Method Article
وجود الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) في الأورام اللحمية العظام في الآونة الأخيرة تم ربط المرضية الخاصة بهم. في هذه المقالة، نقدم عزل الخلايا الجذعية السرطانية من الثقافات الخلية الأولية التي تم الحصول عليها من الخزعات الإنسان من عظمية التقليدي (OS) باستخدام قدرة الخلايا الجذعية السرطانية على النمو في ظل الظروف غير ملتصق.
وقد طالت التحسينات الحالية في العلاج ضد عظمية (OS) حياة مرضى السرطان، ولكن يبقى معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات الفقراء عند حدوث ورم خبيث. و(CSC) نظرية سرطان الخلايا الجذعية ترى أن هناك مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية داخل الورم أن لها خصائص تشبه خصائص الجذعية، بما في ذلك القدرة على الحفاظ على الورم ومقاومة للأدوية المتعددة العلاج الكيميائي. لذلك، هناك حاجة إلى فهم أفضل لنظام التشغيل البيولوجيا والمرضية من أجل المضي قدما في تطوير علاجات تستهدف القضاء على هذه فرعية معينة وخفض معدلات المراضة والوفيات بين المرضى. عزل الخلايا الجذعية السرطانية، وإنشاء مزارع الخلايا الخلايا الجذعية السرطانية، ودراسة علم الأحياء هم خطوات مهمة لتحسين فهمنا للبيولوجيا نظام التشغيل والمرضية. أحرز إنشاء المستمدة الإنسان OS-الخلايا الجذعية السرطانية من الخزعات من نظام التشغيل من الممكن استخدام العديد من الطرق، بما في ذلك القدرة على إنشاء 3 الابعاد الثقافات الخلايا الجذعية تحت nonadhereشروط الإقليم الشمالي. في ظل هذه الظروف، الخلايا الجذعية السرطانية قادرة على إنشاء المستعمرات العائمة الكروية التي شكلتها الخلايا الجذعية ابنة. وتسمى هذه المستعمرات "مجالات الخلوية". هنا، نحن تصف طريقة لإنشاء الثقافات ديوان الخدمة المدنية من الثقافات الخلية الأولية من نظام التشغيل التقليدية التي تم الحصول عليها من الخزعات نظام التشغيل. نحن تصف بوضوح العديد من المقاطع المطلوبة لعزل وتوصيف الخلايا الجذعية السرطانية.
الأورام اللحمية هي مجموعة غير متجانسة من أورام الأنسجة الضامة الخبيثة النادرة التي تنشأ في الغالب من الطبقة الجرثومية الجنينية 1. وتشمل أنواع مختلفة من الأورام اللحمية العظام والأورام اللحمية الأنسجة اللينة. الأورام اللحمية للعظام، وهي مجموعة من الأورام الأولية غير شائعة نسبيا، تتكون من عدة أنواع فرعية، بما في ذلك عظمية (OS). نظام التشغيل، واحدة من الأورام الأولية الأكثر شيوعا من العظم، هي خباثة الوسيطة التي يسلك اسعة السريرية والنسيجية، والتغاير الجزيئية 2 و 3. لسوء الحظ، يحدث التشغيل في الغالب في الأطفال وصغار البالغين 4 و 5 و يمثل 60٪ من الأنواع الفرعية النسيجية المشتركة لساركوما العظام في مرحلة الطفولة 6 و 7. يؤثر نظام التشغيل عادة المناطق الهيكل العظمي، والتي تتميز نمو العظام السريع (على سبيل المثال، والكردوس من العظام الطويلة). ومن بين أنواع فرعية مختلفة تشريحيا من نظام التشغيل، ونظام التشغيل التقليدي، كما دعا النخاع أو نظام التشغيل المركزي، لديها درجة عالية من الأورام الخبيثة وشاء الحصصإعادة 80٪ 8. وتتكون هذه 80٪ من 60٪ نظام التشغيل التقليدي بانيات العظم، و 10٪ نظام التشغيل للغضروف، و 10٪ نظام التشغيل أرومي ليفي 6، 10/8. وتشمل الأنواع الفرعية التشغيل الأخرى كشمي، الشعيرات المتوسعة، خلية الغنية العملاقة وOS الخلايا الصغيرة. على الرغم من التقدم في الجراحة والعلاج الكيميائي مجتمعة في إدارة نظام التشغيل، وتبقى النتيجة سيئة، مع معدل البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل من 65-70٪ في المرضى دون الانبثاث 11 و 12. تكرار البعيدة في كثير من الأحيان تحدث باسم الانبثاث الرئة، أو أقل في كثير من الأحيان، كما الانبثاث لعظام بعيدة وتكرار المحلية 13. الانبثاث غالبا ما تكون مقاومة للعلاجات التقليدية. هذه المقاومة هي السبب في بقاء خالية من المرض لمدة 10 سنوات ما يقرب من 30٪ في المرضى الذين يعانون من المرض المنتشر عند التشخيص 14 و 15.
