotransducción, la miosina-VIIa, que está implicada en las tensiones motoras, y mediante el marcaje selectivo de la F-actina mediante faloidina. Las células alcanzaron >90% de confluencia después de 4 d en cultivo. Este método puede mejorar nuestra comprensión de las características biológicas de las células ciliadas cultivadas in vitro y demostrar la eficiencia de los cultivos de células ciliadas cocleares, estableciendo una base metodológica sólida para futuras investigaciones auditivas.

Las células ciliadas cocleares desempeñan un papel importante en la detección del sonido y la transmisión de señales al nervio auditivo. Las células ciliadas son células mecanicistas que funcionan como receptores sensoriales primarios y convierten las vibraciones sonoras en señales eléctricas en los vertebrados. El epitelio sensorial del oído interno de los mamíferos comprende una sola fila de células ciliadas internas y tres filas de células ciliadas externas. En diferentes áreas básicas de membrana, las células ciliadas perciben sonidos a diferentes frecuencias (entre 20 y 2.000 Hz)¹. La función de las células ciliadas externas es un proceso de amplificación mecánica activa que ayuda a afinar el oído interno de los mamíferos, confiriendo una alta sensibilidad al sonido. Las células ciliadas internas son responsables de detectar los sonidos. Después de la despolarización graduada, la información acústica se transmite al cerebro a^{través de las} fibras nerviosas auditivas.

La pérdida de audición puede ser causada por defectos genéticos, envejecimiento, traumatismos por ruido o el uso excesivo de medicamentos ototóxicos, que constituyen un importante problema de salud en todo el mundo ^3,4. La pérdida de audición se debe principalmente a un daño irreversible en las células ciliadas⁵. Con respecto a la pérdida de audición inducida por ruido, aunque los investigadores han llegado a un consenso sobre varios detalles de su etiología, se carece de una comprensión completa de los numerosos mecanismos subyacentes. Las células ciliadas externas son particularmente vulnerables a la sobreexposición acústica⁶. Las células ciliadas cocleares mecanosensibles están implicadas en la pérdida de audición relacionada con la edad; Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la degeneración de las células ciliadas siguen siendo desconocidos. Varios cambios en los procesos moleculares conducen al envejecimiento de las células ciliadas, al estrés oxidativo, a la respuesta al daño del ADN, a la autofagia y a la desregulación de la expresión y transcripción de genes relacionados con la especialización de las células ciliadas^.

Como el oído interno está encerrado en el hueso temporal, en lo profundo del hueso más duro del cuerpo, es experimentalmente inaccesible, lo que supone un reto para las investigaciones sobre los mecanismos de reparación y regeneración de las células ciliadas. Por lo tanto, el establecimiento de cultivos in vitro para investigar la función de las células ciliadas se ha convertido en un método ideal para la investigación de los mecanismos de regeneración y lesión del oído interno. Los procedimientos para la preparación de cultivos organotípicos cocleares han sido descritos en estudios previos 8,9,10. Investigadores de todo el mundo han empleado diversas técnicas de microdisección coclear y preparación de superficies. A pesar de los desafíos persistentes, se han establecido con éxito varios sistemas de cultivo primario de células ciliadas in vitro. Los cultivos de órganos cocleares contienen varios tipos de células, incluidas las células ciliadas, las células de Deiters, las células de Hensen, las células pilares y las fibras del nervio auditivo. Una comprensión profunda de los cambios en las células ciliadas a nivel celular y molecular después de una lesión permitirá el desarrollo de herramientas de investigación más poderosas. Este estudio tuvo como objetivo demostrar los pasos para aislar órganos cocleares de ratones neonatos y separar enzimáticamente las células ciliadas abundantes para estudios in vitro. La naturaleza de las células cultivadas se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados (No. 2021-847) por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Xi'an Jiaotong.

1. Esterilización y preparación del material

1. Esterilice las herramientas de disección mediante desinfección con vapor a alta temperatura y alta presión y séquelas en una incubadora a 50 °C durante la noche.
2. Preparar 100 ml del medio de cultivo que contenga un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y 10 mg/ml de penicilina/estreptomicina (añadir 10 ml de FBS y 10 μl de solución madre de penicilina a 90 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (EMEM)) con antelación y conservar a 4 °C.

