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La presencia de células madre del cáncer (CSC) en sarcomas óseos se ha vinculado recientemente a su patogénesis. En este artículo, presentamos el aislamiento de células madre cancerosas a partir de cultivos celulares primarios obtenidos de biopsias humanas de osteosarcoma convencional (OS) utilizando la capacidad de las células madre cancerosas de crecer bajo condiciones no adherentes.
Las mejoras actuales en la terapia contra el osteosarcoma (OS) han prolongado la vida de los pacientes con cáncer, pero la tasa de supervivencia de cinco años sigue siendo pobre cuando se ha producido metástasis. La teoría de la célula madre del cáncer (CSC) sostiene que hay un subconjunto de células tumorales en el tumor que tiene características similares a madre, incluyendo la capacidad de mantener el tumor y para resistir la quimioterapia con múltiples fármacos. Por lo tanto, es necesaria una mejor comprensión de la biología y la patogénesis OS con el fin de avanzar en el desarrollo de terapias dirigidas a la erradicación de este subgrupo particular y para reducir la morbilidad y la mortalidad entre los pacientes. El aislamiento de células madre cancerosas, el establecimiento de cultivos celulares de células madre cancerosas, y el estudio de su biología son pasos importantes para mejorar nuestra comprensión de la biología del sistema operativo y la patogénesis. El establecimiento de derivado de ser humano-OS-CSC a partir de biopsias de OS se ha hecho posible el uso de varios métodos, incluyendo la capacidad de crear cultivos de células madre 3-dimensional bajo nonadherecondiciones NT. En estas condiciones, células madre cancerosas son capaces de crear colonias flotantes esféricos formados por células madre hija; estas colonias se denominan "esferas celulares". A continuación, se describe un método para establecer cultivos de CSC de cultivos celulares primarios de sistema operativo convencional obtenido a partir de biopsias del sistema operativo. Se describe claramente los varios pasajes necesarios para aislar y caracterizar células madre cancerosas.
Los sarcomas son un grupo heterogéneo de tumores malignos del tejido conjuntivo poco frecuentes originados en su mayor parte a partir del mesodermo embrionario 1. Los diferentes tipos incluyen sarcomas óseos y sarcomas de tejidos blandos. sarcomas de hueso, un grupo de tumores primarios relativamente poco comunes, consisten en varios subtipos, incluyendo osteosarcoma (OS). OS, uno de los tumores primarios más comunes de los huesos, es una neoplasia mesenquimal que exhibe una amplia clínicos, histológicos y heterogeneidades moleculares 2, 3. Por desgracia, el sistema operativo se produce predominantemente en niños y en adultos jóvenes 4, 5 y representa el 60% de los subtipos histológicos comunes de sarcoma óseo en la infancia 6, 7. OS suele afectar a las áreas del esqueleto, que se caracterizan por el crecimiento rápido del hueso (por ejemplo, la metáfisis de los huesos largos). Entre los histológicamente diferentes subtipos de OS, el sistema operativo convencional, también llamado medular o el sistema operativo central, tiene un alto grado de malignidad y una cuota share del 80% 8. Este 80% se compone de 60% OS convencional osteoblástica, 10% OS condroblástico, y 10% OS fibroblástica 6, 8-10. Otros subtipos incluyen OS anaplásico, telangiectasias, rico en células gigantes y OS de células pequeñas. A pesar de los avances en la cirugía y la quimioterapia combinada en la gestión del sistema operativo, el resultado sigue siendo pobre, con una tasa de supervivencia a largo plazo del 65-70% en pacientes sin metástasis 11, 12. Recurrencias distantes con frecuencia se producen como metástasis pulmonares o, con menos frecuencia, como las metástasis a los huesos distantes y recurrencias locales 13. Las metástasis son a menudo resistente a los tratamientos convencionales. Esta resistencia es la razón por la supervivencia libre de enfermedad a 10 años es aproximadamente el 30% en los pacientes con enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico 14, 15.
