عزل وزراعة خلايا شعر القوقعة الأولية من الفئران حديثي الولادة

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة خلايا شعيرات القوقعة الأولية من الفئران. في البداية ، تم تشريح عضو كورتي من قوقعة الفئران حديثي الولادة (الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أيام) تحت المجهر. بعد ذلك ، تم هضم الخلايا إنزيميا في تعليق خلية واحدة وتحديدها باستخدام التألق المناعي بعد عدة أيام في الثقافة.

خلايا شعر القوقعة هي المستقبلات الحسية للنظام السمعي. تقع هذه الخلايا في عضو كورتي ، العضو الحسي المسؤول عن السمع ، داخل المتاهة العظمية للأذن الداخلية. تتكون خلايا شعيرات القوقعة من نوعين متميزين تشريحيا ووظيفيا: خلايا الشعر الخارجية والداخلية. الأضرار التي لحقت أي منهما يؤدي إلى فقدان السمع. والجدير بالذكر أن خلايا الشعر الداخلية لا يمكن أن تتجدد ، والضرر الذي يلحق بها دائم. ومن ثم، فإن زراعة خلايا الشعر الأولية في المختبر أمر لا غنى عنه للتحقيق في الآثار الوقائية أو التجديدية لخلايا الشعر القوقعي. هدفت هذه الدراسة إلى اكتشاف طريقة لعزل وزراعة خلايا شعر الفأر.

بعد الإزالة اليدوية للجدار الجانبي للقوقعة ، تم تشريح الظهارة السمعية بدقة من القوقعة تحت المجهر ، وتم تحضينها في خليط يتكون من 0.25٪ trypsin-EDTA لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وتم تعليقها برفق في وسط الاستزراع باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر. تم تمرير تعليق الخلية من خلال مرشح الخلية ، وتم طرد المرشح بالطرد المركزي ، وتم استزراع الخلايا في 24 لوحة بئر. تم تحديد خلايا الشعر بناء على قدرتها على التعبير عن مركب النقل الميكانيكي ، الميوسين-VIIa ، الذي يشارك في التوترات الحركية ، وعن طريق وضع العلامات الانتقائية على F-actin باستخدام phalloidin. وصلت الخلايا إلى التقاء >90٪ بعد 4 د في الثقافة. يمكن لهذه الطريقة أن تعزز فهمنا للخصائص البيولوجية لخلايا الشعر المستزرعة في المختبر وتوضح كفاءة مزارع خلايا الشعر القوقعة ، مما يضع أساسا منهجيا متينا لمزيد من البحث السمعي.

تلعب خلايا شعيرات القوقعة أدوارا مهمة في اكتشاف الصوت ونقل الإشارات إلى العصب السمعي. خلايا الشعر هي خلايا ميكانيكية تعمل كمستقبلات حسية أولية وتحول الاهتزازات الصوتية إلى إشارات كهربائية في الفقاريات. تتكون الظهارة الحسية للأذن الداخلية للثدييات من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية وثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجية. في مناطق الغشاء الأساسية المختلفة ، تدرك خلايا الشعر الأصوات بترددات مختلفة (بين 20 و 2000 هرتز)¹. وظيفة خلايا الشعر الخارجية هي عملية تضخيم ميكانيكية نشطة تساعد على ضبط الأذن الداخلية للثدييات ، مما يمنح حساسية عالية للصوت. خلايا الشعر الداخلية هي المسؤولة عن اكتشاف الأصوات. بعد إزالة الاستقطاب المتدرج ، تنتقل المعلومات الصوتية إلى الدماغ من خلال الألياف العصبية السمعية².