2. Disección y extirpación del hueso temporal para la recogida de epitelios auditivos

1. Sacrificar un total de 10 ratones recién nacidos (con edades comprendidas entre P3 y P5) mediante decapitación en hielo. Utilice una metodología alternativa, éticamente aprobada, si es necesario.
2. Mantenga la cabeza en su lugar, abra el cuero cabelludo a lo largo de la sutura sagital con unas tijeras microquirúrgicas y separe y fije el cuero cabelludo bilateralmente con los dedos, como se muestra en la Figura 1A.
3. Extirpar el cerebro con un pequeño elevador perióstico y dividir en dos la parte basal del cráneo. Corta el cráneo con unas tijeras y voltea hacia adelante para abrir el cráneo; Usa la punta de las tijeras para raspar el cerebro y exponer la base del cráneo.
4. Observar los huesos temporales bilaterales en la base del cráneo (Figura 1C). Use tijeras para cortar la base del cráneo a lo largo de la línea media, raspe la piel y elimine cualquier hueso innecesario (Figura 1D, D').
5. Retenga y transfiera los huesos temporales a placas de Petri estériles de 35 mm que contengan solución salina balanceada de Hank (HBSS) fresca (Figura 1E).
6. Use dos pinzas de punta #5 para extraer la bulla y el tejido circundante de la porción petrosa del hueso temporal (Figura 1E).
   NOTA: En esta etapa, el laberinto óseo en el hueso temporal de los ratones no estaría completamente calcificado y se diseccionaría fácilmente con fórceps.
7. Sostenga las pinzas con una mano para fijar la parte semicircular del hueso temporal y coloque la parte inferior del pie de las pinzas en el nicho redondo de la ventana con la otra mano para separar el hueso lateral de la cóclea del vestíbulo de la escala. Retire con cuidado la porción petrosa del hueso temporal sin tocar el epitelio OC. Posteriormente, separe y retire cuidadosamente el laberinto óseo de la cóclea desde el extremo basal hasta el extremo apical (Figura 1F).
8. Microaísle cuidadosamente el órgano del epitelio sensorial de Corti del modiolo con pinzas de #5 puntas (Figura 1G).
9. Sujete el ligamento espiral, sepárelo cuidadosamente de la estría vascular con pinzas microquirúrgicas y transfiera el epitelio auditivo limpio a una placa de cultivo estéril de 3 mm que contenga HBSS utilizando una pipeta de 200 μL (Figura 1H).
10. Recoja 20 muestras de cada animal y transfiéralas rápidamente a una placa de Petri estéril de 100 mm que contenga HBSS para el siguiente paso de preparación (Figura 1).

3. Desagregación enzimática para la obtención de células ciliadas auditivas

1. Transfiera el epitelio auditivo a 10 ml de DMEM fresco que contenga tripsina al 0,25% e incube a 37 °C durante 12 min.
2. Con una punta de pipeta de 200 μL, separe suavemente las células ciliadas de la lámina basal y otras células bajo un microscopio quirúrgico.
3. Añadir otros 10 mL de medio de cultivo para inhibir la disgregación.
4. Filtrar las células suspendidas en el medio de cultivo a través de un filtro de 70 μm, recoger el filtrado en un tubo limpio de 50 ml y centrifugarlo a 300 × g durante 5 min.
5. Vuelva a suspender las células ciliadas en al menos 5 ml de medio de cultivo pipeteándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1.000 μl. Evite introducir burbujas.
6. Coloque un cubreobjetos en el fondo de una placa de seis pocillos con anticipación. Cuente las células y cultívelas a una densidad de 10^{a 6} células/ml en placas de seis pocillos.
7. Cultivar las células adherentes en 2 mL de DMEM (que contiene 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C y 5% de CO₂. Cambia el medio de cultivo todos los días.
   NOTA: Cabe mencionar que el uso de este protocolo no da como resultado la obtención de células ciliadas puras. Basándonos en este método de cultivo celular primario, recomendamos utilizar células d2 o d3 para estudios posteriores, ya que las células ciliadas pueden constituir aproximadamente el 70% de las células en cultivo y estar en buen estado.