Al igual que con el tejido normal, el tejido de cáncer se compone de una colección heterogénea de tipos de células. Las células dentro del tumor parecen corresponder a diferentes etapas de desarrollo. Dentro de cualquier ntejido Ormal reside una subpoblación de células con la capacidad de selfrenew, proporcionando así progenitores y células maduras para la homeostasis del tejido. Del mismo modo, el cáncer se compone de una población heterogénea similar de células en diferentes etapas de desarrollo, con diferentes grados de proliferación y potencial tumorigénico. Un subconjunto de estas células de cáncer, denominada células madre del cáncer (CSC), constituye un depósito de autosostenible células con la capacidad exclusiva de selfrenew y mantener el potencial maligno de tumores, por lo tanto la generación de los diferentes linajes de células que constituyen la masa tumoral 16. En la década de 1990, los estudios sobre la leucemia mieloide aguda proporcionaron la primera evidencia convincente de la existencia de subpoblaciones CSC 17, 18. Los CCC ya se han aislado de un gran número de tumores sólidos 19, convirtiéndose así en uno de los temas más investigados en la investigación del cáncer. CSC de hecho puede surgir a partir de células madre normales por mutaciones en genes que hacen que la normal decélulas cancerosas 20-23 tallo. Las mutaciones múltiples de transformación y las interacciones con el microambiente también podrían contribuir a progenitores sanos y células maduras que adquieren la capacidad selfrenewal y la inmortalidad que tipifican los CAC. Hay varias hipótesis acerca de esta transformación. Progenitores sanos, las células maduras sanas y células cancerosas, pueden dedifferentiate a las células madre, la obtención de un fenotipo similar al tallo mediante la activación de los genes asociados selfrenewal-24-28. A pesar de varios estudios recientes, los orígenes de los CAC aún no se han descubierto.
Una característica particular de células madre cancerosas es que su capacidad de resistir el enfoque multi-terapia, que consiste en la cirugía y la quimioterapia combinada con diferentes fármacos. Estudios recientes han demostrado que los CAC también puede adquirir resistencia a los agentes de quimioterapia citotóxica. Las posibles explicaciones para esta resistencia incluyen la sobreexpresión de unión a ATP de cassette (ABC) transportador de múltiples fármacos (es decir,MDR1 y BCRP1), la sobreexpresión de enzimas metabolizadoras de quimioterapia tales como aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1), y / o cambios en la cinética del ciclo celular 30-33. La consecuencia directa de todos estos conceptos que se han descrito hasta ahora es que una terapia de cáncer sería eficaz sólo si la subpoblación CSC fueron eliminados por completo, mientras que la recurrencia local o metástasis a distancia podrían ocurrir si incluso una sola CSC sobrevivió.
El descubrimiento de células madre cancerosas en los sarcomas humanos 34, en particular OS 35, o en cualesquiera otros tipos de cáncer de hueso y tejidos blandos, tiene una gran importancia clínica, ya que ofrece una posible explicación de por qué muchos tratamientos parecen ser eficaces al principio, pero los pacientes recaída posterior. Por lo tanto, la esperanza para el futuro batalla contra el sistema operativo convencional es encontrar nuevas y específicas terapias dirigidas basado en el desarrollo de fármacos innovadores dirigidos a OS-CSC gracias a la caracterización molecular de este subla población y al estudio de la biología CSC.
En 1992, Reynolds y sus colegas, que estaban investigando si un subconjunto de células madre estaba presente en el cerebro adulto de mamíferos, desarrollaron un método para aislar células que se sospecha que ser células 36, 37 del vástago-similares. Este método se basa en la capacidad particular de estas células para formar colonias esféricas cuando se cultivan bajo condiciones no adherentes. Técnicas similares fueron empleados por Gibbs y sus colegas en 2005 para estudiar una subpoblación de células madre similares a los sarcomas de hueso 38. Para aislar y caracterizar OS-CSC a partir de cultivos celulares primarios de diferentes tipos de OS convencional, decidimos adaptar esta técnica para las líneas celulares del sistema operativo.
A continuación, describimos este método adaptado del ensayo de formación de esfera, denominado "ensayo sarcosphere", que se puede utilizar para aislar OS-CSC a partir de líneas de células primarias finitos derivados de biopsias humanas de OS convencional. También describimos todas las técnicas used para validar el CSC fenotipo de tallo como de las líneas celulares aisladas mediante este ensayo: 1) Evaluación de la expresión de genes que caracterizan a las células madre embrionarias pluripotentes (CES) y del gen CD133, que es un marcador de células madre cancerosas; 2) (CFU) ensayo de unidad formadora de colonias; 3) Evaluación de la capacidad de estas células para diferenciarse en osteoblastos y adipocitos bajo condiciones de diferenciación apropiadas; 4) el estudio de los marcadores de superficie de células madre mesenquimales (MSC) (por ejemplo, CD44, CD105 y Stro-1) por tinción de inmunofluorescencia y por análisis de citometría de flujo; 5) Evaluación de la actividad de ALDH de estas células.
Toda la experimentación utilizando tejidos humanos descritos en este documento fue aprobado por el comité de ética local (Rif. N. 141/12). El consentimiento informado para la recogida de muestras de tejidos y para el uso y almacenamiento de las muestras se obtuvo de los donantes en AOUC.