قد يحدث فقدان السمع بسبب العيوب الوراثية أو الشيخوخة أو صدمة الضوضاء أو الاستخدام المفرط للأدوية السامة للأذن ، والتي تشكل مصدر قلق صحي كبير في جميع أنحاء العالم ^3,4. ينتج فقدان السمع بشكل رئيسي عن تلف لا رجعة فيه لخلايا الشعر⁵. فيما يتعلق بفقدان السمع الناجم عن الضوضاء ، على الرغم من توصل الباحثين إلى توافق في الآراء حول العديد من تفاصيل مسبباته ، إلا أنه لا يوجد فهم شامل للعديد من الآليات الأساسية. خلايا الشعر الخارجية معرضة بشكل خاص للتعرض المفرط السمعي⁶. تشارك خلايا شعر القوقعة الحساسة ميكانيكيا في فقدان السمع المرتبط بالعمر. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تنكس خلايا الشعر لا تزال غير معروفة. تؤدي العديد من التغييرات في العمليات الجزيئية إلى شيخوخة خلايا الشعر ، والإجهاد التأكسدي ، واستجابة تلف الحمض النووي ، والالتهام الذاتي ، وعدم تنظيم التعبير عن الجينات المتعلقة بتخصص خلايا الشعر^{ونسخها 7}.

نظرا لأن الأذن الداخلية مغلفة بالعظم الصدغي ، في عمق أصعب عظام الجسم ، فلا يمكن الوصول إليها تجريبيا ، مما يشكل تحديا للتحقيقات في آليات إصلاح خلايا الشعر وتجديدها. ومن ثم ، أصبح إنشاء مزارع في المختبر للتحقيق في وظيفة خلايا الشعر طريقة مثالية للبحث في آليات التجديد والإصابة في الأذن الداخلية. تم وصف إجراءات تحضير مزارع النمط العضوي للقوقعة في الدراسات السابقة^8،9،10. استخدم الباحثون في جميع أنحاء العالم تقنيات مختلفة لتشريح القوقعة الصناعية وإعداد السطح. على الرغم من التحديات المستمرة ، تم إنشاء العديد من أنظمة زراعة خلايا الشعر الأولية بنجاح في المختبر. تحتوي مزارع أعضاء القوقعة الصناعية على أنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك خلايا الشعر، وخلايا ديتر، وخلايا هينسن، وخلايا الأعمدة، والألياف العصبية السمعية. إن الفهم المتعمق للتغيرات في خلايا الشعر على المستويين الخلوي والجزيئي بعد الإصابة سيمكن من تطوير أدوات بحث أكثر قوة. هدفت هذه الدراسة إلى توضيح خطوات عزل أعضاء القوقعة من الفئران الوليدية وفصل خلايا الشعر الوفيرة إنزيميا للدراسات في المختبر. تم تأكيد طبيعة الخلايا المستزرعة باستخدام تلطيخ المناعي.

تمت الموافقة على جميع التجارب على (رقم 2021-847) من قبل لجنة جامعة شيان جياوتونغ لاستخدام ورعايتها.

1. التعقيم وإعداد المواد

1. تعقيم أدوات التشريح باستخدام التطهير بالبخار بدرجة حرارة عالية وضغط عال وتجفيفها في حاضنة 50 درجة مئوية طوال الليل.
2. تحضير 100 مل من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10 ملغ / مل من البنسلين / الستربتومايسين (أضف 10 مل من FBS و 10 ميكرولتر من محلول مخزون البنسلين إلى 90 مل من وسط النسر المعدل (EMEM) من Dulbecco) مسبقا وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. تشريح وإزالة العظم الصدغي لجمع الظهارة السمعية