4. Tinción inmunofluorescente

1. Coseche las células cultivadas de d1 a d6 (un pocillo por día). Aspire el medio de cultivo y enjuague las células 2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Fije las celdas con paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
3. Retire el fijador y enjuague las celdas durante 3 x 3 minutos con PBS.
4. Permeabilizar las células con PBS que contenga Triton X-100 al 0,2% durante 10 min en RT.
5. Incubar las células permeabilizadas con una solución de bloqueo que consiste en 10% de FBS en PBS durante 20 min a RT.
6. Tiñir las células con un anticuerpo monoclonal anti-miosina (diluido a 1:200 en PBS) a 4 °C durante la noche.
7. Lavar las células 3 veces con PBS estéril e incubarlas con anticuerpo secundario (Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo MYO7A, diluido 1:500 en PBS) y faloidina marcada con fluoresceína (Alexa Fluor 488, para identificar la estructura celular) durante 2 h en RT.
8. Enjuague las células 3 veces con PBS para eliminar los anticuerpos secundarios.
9. Agregue 1-2 gotas de medio de montaje con DAPI en los portaobjetos, monte los cubreobjetos y colóquelos debajo de un microscopio confocal de barrido láser para capturar fotos de las células.

5. Análisis estadístico

1. Realizar un análisis de varianza bidireccional (ANOVA) seguido de las pruebas post hoc de Tukey para analizar los cambios en los valores de gris de miosina-VIIa y faloidina a lo largo del tiempo. Utilice el método de marcado de letras para marcar las diferencias estadísticas.
2. Realice ANOVAs unidireccionales adicionales seguidas de las pruebas post-hoc de Tukey para comparar la proporción de células positivas para faloidina entre muestras celulares del día 1 al día 6 y la proporción de células positivas para miosina VII en los mismos días.

Siguiendo este protocolo, sembramos las células aisladas. Las semillas de células ciliadas cocleares primarias se consideraron exitosas si las células no flotaban en el medio de cultivo y se diseminaban dentro de las 24 h. Determinamos el número de células ciliadas después de que se adhirieron y se extendieron en agregados planos en el fondo del plato. Después de 1 día, las células ciliadas vivas se adhirieron firmemente al fondo de la placa de cultivo y las células no adherentes se eliminaron enjuagando con PBS. Típicamente, el número de células se duplicó después de 3 d de cultivo (Figura 2).

La inmunofluorescencia (FI) reveló la expresión de miosina-VIIa y faloidina hasta d6 (Figura 3A). Observamos que el valor de gris de miosina-VIIa y la proporción de células positivas disminuyeron con el tiempo, mientras que el valor de gris de faloidina y la proporción de células positivas se mantuvieron iguales en comparación con los de d1 después del cultivo (Figura 3B-D). Utilizamos un cultivo orgánico como control positivo para verificar que las células positivas para miosina VIIa eran efectivamente células ciliadas. La Figura Suplementaria S1 muestra la tinción por inmunofluorescencia de miosina-VIIa (verde), faloidina (verde) y 4′6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) en el epitelio auditivo después de 2 días de cultivo.

Usando IF, confirmamos que las células obtenidas eran células ciliadas. En particular, observamos que la mayoría de las células cultivadas mostraron una tinción positiva para la proteína miosina-VIIa (roja), marcador de células auditivas, que también exhibió una apariencia alargada bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 3A). Estos resultados sugirieron que las células cultivadas eran principalmente células ciliadas.