1. Preparación para la Cultura
2. El establecimiento de cultivos celulares primarios OS y OS líneas celulares finitas (OSA)
NOTA: los cultivos de células del sistema operativo primario se prepararon a partir de muestras de biopsias frescas OS convencionales recogidos en la "Unità Ortopedia Oncológica e Ricostruttiva", AOUC Careggi, Florencia. Todas las biopsias, que se obtuvieron por aspiración con aguja o la resección quirúrgica de una pequeña porción del tumor (Figura 1A, B), se colocaron inmediatamente en un medio de cultivo suplementado con 100 UI / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (pH 7,4) y transportados al laboratorio en el que se procesaron. Todas las manipulaciones descritas se realizaron en condiciones asépticas utilizando una campana de flujo laminar.
3. Ensayo Sarcosphere para aislar células madre cancerosas-OS
NOTA: Este experimento se realiza en la AOS. La duración de este experimento se relaciona con la capacidad de las células para formar estas colonias esfera (sarcospheres), y el rango de tiempo es 7, 14, 21, y 28 d.
4. OS-CSC Líneas
NOTA: OS-CSC se obtienen de la sarcospheres que exhiben expansión adherente mediante la reintroducción y recultivo estas células en una monocapa después de que se colocaron en placas en pequeñas 60 mm placas de Petri ya no está bajo condiciones de ultra-bajas de fijación.
5. In vitro Un nálisis para caracterizar las CSC-OS:
Muestras OS obtenidas por aspiración con aguja o la resección quirúrgica de una pequeña porción del tumor (Figura 1A, B) permiten el aislamiento de una sola OSA si se trata precisamente, como se describe en la sección de Protocolo (Figura 2A, B). Desafortunadamente, el número de células aisladas a partir de las biopsias es baja, con un rango de salida de 30 a 50%. La salida depende del tipo y la dimensión de las biopsias (Figura 5A, B). Estas células tienen que ser tratados con precisión. Por consiguiente, aproximadamente un mes es necesario para los cultivos primarios para llegar a la confluencia en una placa de Petri de 100 mm. Después de este tiempo, OSA se obtienen a partir de dos muestras OS marcado OSA5 y OSA6 (Figura 6A, B). Entonces, es necesario subcultivar la línea celular primario para obtener un número suficiente de células para llevar a cabo el análisis de caracterización y criopreservar las células linES. En el paso 3 rd de subcultivo, cuando ambas líneas de células primarias OSA alcanzan la confluencia, se sembraron en placas de 6 pocillos de fijación ultra-bajas para el ensayo sarcosphere. Este tipo de placa se utiliza porque nos permite mantener las células en un estado de suspensión, para evitar que las células madre de la diferenciación de unión mediada, para evitar que las células dependientes de anclaje de dividir, y finalmente, para reducir de fijación al sustrato. Por lo tanto, su uso nos permite crear una condición estresante para las células cancerosas, que es necesaria para la selección de células madre cancerosas. A las 24 h después del inicio del ensayo, las células aparecen aislados uno de otro (Figura 7). Después de 7 d de control de la progresión del ensayo, pequeñas colonias esféricas han comenzado a formarse y son visibles (Figura 8). A los 28 días, varias colonias esféricas grandes que se han formado en cada pocillo se pueden observar (Figura 9A, B). Después de los sarcospheres por plae sido cultivados durante 28 d, estas grandes colonias esféricas se pueden aislar. La figura 10 muestra las etapas para aislar sarcospheres de 6 pocillos placas de fijación ultra-bajas y recultivo ellos en condiciones adherentes. La Figura 11 muestra las colonias esféricas flotantes después del aislamiento. Las grandes colonias esféricas sembraron en placas de fijación normales muestran expansión del adherente después de su aislamiento (Figura 12A, B). Las células que se expanden desde las sarcospheres individuales son probablemente las células cancerosas con un fenotipo de células madre similares. Por lo tanto, después del aislamiento, OS-células madre cancerosas probablemente fueron obtenidos. Estas células se denominan células madre cancerosas OSA5-y-OSA6 células madre cancerosas (Figura 13A, B).