1. القتل الرحيم لما مجموعه 10 فئران حديثي الولادة (تتراوح أعمارهم بين P3 و P5) عن طريق قطع الرأس على الجليد. استخدم منهجية بديلة معتمدة أخلاقيا ، إذا لزم الأمر.
2. ثبت الرأس في مكانه ، وافتح فروة الرأس على طول الخيط السهمي باستخدام مقص التشغيل الدقيق ، وافصل فروة الرأس وثبتها بشكل ثنائي بالأصابع ، كما هو موضح في الشكل 1 أ.
3. قم بإزالة الدماغ باستخدام مصعد صغير السمحاق وقسم الجمجمة القاعدية. قطع الجمجمة بالمقص والوجه للأمام لفتح الجمجمة. استخدم طرف المقص لكشط الدماغ وفضح قاعدة الجمجمة.
4. راقب العظام الصدغية الثنائية في قاعدة الجمجمة (الشكل 1C). استخدم المقص لقطع قاعدة الجمجمة على طول خط الوسط ، وكشط الجلد ، وإزالة أي عظم غير ضروري (الشكل 1D ، D ').
5. احتفظ بالعظام الصدغية وانقلها إلى أطباق بتري معقمة مقاس 35 مم تحتوي على محلول ملح هانك المتوازن الطازج (HBSS) (الشكل 1E).
6. استخدم ملقطين #5 مدببين لإزالة الفقاعة والأنسجة المحيطة بها من الجزء الصخري من العظم الصدغي (الشكل 1E).
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، لن تكون المتاهة العظمية في العظم الصدغي للفئران متكلسة تماما ويمكن تشريحها بسهولة باستخدام الملقط.
7. أمسك الملقط بيد واحدة لإصلاح الجزء نصف الدائري من العظم الصدغي وألصق القدم السفلية للملقط في مكان النافذة المستديرة باليد الأخرى لفصل العظم الجانبي للقوقعة عن دهليز سكالا. قم بإزالة الجزء الصخري من العظم الصدغي بعناية دون لمس ظهارة OC. بعد ذلك ، افصل بعناية وأزل المتاهة العظمية للقوقعة من النهاية القاعدية إلى النهاية القمية (الشكل 1F).
8. قم بعزل عضو ظهارة كورتي الحسية بعناية من modiolus باستخدام ملقط # 5 مدبب (الشكل 1G).
9. أمسك الرباط الحلزوني ، وافصله بعناية عن الأوعية الدموية السطورية باستخدام ملقط التشغيل الجزئي ، وانقل الظهارة السمعية النظيفة إلى طبق ثقافة معقم 3 مم يحتوي على HBSS باستخدام ماصة 200 ميكرولتر (الشكل 1H).
10. اجمع 20 عينة من كل وانقلها بسرعة إلى طبق بتري معقم 100 مم يحتوي على HBSS لخطوة التحضير التالية (الشكل 1).

3. التصنيف الأنزيمي للحصول على خلايا الشعر السمعية

1. نقل ظهارة السمع إلى 10 مل من DMEM الطازجة التي تحتوي على 0.25٪ التربسين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.
2. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، افصل خلايا الشعر برفق عن الصفيحة القاعدية والخلايا الأخرى تحت مجهر التشغيل.
3. أضف 10 مل أخرى من وسط الاستزراع لمنع التصنيف.
4. قم بتصفية الخلايا العالقة في وسط الاستزراع من خلال مرشح 70 ميكرومتر ، وجمع المرشح في أنبوب نظيف سعة 50 مل ، وطرده مركزيا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
5. أعد تعليق خلايا الشعر في 5 مل على الأقل من وسط المزرعة عن طريق سحبها برفق لأعلى ولأسفل باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر. تجنب إدخال الفقاعات.
6. ضع غطاء في الجزء السفلي من لوحة ستة آبار مقدما. عد الخلايا واستزراعها بكثافة 10⁶ خلايا / مل في ألواح من ستة آبار.
7. تنمو الخلايا الملتصقة في 2 مل من DMEM (تحتوي على 10٪ من FBS ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. تغيير وسط الثقافة كل يوم.
   ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن استخدام هذا البروتوكول لا يؤدي إلى الحصول على خلايا الشعر النقية. بناء على طريقة زراعة الخلايا الأولية هذه ، نوصي باستخدام خلايا d2 أو d3 لمزيد من الدراسات ، حيث قد تشكل خلايا الشعر حوالي 70٪ من الخلايا في المزرعة وتكون في حالة جيدة.