Figura 1: Disección y extracción del hueso temporal para la recolección de epitelios auditivos. (A) Decapitar y abrir el cráneo a lo largo de la sutura sagital; (B) extirpar el cerebro. (C) Vista de los huesos temporales bilaterales ubicados en la base del cráneo. Los huesos temporales derechos (D) después de extirpar los huesos y las tisuras que rodean el hueso temporal (D') marcados con OC y PSD. (E) Transfiera los huesos temporales a la solución salina balanceada de Hank fresca (HBSS), retire el estribo y colóquelo con la ventana ovalada hacia arriba. (F) Separe y retire con cuidado el laberinto óseo de la cóclea desde el extremo basal hasta el apical. El órgano del epitelio sensitivo de Corti (G) se adhirió a la estría vascular, (H) se separó de la estría vascular. Barras de escala = 1.000 μm (C-H). Abreviaturas: OC = órgano de Corti; PSD = canal semicircular posterior; SV = estría vascular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Células ciliadas 4 días después del cultivo. Examen microscópico óptico 4 días después del cultivo. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Detección de marcadores de superficie de células ciliadas mediante inmunofluorescencia. (A) Tinción de inmunofluorescencia de miosina-VIIa (rojo), faloidina (verde) y DAPI (azul) desde el día 1 hasta el día 6 después del cultivo celular. (B, C) Análisis del valor gris de la miosina-VIIa y la faloidina; Las diferencias estadísticas se indican con letras. (D) Comparación de la proporción de células positivas para faloidina entre muestras celulares del día 1 al día 6 y miosina-VII en los mismos días. Las letras mayúsculas representan los resultados estadísticos de la faloidina, mientras que las letras minúsculas representan los resultados estadísticos de la miosina-VIIa. Los datos se presentan como la media ± el error estándar de la media. N = 5; Barra de escala = 50 μm. Se realizó un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey para el análisis del valor de gris de la miosina-VIIa y la faloidina. Se realizó un ANOVA de un factor para comparar la proporción de células positivas para faloidina y miosina VII entre muestras celulares de d 1 a d 6. Las letras diferentes indican diferencias estadísticas en la tinción de faloidina, mientras que las letras minúsculas indican diferencias estadísticas en la tinción de miosina-VIIa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Detección por inmunofluorescencia de marcadores de superficie de células ciliadas en cultivo orgánico. La tinción por inmunofluorescencia de miosina-VIIa (verde), faloidina (verde) y DAPI (azul) se realizó en d 2 de cultivo orgánico. Barra de escala = 10 μm. Abreviaturas: IHC, célula ciliada interna; OHC: célula ciliada externa; DAPI, 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Detección por inmunofluorescencia de marcadores de superficie en células ciliadas transitadas. (A) La tinción por inmunofluorescencia de miosina-VIIa (rojo), faloidina (verde) y DAPI (azul) se realizó en cultivos orgánicos en los pasajes 2 y 3. (B) Comparación del número de células positivas para faloidina, células positivas para miosina VIIa y células totales desde las células primarias hasta el pasaje 3. N = 3; barra de escala = 100 μm. Los datos se muestran como la media ± la desviación estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

En comparación con la línea celular HEI-OC1, los cultivos primarios de células ciliadas replicaron con mayor precisión el estado fisiológico de las células in vivo. Por lo tanto, el método de cultivo primario auditivo establecido mediante el aislamiento de células vivas de los órganos cocleares y su cultivo inmediato parece ser una herramienta valiosa para la investigación exhaustiva de los sistemas auditivos. Ciertas técnicas son cruciales para una cultura exitosa. En primer lugar, minimizar la duración de la separación del órgano de Corti del hueso temporal aumenta la probabilidad de una actividad sostenida de las células ciliadas. En consecuencia, es imperativo que los investigadores minimicen el intervalo de tiempo entre la disección y la inmersión de los órganos en PBS. Basándonos en nuestras observaciones experimentales, una duración de aproximadamente 2-3 h es suficiente para diseccionar 10 ratones y obtener los 20 oídos internos a la vez. Durante el proceso de desagregación enzimática, es aconsejable restringir la duración a 12 min y transferir los órganos cocleares a pipetas después de un período de incubación de 8 min. Los órganos se observaron bajo un microscopio después de aproximadamente 10 ciclos de pipeteo, y la disgregación enzimática se detuvo cuando casi todas las células se habían desprendido de la membrana basilar. De lo contrario, los órganos se devolvieron a la incubadora durante otros 4 minutos. La elección del antibiótico también es importante. Recomendamos usar 10 mg/ml de penicilina/estreptomicina para prevenir posibles problemas de contaminación, ya que algunos antibióticos aminoglucósidos pueden ser ototóxicos y provocar la muerte de las células ciliadas.