En este punto, es necesario proceder a la caracterización del fenotipo de células madre similares para las dos líneas OS-CSC obtenidos, como se describe anteriormente. Los análisis para la caracterización del fenotipo de células madre wer-comoe realiza en el 4º paso del subcultivo después se aislaron los sarcospheres para cada línea OS-CSC. Las dos líneas celulares, células madre cancerosas OSA5-y-OSA6 células madre cancerosas, mostraron una fuerte positividad para los marcadores de superficie MSC (CD105 y CD44) (Figura 14A, B y Figura 15A, B), mientras que mostraron positividad moderada para el marcador de superficie MSC estroma 1 (Figura 16A, B). Nuestras observaciones han sido confirmadas por los resultados negativos obtenidos con la línea comercial y diferenciada de células de cáncer de colon HCT8 (Figura 14C, la Figura 15C, la Figura 16C). Se observó una total falta de tinción específica y no específica para estos marcadores de superficie en la línea celular HCT8.
Para evaluar el fenotipo MSC de los dos SO-células madre cancerosas, sino que también los análisis de citometría de flujo realizada. Tanto las líneas OS-CSC expresan altos niveles de CD44 y CD105. Sin embargo, de las células en las dos líneas celulares, sólo el 1,14%, expresado Stro-1. Por lo tanto, esta reSult confirmó la presencia moderada de Stro-1 como se demuestra por la tinción de inmunofluorescencia. Por el contrario, 99,62% de la OSA5-CSC expresó CD44 y 87,38% de estas células expresaban CD105; 99,88% de la OSA6-CSC expresa CD44 en y 95,79% de estas células expresaban CD105. Además, ambas líneas celulares son CD45-.
Se evaluó la expresión de marcadores de 3 ESC (Nanog, Oct 3/4, Sox2) y del gen CD133, otro marcador de células madre cancerosas, mediante RT-PCR. Hay que destacar que todos estos genes se expresaron en ambas líneas OS-CSC (Figura 17). Los ensayos de diferenciación osteogénica adipogénicos y mostraron la capacidad de las líneas aisladas OSA-CSC de diferenciarse en osteoblastos (Figura 18A - D y la Figura 19A - D) y en adipocitos (Figura 20A - D).
Además, la CFU una ssay (Figura 21) mostró una buena tasa de eficiencia clonogénico, con un 13% de los CAC-OSA5 y 14% para OSA6-CSC. Varios estudios recientes han demostrado que los altos niveles de actividad de ALDH son características de varios tipos de cáncer. Este parámetro puede ser utilizado como un marcador de células madre de cáncer y se correlaciona con un mal pronóstico. El ensayo de actividad de ALDH mostró que ambas líneas OS-CSC tienen altos niveles de actividad de ALDH (Figura 22), mientras que se observó actividad ALDH en el límite inferior cuantificable en la línea de fibroblastos que se utilizó como control negativo en este ensayo.
Figura 1. Ejemplos de muestras OS biopsia. (A). muestra de la biopsia obtenida por aspiración con aguja. (B). muestra de biopsia obtenido por la resección quirúrgica de una parte del tumor.884 / 53884fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La desagregación mecánica de una muestra OS. (A) La fragmentación de una muestra con unas pinzas y una lanceta Perry. (B) Los fragmentos suspendidas en CM (indicada por la flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. El equipo y consumibles necesarios para aislar Sarcospheres. (A). Todos los equipos necesarios para el aislamiento de células. 1. Una jeringa estéril con un soporte de filtro de membrana estéril; 2. Dos medios diferentes: un GMnd SCGM; 3. Una pipeta Pasteur de vidrio estéril. (B) Detalle de la jeringa montada sobre un soporte, con el soporte del filtro de membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Unidad de filtración. Varios componentes necesarios para montar la unidad de filtración (A) (el filtro de red se indica por la flecha). De contraste de fase de observación de las 40 micras mallas (una malla está indicado por la flecha) del filtro neto (B). Aumento original: 10 veces. La unidad de filtración montado (C - D). Unidad de filtración esterilizada (E). Haga clic aquí para ver una mayor cincorsión de esta figura.