4. تلطيخ المناعي

1. حصاد الخلايا المستزرعة من d1 إلى d6 (بئر واحد في اليوم). نضح وسط الثقافة وشطف الخلايا 2x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
2. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
3. قم بإزالة الخلايا المثبتة وشطف لمدة 3 × 3 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني.
4. تتخلل الخلايا مع PBS التي تحتوي على 0.2٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق في RT.
5. احتضان الخلايا المتداخلة بمحلول مانع يتكون من 10٪ FBS في PBS لمدة 20 دقيقة في RT.
6. قم بتلطيخ الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للميوسين (مخفف عند 1: 200 في PBS) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
7. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS المعقم واحتضانها بجسم مضاد ثانوي (Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للأرانب MYO7A ، المخفف 1: 500 في PBS) والفولويدين المسمى بالفلوريسئين (Alexa Fluor 488 ، لتحديد بنية الخلية) لمدة 2 ساعة في RT.
8. شطف الخلايا 3x مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الثانوية.
9. أضف 1-2 قطرات من وسيط التركيب باستخدام DAPI على الشرائح ، وقم بتركيب قسائم الغطاء ، وضعها تحت مجهر المسح بالليزر متحد البؤر لالتقاط صور للخلايا.

5. التحليل الإحصائي

1. قم بإجراء تحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) متبوعا باختبارات Tukey اللاحقة لتحليل التغيرات في القيم الرمادية للميوسين-VIIa و phalloidin بمرور الوقت. استخدم طريقة تعليم الحروف لتمييز الفروق الإحصائية.
2. قم بإجراء ANOVAs إضافية أحادية الاتجاه متبوعة باختبارات Tukey اللاحقة لمقارنة نسبة الخلايا الإيجابية للفالويدين بين عينات الخلايا من اليوم 1 إلى اليوم 6 ونسبة الخلايا الإيجابية للميوسين السابع في نفس الأيام.

باتباع هذا البروتوكول ، قمنا بزرع الخلايا المعزولة. اعتبرت بذور خلايا شعر القوقعة الأولية ناجحة إذا لم تطفو الخلايا في وسط الاستزراع وانتشرت في غضون 24 ساعة. حددنا عدد خلايا الشعر بعد التصاقها وانتشارها إلى مجاميع مسطحة في قاع الطبق. بعد 1 يوم ، تم التصاق خلايا الشعر الحية بإحكام في الجزء السفلي من طبق الثقافة وتمت إزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق الشطف مع برنامج تلفزيوني. عادة ، تضاعف عدد الخلايا بعد 3 d من الثقافة (الشكل 2).

كشف التألق المناعي (IF) عن تعبير الميوسين-VIIa والقضيب حتى d6 (الشكل 3A). لاحظنا أن القيمة الرمادية للميوسين-VIIa ونسبة الخلايا الإيجابية انخفضت مع مرور الوقت ، في حين ظلت قيمة phalloidin الرمادية ونسبة الخلايا الإيجابية كما هي مقارنة بتلك الموجودة في d1 بعد المزرعة (الشكل 3B-D). استخدمنا مزرعة عضوية كعنصر تحكم موجب للتحقق من أن الخلايا الإيجابية للميوسين-VIIa هي بالفعل خلايا شعرية. يوضح الشكل التكميلي S1 تلطيخ التألق المناعي للميوسين-VIIa (أخضر) ، و phalloidin (أخضر) ، و 4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، أزرق) في الظهارة السمعية بعد يومين من الثقافة.

باستخدام IF ، أكدنا أن الخلايا التي تم الحصول عليها كانت خلايا شعرية. على وجه الخصوص ، لاحظنا أن معظم الخلايا المستزرعة أظهرت تلطيخا إيجابيا لبروتين علامة الخلية السمعية myosin-VIIa (الأحمر) ، كما أظهرت مظهرا ممدودا تحت مجهر مضان (الشكل 3 أ). تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا المستزرعة كانت في الأساس خلايا شعرية.