Aunque las miosinas de clase VII se expresan ampliamente en tejidos animales, la miosina-VIIa solo se expresa en las células ciliadas de los órganos vestibulares y cocleares del oído interno. Las miosinas de clase VIIa juegan un papel importante en el mantenimiento de la estructura de los estereocilios, ya que ayudan a interconectar los estereocilios en la región de enlace del tobillo en las células ciliadas¹¹. Tras un aumento en la duración del cultivo celular primario y en el número de pasajes celulares, la degradación de la miosina-VIIa también aumentó con el tiempo, mientras que la faloidina se mantuvo estable, lo que indica que la función de las células auditivas disminuyó con el tiempo. La principal limitación de este protocolo es que las células auditivas solo se pueden utilizar en un plazo de 6-7 días y tardan más en crecer que las células HEI-OC1¹². Además, es inevitable que las células primarias eventualmente senescan y mueran, exhibiendo un potencial de crecimiento limitado. Además, el tiempo y los costes económicos del aislamiento y el cultivo de las células ciliadas suelen ser elevados y requieren una amplia experiencia. El órgano de Corti contiene una variedad de células neurosensoriales, incluyendo el cabello interno, el cabello externo y las células de soporte. Este protocolo introdujo un método para separar y cultivar estas células in vitro. Las células primarias se pueden distinguir entre el cabello y las células de soporte mediante tinción para miosina-VIIa y Sox2, respectivamente^13,14. Las células ciliadas externas e internas realizan diferentes funciones. Las células ciliadas externas alteran rápidamente su longitud y rigidez en respuesta a los cambios en el potencial de membrana y se transducen en células ciliadas internas. La prestina es una proteína motora de las células ciliadas externas, mientras que la Slc17a8 (vGlut3) se expresa específicamente en las IHC y puede utilizarse para distinguir las células ciliadas internas in vitro^15,16,17,18.

En comparación con los cultivos orgánicos, la morfología de las células ciliadas cambia significativamente en los cultivos primarios de células ciliadas, lo que da lugar a diferentes morfologías y funciones de mecanotransducción. Los cultivos orgánicos son cultivos celulares primarios tridimensionales que exhiben patrones celulares estereotipados, polaridad, formación de haces de cabello y conexiones neuronales dentro de los órganos de Corti. Por el contrario, las células primarias HEI-OC1 tienen una forma poligonal típica y crecen planas a través de la adherencia estática en un entorno de cultivo bidimensional¹⁹. Los cultivos orgánicos y las células primarias se aíslan directamente de los tejidos y exhiben una morfología celular normal e importantes marcadores relacionados con la función. Sin embargo, a diferencia de las células HEI-OC1, que generalmente son altamente proliferativas, más fáciles de cultivar y transfectar, y pueden mantenerse durante décadas, estas células tienen una vida útil finita y una capacidad de expansión limitada.

Las células primarias tienen muchas ventajas en el cultivo celular. Como las células primarias se obtienen de tejidos corporales y se cultivan en condiciones óptimas de crecimiento, imitan de cerca el entorno de los tejidos in vivo . El uso de células primarias evita muchas objeciones éticas planteadas sobre la experimentación animal y proporciona resultados más relevantes que las líneas celulares. Las células primarias preseleccionadas son modelos adecuados que representan fielmente la señalización molecular in vivo. Las células de diferentes donantes responden de manera diferente a las citocinas proinflamatorias. Los costos del aislamiento y el cultivo suelen ser altos, aunque son menos costosos que los de los modelos animales. Los materiales y animales utilizados en el cultivo primario de células ciliadas descrito aquí eran simples, su costo era relativamente bajo y el sistema era fácil de operar. Si no se mantienen las condiciones óptimas de cultivo, las características de las células primarias pueden cambiar con los siguientes pases. A medida que aumentaba el número de pasajes, el estado de la célula también se debilitaba (Figura suplementaria S2). Como se derivaron directamente de tejidos corporales nativos sin modificaciones, las células ciliadas auditivas obtenidas imitaron de cerca su estado y fisiología in vivo. Por lo tanto, las células ciliadas primarias proporcionan un excelente sistema modelo para estudiar la fisiología y la bioquímica de las células ciliadas, incluido el metabolismo celular y la toxicidad de los fármacos. Aunque las células primarias solo se pueden mantener durante unos días in vitro, pueden ser inmortalizadas y divididas indefinidamente después de la transformación genética para obtener líneas celulares secundarias.

En conclusión, el protocolo actual describe el aislamiento de células ciliadas auditivas del hueso temporal mediante microdisección y disgregación enzimática. El protocolo completo duró aproximadamente 3 h, desde la disección del ratón hasta la siembra de las células. Las células cultivadas se mantuvieron a alta pureza y se mantuvieron sanas durante 6-7 días. A pesar de las limitaciones inherentes de los cultivos primarios de células ciliadas, que se limitan a solo dos pasajes, este protocolo empleó metodologías y materiales sencillos, lo que presenta una nueva vía para llevar a cabo investigaciones altamente eficientes sobre las células ciliadas cocleares.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NFSC 82101224 a YG)