Figura 5. cultivos celulares primarios de sistema operativo convencional. Observación de contraste de fase de cultivos celulares primarios de sistema operativo de alto grado. En (A), varios fragmentos de hueso brillantes son visibles, mientras que en (B), varios pequeños eritrocitos redondeadas y flotantes están presentes. Aumento original: 10 veces. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. convencional Osteosarcoma líneas celulares finitas (OSA). (A) OSA5 y (B) OSA6. Observación de contraste de fase.Aumento original: 10 veces. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Sarcosphere Ensayo de OSA5 y OSA6. Después de 24 h desde el inicio del ensayo, las células fueron flotando y aisladas unas de otras (células se indican mediante flechas). Observación en contraste de fase. Aumento original:. 20X Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Ensayo de Sarcosphere OSA5 y OSA6 a las 7 D. 7 d en el ensayo, varios pequeños Sphericase pudieron observar l colonias rodeadas por células individuales. Los sarcospheres (algunos de estos sarcospheres se indican con flechas) aparecen flotando en el medio o ligeramente asentado en el fondo del pozo. Observación en contraste de fase. Aumento original: 20X. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. Ensayo de Sarcosphere OSA5 y OSA6 a 28 D. Después de 28 días, varias grandes sarcospheres ámbar se observan en cada pocillo de las placas de cada línea celular OSA, OSA5 (A) y OSA6 (B). Tamaño de la barra: 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10. Los pasajes para el aislamiento de Sarcospheres Los pasos para sarcospheres de aislamiento de 6 pocillos placas de fijación ultra-bajas y su recultivo en condiciones adherentes se muestran (A) Todo el equipo necesario para el aislamiento.:. 1. Uno de 6 pocillos ultra bajo placa con sarcospheres formados en cada pocillo, 2. jeringa con el soporte del filtro de red, 3. pipeta, 4. 1000 l puntas esterilizadas, 5. 2 pinzas estériles Perry, 6. 2 medios de cultivo diferentes , 7. pipeta Pasteur estéril 8. placas de Petri. (B) Recopilación de sarcospheres. El medio contenido en cada pocillo se recoge mediante una pipeta con una punta de 1.000 l estéril. (C) Recoger la suspensión en la jeringa. La suspensión recogida se transfiere a la jeringa para iniciar el proceso de filtración natural usando elsoporte de filtro de membrana. (D) filtración natural. (E) Desmontaje del soporte del filtro de membrana de la jeringa. Después se filtra toda la suspensión, el soporte del filtro neto se toma aparte y se puso en un plato de Petri; (F) Desmontaje del soporte del filtro de membrana. Sarcospheres están contenidas en los poros del filtro de red en el soporte del filtro de red, por lo que deben ser liberados con las pinzas Perry. (G, H) La eliminación de sarcospheres desde el filtro de membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11. Aislamiento Sarcosphere. Sarcospheres Aislado flotar en el medio en la placa de Petri 60 mm. Observación de contraste de fase.Aumento original: 40X. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12. Sarcosphere después del aislamiento. Sarcospheres de OSA5 (A) y OSA6 (B) líneas celulares en el comienzo de la expansión adherente siguientes reintroducción y recultivo en una monocapa en condiciones adherentes a las 48 h después del aislamiento. Observación de contraste de fase. Aumento original: 20X. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13. Sarcospheres A los 7 días después del aislamiento. Sarcospheres de OSA5 (A) y líneas celulares OSA6 (B) mostraron expansión adherente siguiente reintroducción y recultivo en una monocapa en condiciones adherentes a 7 d después del aislamiento. Observación de contraste de fase. Aumento original: 20X. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 14. Inmunofluorescencia La tinción para CD105. La tinción de inmunofluorescencia para CD105 en las líneas de OSA-CSC OSA5-CSC (A) y OSA6-CSC (B) y en la línea celular continua HCT8 (C), que se utilizó como control negativo. LSCM de color convencional: Verde para CD105 y rojo para el citoesqueleto. Aumento original: 10 veces. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 15. Inmunofluorescencia La tinción para CD44. La tinción de inmunofluorescencia para CD44 en las líneas de OSA-CSC OSA5-CSC (A) y OSA6-CSC (B) y en la línea celular continua HCT8 (C), que se utilizó como control negativo. LSCM en colores convencionales: verde y rojo para CD44 para citoesqueleto. Aumento original: 10 veces. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 16. La inmunofluorescencia tinción de Stro-1. La tinción de inmunofluorescencia para Stro-1 en las líneas OSA-CSC-OSA5 células madre cancerosas (A) y OSA6-células madre cancerosas (B) y en la línea celular continua HCT8 (C), que fue utilizado como un negativo controlar. LSCM en colores convencionales: verde para Stro-1 y el rojo para citoesqueleto. Aumento original: 10 veces. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 17. Expresión de marcadores nucleares del CES y del gen CD133. RT-PCR que muestra la expresión de Nanog, Oct 3/4, Sox2 y CD133 en células madre cancerosas OSA5-(A) y en los CAC-OSA6 ( B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 18. Ensayo de diferenciación osteogénica -. ALP diferenciación osteogénica en 0 d (A, B) y después de 10 d (C, D) de la inducción como se determina por tinción citoquímica para ALP usando Fast Blue BB. En azul, ALP + células; en rojo, el núcleo contratinción con yoduro de propidio. observación Composite en campo claro y en la fluorescencia. Aumento original: 20X. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 19. Ensayo de diferenciación osteogénica -. HA diferenciación osteogénica en 0 d (A, B) y después de 20 d (C, D) de la inducción como se determina por tinción citoquímica para la hidroxiapatita (HA) con rojo de alizarina S. Las células se contrastan en depósitos de color azul / gris, y el granuladas de HA se tiñen de rojo. Observación en contraste de fase. Aumento original: 40X. Tamaño de la barra:. 100 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 20. Adipogénico ensayo de diferenciación. Diferenciación adipogénica en 0 d (A, B) y después de 14 d (C, D) de la inducción como se determina por cytochtinción emical con Aceite Rojo O. En rojo, las vesículas lipídicas (las vesículas más grandes están indicadas por las flechas negras / rojo; las vesículas más pequeñas se indican mediante las flechas blancas / negras); en azul / violeta, los núcleos contrastados por hematoxilina. Observación de campo claro. Aumento original: 40X. Tamaño de la barra:. 100 M Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 21. Ensayo de UFC. Ensayo de UFC de líneas OSA-CSC teñidas con azul de toluidina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
/> Figura 22. Ensayo de la actividad de ALDH. El ensayo colorimétrico ALDH detectado altos niveles de actividad de ALDH en las dos líneas OS-CSC, OSA5-células madre cancerosas y células madre cancerosas OSA6-, mientras que el ensayo detectó la ausencia de esta actividad en la línea de célula diferenciada finita de los fibroblastos, FIB. Las barras de error: SD. **: P <0,001 vs FIB; *:. P <0,01 vs FIB Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Gene | Los oligonucleótidos | Secuencia (5¹-3¹) | El tamaño del amplicón (pb) | Tₐ (° C) | |
Nanog | Cebador inverso cebador directo | 87 | 60 | ||
octubre 3/2 | Cebador inverso cebador directo | GGGAGGAGCTAGGGAAAGA TCCTTCCTTAGTGAATGAAGAACT | 77 | 60 | |
Sox2 | Cebador inverso cebador directo | TGCAGTACAACTCCATGACC GGACTTGACCACCGAACC | 125 | 55 | |
CD133 | Cebador inverso cebador directo | CCAGAAGCCGGGTCATAAAT ATTCACTCAAGGCACCATCC | 127 | 56 | |
pb, pares de bases de tamaño de amplificación; Tₐ, recocidotemperatura |
Tabla 1. Lista detallada de Secuencias de los Cebadores para Nanog, Oct 3/4, Sox2 y CD133 con el tamaño de amplificación y la temperatura de recocido
CSC tienen varias propiedades que permiten la identificación de este subconjunto celular particular en la masa del tumor. Sobre la base de estas características, tales como la resistencia adquirida a citotóxicos agentes de quimioterapia para la sobreexpresión de ATP de unión a transportadores de casete de eflujo multifármaco de 28, 32, 33, o para la regulación al alza de la expresión de enzimas de desintoxicación, tales como ALDH 32, para la expresión de un marcador de superficie en particular, como CD133, CD44, CD34, CD90, y otros 30, 34, 35, 41, varios métodos diferentes para aislar células madre cancerosas se han desarrollado 42-44. Una de estas técnicas es el ensayo de formación de esfera, que se basa en la capacidad de las células madre cancerosas para crecer en condiciones no adherentes.
La capacidad de las células madre de tejido y células madre cancerosas para formar esferas fue descrito primero en los estudios sobre la identificación de células madre neurales por Reynolds et al. 37. Posteriormente, Gibbs et al. 38 nosed estos estudios para iniciar el aislamiento de células madre cancerosas de los tumores sólidos, en particular, de sarcomas óseos. Hemos decidido utilizar el método de ensayo de formación de ámbito ilustrado por Gibbs et al. Para aislar células madre cancerosas de las líneas celulares obtenidas de biopsias OSA OS convencionales. Se adaptó el método original para mejorar los resultados de este ensayo y para facilitar su reproducibilidad para otras líneas celulares de cáncer. Con referencia a la creación de la ensayo de formación de esfera, se verificó que chapado 40.000 células / pocillo es una buena práctica para mantener las células en aislamiento en el comienzo del ensayo. Este truco es muy importante para evitar la posibilidad de que las colonias esféricas originan a partir de la agregación celular y no de la capacidad particular y exclusivo de un único CSC para crecer en condiciones no adherentes y formar una colonia esférica. Esta capacidad es un punto particularmente crítico de este ensayo.