الشكل 1: تشريح العظم الصدغي وإزالته لجمع النقوش السمعية. (أ) قطع الرأس وفتح الجمجمة على طول الدرز السهمي؛ ب: إزالة الدماغ. ج: منظر للعظام الصدغية الثنائية الموجودة في قاعدة الجمجمة. العظام الصدغية اليمنى (D) بعد إزالة العظام والشقوق المحيطة بالعظم الصدغي (D') المميزة ب OC و PSD. (ه) نقل العظام الصدغية إلى محلول ملح هانك المتوازن الطازج (HBSS) ، وإزالة الركابي ووضعه مع جانب النافذة البيضاوي لأعلى. (و) افصل بعناية المتاهة العظمية للقوقعة وأزلها من القاعدية إلى النهاية القمية. تمسك عضو ظهارة كورتي الحسية (G) بالسطور الوعائية ، (H) مفصولة عن السطور الوعائية. قضبان المقياس = 1000 ميكرومتر (C-H). الاختصارات: OC = جهاز كورتي. PSD = قناة نصف دائرية خلفية ؛ SV = السطور الوعائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: خلايا الشعر بعد 4 أيام من الزراعة. الفحص المجهري الخفيف بعد 4 أيام من الزراعة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: الكشف عن علامات سطح خلايا الشعر باستخدام التألق المناعي . (أ) تلطيخ الميوسين-VIIa (أحمر) وفالويدين (أخضر) ودابي (أزرق) من اليوم 1 إلى اليوم 6 بعد زراعة الخلايا. (ب، ج) تحليل القيمة الرمادية للميوسين-VIIa والقضيب. يشار إلى الاختلافات الإحصائية بالحروف. د: مقارنة نسبة الخلايا الموجبة للفالويدين بين عينات الخلايا من اليوم 1 إلى اليوم 6، والميوسين-السابع في الأيام نفسها. تمثل الأحرف الكبيرة النتائج الإحصائية للفالويدين ، بينما تمثل الأحرف الصغيرة النتائج الإحصائية للميوسين-VIIa. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. ن = 5 ؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. تم إجراء تحليل ثنائي الاتجاه للتباين (ANOVA) متبوعا باختبار توكي اللاحق لتحليل القيمة الرمادية للميوسين-VIIa و phalloidin. تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة نسبة الخلايا الإيجابية phalloidin و myosin-VII بين عينات الخلايا من d 1 إلى d 6. تشير الحروف المختلفة إلى الاختلافات الإحصائية في تلطيخ القضيب ، بينما تشير الأحرف الصغيرة إلى الاختلافات الإحصائية في تلطيخ الميوسين-VIIa. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: الكشف المناعي عن علامات سطح خلايا الشعر في الثقافة العضوية. تم إجراء تلطيخ التألق المناعي للميوسين-VIIa (الأخضر) ، phalloidin (الأخضر) ، و DAPI (الأزرق) على d 2 من الثقافة العضوية. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: IHC ، خلية الشعر الداخلية. OHC ، خلية الشعر الخارجية. دابي ، 4 ′ ، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: الكشف المناعي عن علامات السطح في خلايا الشعر المارة. (أ) تم إجراء تلطيخ التألق المناعي للميوسين-VIIa (الأحمر) والقضيب (الأخضر) و DAPI (الأزرق) على المزارع العضوية في المقطعين 2 و 3. ب: المقارنة بين عدد الخلايا الموجبة للفالويدين، والخلايا الموجبة للميوسين-VIIa، والخلايا الكلية من الخلايا الأولية إلى الممر 3. ن = 3 ؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. يتم عرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

بالمقارنة مع خط خلايا HEI-OC1 ، فإن الثقافات الأولية لخلايا الشعر تكرر بدقة أكبر الحالة الفسيولوجية للخلايا في الجسم الحي. لذلك ، يبدو أن طريقة الزراعة الأولية السمعية التي تم إنشاؤها عن طريق عزل الخلايا الحية عن أعضاء القوقعة وزراعتها على الفور هي أداة قيمة لإجراء أبحاث مكثفة حول الأنظمة السمعية. بعض التقنيات ضرورية لثقافة ناجحة. أولا ، يقلل تقليل مدة فصل عضو كورتي عن العظم الصدغي إلى زيادة احتمال استمرار نشاط خلايا الشعر. وبالتالي ، لا بد للباحثين من تقليل الفاصل الزمني بين تشريح وغمر الأعضاء في برنامج تلفزيوني. بناء على ملاحظاتنا التجريبية ، تكفي مدة حوالي 2-3 ساعات لتشريح 10 فئران والحصول على 20 أذنا داخلية في المرة الواحدة. أثناء عملية التفكيك الأنزيمي ، ينصح بتقييد المدة إلى 12 دقيقة ونقل أعضاء القوقعة إلى الماصات بعد فترة حضانة مدتها 8 دقائق. تمت ملاحظة الأعضاء تحت المجهر بعد حوالي 10 دورات ماصة ، وتم إيقاف التفكك الأنزيمي عندما انفصلت جميع الخلايا تقريبا عن الغشاء القاعدي. خلاف ذلك ، تم إرجاع الأعضاء إلى الحاضنة لمدة 4 دقائق أخرى. اختيار المضادات الحيوية مهم أيضا. نوصي باستخدام 10 ملغ / مل من البنسلين / الستربتومايسين لمنع مشاكل التلوث المحتملة لأن بعض المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد يمكن أن تكون سامة للأذن وتؤدي إلى موت خلايا الشعر.

على الرغم من أن الميوسين من الفئة السابعة يتم التعبير عنه على نطاق واسع في الأنسجة الحيوانية ، إلا أن الميوسين-VIIa يتم التعبير عنه فقط فيخلايا الشعر في الأعضاء الدهليزية والقوقعة في الأذن الداخلية وحدها. تلعب الميوسينات من الفئة السابعة دورا مهما في الحفاظ على بنية الأهداب المجسمة ، لأنها تساعد على ربط الأهداب المجسمة في منطقة ربط الكاحل في خلايا الشعر¹¹. بعد زيادة مدة زراعة الخلايا الأولية وعدد الممرات الخلوية ، زاد تدهور الميوسين-VIIa أيضا بمرور الوقت ، بينما ظل القضيب مستقرا ، مما يشير إلى أن وظيفة الخلايا السمعية انخفضت بمرور الوقت. القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو أنه لا يمكن استخدام الخلايا السمعية إلا في غضون 6-7 أيام وتستغرق وقتا أطول للنمو من خلايا HEI-OC1¹². علاوة على ذلك ، من المحتم أن تشيخ الخلايا الأولية وتموت في النهاية ، مما يظهر إمكانات نمو محدودة. علاوة على ذلك ، غالبا ما يكون الوقت والتكاليف الاقتصادية لعزل خلايا الشعر وزراعتها مرتفعة وتتطلب خبرة واسعة. يحتوي عضو كورتي على مجموعة متنوعة من الخلايا الحسية العصبية ، بما في ذلك الشعر الداخلي والشعر الخارجي والخلايا الداعمة. قدم هذا البروتوكول طريقة لفصل وزراعة هذه الخلايا في المختبر. يمكن تمييز الخلايا الأولية بين الشعر والخلايا الداعمة عن طريق تلطيخ الميوسين-VIIa و Sox2 ، على التوالي^13,14. تؤدي خلايا الشعر الخارجية والداخلية وظائف مختلفة. تغير خلايا الشعيرات الخارجية طولها وصلابتها بسرعة استجابة للتغيرات في جهد الغشاء وتتحول إلى خلايا شعرية داخلية. Prestin هو بروتين حركي لخلايا الشعر الخارجية ، في حين يتم التعبير عن Slc17a8 (vGlut3) على وجه التحديد في IHCs ويمكن استخدامه لتمييز خلايا الشعر الداخلية في المختبر¹⁵،¹⁶،^17،18.