También certificamos que para obtener una buena tasa de formación de esferas, Es suficiente para volver a cargar alícuotas de factores de crecimiento cada 3 d y no todos los días como se describe en el método original. En este estudio, también establecido y ampliamente descrito un buen método para el aislamiento de las colonias esféricas que se formaron cuando se cultiva en condiciones no adherentes. Este paso es crítico en este ensayo, ya que es muy importante para tratar de aislar como muchas de las esferas como sea posible que se forman en cada pocillo sin dañarlos. También es importante para aislar sólo las esferas y no las células individuales, que pueden permanecer en suspensión durante la duración del ensayo. Para superar estos puntos críticos, hemos desarrollado un método de aislamiento particular, el cual, como se muestra arriba, dio buenos resultados para el aislamiento CSC. Obviamente, hay la posibilidad de que no todas las esferas que se formaron se pueden recuperar, pero el porcentaje de pérdida es muy baja. De hecho, también tenemos la posibilidad de utilizar un filtro con poros 40 micras para aislar las esferas después de que se conviertan en grandes (formularioed aproximadamente 100 - 200 células).
Este aislamiento se detiene la formación de esfera pero permite que las células individuales, parte del residuo metilcelulosa, y las esferas más pequeñas para ser filtradas. Esta eliminación se lleva a cabo por filtración a fondo tal como se describe en el protocolo.
Por otra parte, la selección de las colonias más grandes esféricas a través de las 40 micras de malla, con la consiguiente pérdida de las colonias esféricas más pequeñas permite seleccionar las células madre cancerosas con la más alta capacidad de formar colonias esféricas y con mayor stemness. Todas estas modificaciones se llevaron a cabo para mejorar el ensayo y para ayudar a los investigadores que estudian los CAC de entender y reproducir el paso más crítico del método original del ensayo de formación de esfera.
Entre los estudios con respecto a los métodos in vitro de células madre cancerosas de aislamiento, este estudio tuvo como objetivo mostrar cómo este ensayo de formación de ámbito adaptada podría ser un buen método para aislar células madre cancerosas delíneas celulares de Osa. Las adaptaciones al método original y la técnica de aislamiento detallada describen mejorar su eficacia. En poco tiempo, buen número de los CAC se puede obtener y utilizar para varios experimentos. Por lo tanto, es posible confirmar rápidamente los fenotipos madre-como y, en particular, para estudiar el fenotipo doble vástago-como que caracteriza OS-CSC. Por lo tanto, este ensayo modificado podría ser una buena técnica para el aislamiento de células madre cancerosas y el estudio de su biología. En el futuro, este método, con adaptaciones adicionales, también se puede utilizar para aislar células madre cancerosas de otras líneas celulares de cáncer de finito obtenidos por biopsias de tumores sólidos raras.
La posibilidad de aislar células madre cancerosas de tumores sólidos raras, tales como OS, no sólo permite la mejora de los estudios sobre este tipo de cáncer particular, sino que se extiende también a estudios de diferentes tipos de cáncer para desarrollar mejores métodos para su aislamiento y para futuros estudios de la biología de este subconjunto celular importante. Por lo tanto, como hemoslo han hecho en este estudio, es importante para mejorar los métodos de aislamiento CSC a través del estudio de CSC biología, con el objetivo final de encontrar dianas moleculares y el desarrollo de una terapia contra el cáncer muy específico dirigido contra este subconjunto celular particular, que es probablemente responsable de el mantenimiento del tumor primario, el desarrollo de su repetición, y el origen de las metástasis en varios órganos. El estudio de la biología CSC también es importante para la búsqueda de terapias que podrían ser incisiva en la cura del cáncer, como el sistema operativo, para lo cual la tasa de supervivencia después del tratamiento neoadyuvante sigue siendo muy pobre.
The authors declare that they have no competing financial interest.