بالمقارنة مع الثقافات العضوية ، يتغير مورفولوجيا خلايا الشعر بشكل كبير في مزارع خلايا الشعر الأولية ، مما يؤدي إلى أشكال مختلفة ووظائف نقل ميكانيكي. الثقافات العضوية هي مزارع الخلايا الأولية ثلاثية الأبعاد التي تظهر الأنماط الخلوية النمطية ، والقطبية ، وتشكيل حزمة الشعر ، والوصلات العصبية داخل أعضاء كورتي. في المقابل ، فإن خلايا HEI-OC1 الأولية لها شكل متعدد الأضلاع نموذجي وتنمو بشكل مسطح من خلال الالتزام الثابت في بيئة ثقافة ثنائية الأبعاد¹⁹. يتم عزل الثقافات العضوية والخلايا الأولية مباشرة عن الأنسجة وتظهر مورفولوجيا الخلايا الطبيعية والعلامات المهمة المتعلقة بالوظيفة. ومع ذلك ، على عكس خلايا HEI-OC1 ، التي تكون بشكل عام تكاثرية للغاية ، وأسهل في الزراعة والنقل ، ويمكن الحفاظ عليها لعقود ، فإن هذه الخلايا لها عمر محدود وقدرة توسع محدودة.

تتمتع الخلايا الأولية بالعديد من المزايا في زراعة الخلايا. نظرا لأنه يتم الحصول على الخلايا الأولية من أنسجة الجسم وزراعتها في ظل ظروف النمو المثلى ، فإنها تحاكي عن كثب بيئة الأنسجة في الجسم الحي . يتجنب استخدام الخلايا الأولية العديد من الاعتراضات الأخلاقية التي أثيرت حول التجارب على ويوفر نتائج أكثر صلة من خطوط الخلايا. الخلايا الأولية المختارة مسبقا هي نماذج مناسبة تمثل عن كثب الإشارات الجزيئية في الجسم الحي. تستجيب الخلايا من متبرعين مختلفين بشكل مختلف للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات. غالبا ما تكون تكاليف العزلة والثقافة مرتفعة ، على الرغم من أنها أقل تكلفة من تكاليف النماذج الحيوانية. كانت المواد المستخدمة في زراعة خلايا الشعر الأولية الموصوفة هنا بسيطة ، وكانت تكلفتها منخفضة نسبيا ، وكان النظام سهل التشغيل. إذا لم يتم الحفاظ على ظروف الثقافة المثلى ، فقد تتغير خصائص الخلايا الأولية مع الممرات اللاحقة. مع زيادة عدد الممرات ، ضعفت حالة الخلية أيضا (الشكل التكميلي S2). نظرا لأنها مشتقة مباشرة من أنسجة الجسم الأصلية دون تعديل ، فإن خلايا الشعر السمعية التي تم الحصول عليها تحاكي عن كثب حالتها في الجسم الحي وعلم وظائف الأعضاء. لذلك ، توفر خلايا الشعر الأولية نظاما نموذجيا ممتازا لدراسة فسيولوجيا الخلايا الشعرية والكيمياء الحيوية لها ، بما في ذلك استقلاب الخلايا وسمية الأدوية. على الرغم من أنه لا يمكن الحفاظ على الخلايا الأولية إلا لبضعة أيام في المختبر ، إلا أنه يمكن تخليدها وتقسيمها إلى أجل غير مسمى بعد التحول الجيني للحصول على خطوط الخلايا الثانوية.

في الختام ، وصف البروتوكول الحالي عزل خلايا الشعر السمعية عن العظم الصدغي باستخدام التشريح المجهري والتصنيف الأنزيمي. استغرق البروتوكول بأكمله حوالي 3 ساعات ، من تشريح الماوس إلى طلاء الخلايا. تم الحفاظ على الخلايا المستزرعة بنقاوة عالية وظلت صحية لمدة 6-7 أيام. على الرغم من القيود المتأصلة في مزارع خلايا الشعر الأولية ، والتي تقتصر على مقطعين فقط ، استخدم هذا البروتوكول منهجيات ومواد مباشرة ، مما يمثل وسيلة جديدة لإجراء أبحاث عالية الكفاءة على خلايا شعر القوقعة.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NFSC 82101224 إلى YG)