This study was supported by ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | LONZA | BE17-513F | _ |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | LONZA | BE17-512F | _ |
Porcine Trypsin 1:250 | BD Difco | 215310 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate(EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130 | Solvent: Buffer Solution, pH 7.4. Stock concentration: Powder |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | BDH Chemicals-VWR | 10323 | _ |
Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | F6636 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma-Aldrich | 49752 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 5 mg/mL |
β-Glycerol phosphate disodium salt pentahydrate | Sigma-Aldrich | 50020 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 1 M |
Insulin. Human Recombinant | Sigma-Aldrich | 91077 | Solvent: NaOH 0.1 M. Stock concentration: 10 mM |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 500 mM |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 200 mM |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 1 mM / 100 µM. Store in liquid nitrogen to maintain the biological activity |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | _ |
Fetal Bovine Serum South America | EUROCLONE | ECS0180L | _ |
Penicillin-Streptomycin (PEN-STREP) 10,000 U/mL | LONZA | DE17-602E | _ |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | 274429 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: 2% |
Putresceine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T-1147 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 25 mg/mL |
Human Epidermal Growth Factor (EFGF) | Sigma-Aldrich | E5036 | Solvent: DPBS pH 7.4. Stock concentration: 10 µg/mL |
Fibroblast Growth Factor-Basic Human | Sigma-Aldrich | F0291 | Solvent: DPBS + 0.2% BSA. Stock concentration: 25 µg/mL |
Selenous Acid | Sigma-Aldrich | 211176 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 30 mM |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Solvent: ETOH. Stock concentration: 10 mM |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Oil Red O | ICN Biochemicals | 155984 | Solvent: 2-Propanol. Stock concentration: Powder |
Naphtol AS-MX Phosphate Disodium Salt | Sigma-Aldrich | N5000 | Solvent: DMSO. Stock concentration: Powder |
Fast Blue BB Salt | Sigma-Aldrich | F3378 | Solvent: Tris HCL, pH 9.0. Stock concentration: Powder |
Fast Red Violet LB Salt | Sigma-Aldrich | F3381 | Solvent: Tris HCL, pH 9.1. Stock concentration: Powder |
Bovine Serum Albumin, Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | A-4503 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 2% |
Alizarin Red S | ICN Biochemicals | 100375 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 533998 | 4% |
Triton-100X | MERCK | 11869 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 0.2%. Danger - Use only under chemical hood |
Calcein | MERCK | 2315 | Solvent: DPBS . Stock concentration: 200 µg/mL |
2-Propanol | MERCK | 109634 | Danger - Use only under chemical hood |
Ab-CD105 (Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | Abcam | ab11415 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD44 (Mouse monoclonal [F10-44-2] to CD44 (PE/Cy7®) ) | Abcam | ab46793 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD45 (Mouse monoclonal [MEM-28] to CD45 (PerCP)) | Abcam | ab65952 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD105 (Human CD105 Purified Antibody) | Invitrogen | MHCD10500 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-CD44 (Anti-CD44 Antibody) | Abcam | EPR1013Y(ab51037) | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-Stro-1 (Mouse anti-STRO-1) | Invitrogen | 398401 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 488 (Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)) | Invitrogen | A-21206 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L)) | Invitrogen | 61-6511 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 635 Phalloidin | Invitrogen | A34054 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
AutoMACS™Running Buffer MACS Separation Buffer | Miltenyi | 130,091,221 | Liquid. Store at 4 °C |
QIAzol®Lysis Reagent | QIAGEN | 79306 | Danger - Use only under chemical hood |
QUANTITECT® Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205314 | _ |
Chlorophorm | Sigma-Aldrich | C2432 | Liquid. Danger - Use only under chemical hood |
Laminar flow hood | GELAIRE | BSB6A | _ |
Chemical hood | ARREDI TECNICI Villa | Modello DYNAMICA | _ |
Centrifuge | EPPENDORF | 5415R | _ |
Laser Scanning Confocal Microscopy LSM 5109 Meta | ZEISS | _ | _ |
iCycler PCR Thermalcycler | BIORAD | _ | _ |
CyFlow®SPACE | (PARTEC) | _ | _ |
Inverted Micrposcope Axiovert 200M | ZEISS | _ | _ |
Freezing container , | Nalgene | _ | _ |
Original Pipet-Aid | pbiBrand | _ | _ |
Micropipettes | EPPENDORF | _ | _ |
Glass Pasteur Pipette | SIGMA | _ | _ |
VICTOR3™ | PERKIN ELMER | _ | _ |
Conical tubes (15 and 50 mL) | BD FALCON | 352096 (for 15 mL) 352070 (for 50 mL) | _ |
24-Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell-Cell-Culture-Plate | BD FALCON | 353047 | _ |
6-Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple-Well-Plates | CORNING | 3471 | _ |
Serological pipettes (5 and 10 mL) | BD FALCON | 357543 (for 5 mL) 357551 (for 10mL) | _ |
Syringe (5mL) | B|BRAUN | 4617053V | _ |
Petri dish 100X20 mm | BD FALCON | 353003 | _ |
Röhren Tubes (3.5 mL, 55x12mm, PS) | SARSTEDT | 55,484 | _ |
Petri dish 60X15 mm | BD FALCON | 353004 | _ |
Cryovials 1.5 mL | NALGENE | 5000-1020 | _ |
Cell-Culture Flasks 25 cm² | BD FALCON | 353014 | _ |
Nylon Net Filter, Hydrophilic | MERCK | NY4104700 | _ |
Swinnex Filter Holder | MERCK | SX0002500 | _ |
Perry tweezer | _ | _ | _ |
Lancet | _ | _ | _ |
Dounce | _ | _ | _ |
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