كما هو الحال مع الأنسجة الطبيعية، وتتكون الأنسجة السرطانية من مجموعة غير متجانسة من أنواع الخلايا. ويبدو أن الخلايا داخل الورم لتتوافق مع مراحل مختلفة من التنمية. ضمن أي نالأنسجة أرمال تكمن جزء من السكان من الخلايا مع القدرة على selfrenew، وبالتالي توفير الأسلاف والخلايا الناضجة لتوازن الأنسجة. وبالمثل، يتكون السرطان من السكان غير متجانسة مماثل من الخلايا في مراحل مختلفة من التنمية، مع درجات مختلفة من انتشار الأسلحة النووية وإمكانية مكون للأورام. مجموعة فرعية من هذه الخلايا السرطانية، ويطلق عليه خلايا السرطان الجذعية (الخلايا الجذعية السرطانية)، يشكل مخزونا من selfsustaining الخلايا مع القدرة الحصرية لselfrenew والحفاظ على القدرة الخبيثة من الأورام، وبالتالي توليد الأنساب مختلفة من الخلايا التي تشكل الورم الأكبر 16. في 1990s، قدمت دراسات حول سرطان الدم النخاعي الحاد أول أدلة دامغة على وجود مجموعات سكانية فرعية CSC 17 و 18. ومنذ ذلك الحين تم عزل الخلايا الجذعية السرطانية من عدد كبير من الأورام الصلبة 19، لتصبح بذلك واحدة من أكثر المواضيع التي بحثت في أبحاث السرطان. الخلايا الجذعية السرطانية قد تنشأ في الواقع من الخلايا الجذعية الطبيعية من الطفرات في الجينات التي تجعل وضعها الطبيعيالخلايا الجذعية السرطانية 20-23. الطفرات تحويل متعددة والتفاعل مع المكروية يمكن أن يسهم أيضا إلى الأسلاف السليمة والخلايا الناضجة اكتساب القدرة selfrenewal والخلود الذي يصنف الخلايا الجذعية السرطانية. وهناك العديد من الفرضيات حول هذا التحول. الأسلاف صحية، والخلايا الناضجة صحية، والخلايا السرطانية، ويمكن dedifferentiate إلى الخلايا الجذعية، والحصول على النمط الظاهري مثل الجذعية عن طريق تنشيط الجينات المرتبطة selfrenewal 24-28. وعلى الرغم من العديد من الدراسات الأخيرة، بعد أن اكتشف أصول الخلايا الجذعية السرطانية.
ومن المميزات الخاصة الخلايا الجذعية السرطانية هي أن قدرتها على مقاومة نهج متعدد العلاج، والذي يتألف من جراحة جنبا إلى جنب والعلاج الكيميائي مع الأدوية المختلفة. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الخلايا الجذعية السرطانية قد تحصل أيضا مقاومة للالسامة للخلايا وكلاء العلاج الكيميائي. التفسيرات المحتملة لهذه المقاومة تشمل overexpression من ATP ملزم كاسيت (ABC) أدوية المتعددة نقل (أي،MDR1 وBCRP1)، overexpression من العلاج الكيميائي أنزيمات استقلاب مثل ألدهيد نازعة 1 (ALDH1)، و / أو تغييرات في حركية دورة الخلية 30-33. والنتيجة المباشرة لكل هذه المفاهيم التي تم وصفها حتى الآن هي أن علاج السرطان أن تكون فعالة إلا إذا تم القضاء حيوانية CSC تماما، في حين يمكن أن يحدث تكرار المحلية أو ورم خبيث بعيد إذا نجا حتى CSC واحد.
اكتشاف الخلايا الجذعية السرطانية في الأورام اللحمية الإنسان 34، وخاصة نظام التشغيل 35، أو في أي العظام والأنسجة اللينة أنواع أخرى من السرطان، له أهمية سريرية كبيرة لأنه يقدم تفسيرا محتملا لماذا يبدو العديد من العلاجات لتكون فعالة في البداية، ولكن في وقت لاحق من المرضى الانتكاس. ولذلك، فإن الأمل للمعركة القادمة ضد نظام التشغيل التقليدي هو إيجاد علاجات جديدة ومحددة وموجهة على أساس تطوير العقاقير المبتكرة التي تستهدف OS-الخلايا الجذعية السرطانية بفضل التوصيف الجزيئي لهذا البند الفرعيالسكان ولدراسة البيولوجيا ديوان الخدمة المدنية.
في عام 1992، رينولدز والزملاء، الذين كانوا يحققون ما إذا كانت مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية الموجودة في البالغين أدمغة الثدييات، وضعت طريقة لعزل خلايا يشتبه في أنها خلايا 36، 37 الجذعية مثل. ويستند هذا الأسلوب على القدرة الخاصة ل هذه الخلايا لتشكيل مستعمرات كروية عندما نمت في ظل ظروف غير ملتصق. كانوا يعملون تقنيات مشابهة من قبل جيبس وزملاؤه في عام 2005 لدراسة جزء من السكان من خلايا شبيهة بخلايا المنشأ في العظام الأورام اللحمية 38. عزل وتوصيف OS-الخلايا الجذعية السرطانية من الثقافات الخلية الأولية من أنواع مختلفة من نظام التشغيل التقليدية، قررنا أن تتكيف مع هذه التقنية لخطوط الخلايا OS.
هنا، نحن تصف هذه الطريقة مقتبسة من الفحص تشكيل المجال، يسمى "فحص sarcosphere"، والتي يمكن استخدامها لعزل OS-الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا الأولية محدودة مستمدة من الخزعات الإنسان من نظام التشغيل التقليدية. وصفنا أيضا جميع التقنيات شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي للتحقق من صحة CSC النمط الظاهري مثل تنبع من خطوط الخلايا المعزولة من هذا الاختبار: 1) تقييم التعبير عن الجينات التي تميز المحفزة الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) ومن الجين CD133، الذي هو علامة الخلايا الجذعية السرطانية. 2) (كفو) فحص وحدة تشكيل مستعمرة. 3) تقييم قدرة هذه الخلايا على التمايز إلى خلايا بناء العظم والخلايا الشحمية في ظل ظروف التمايز المناسبة؛ 4) دراسة علامات سطح الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) (أي، CD44، CD105 وSTRO-1) من خلال تلطيخ المناعي وتحليل cytometric تدفق. 5) تقييم النشاط ALDH من هذه الخلايا.
وقد وافق جميع التجريب باستخدام الأنسجة البشرية الموصوفة هنا من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية (الريف. N. 141/12). تم الحصول على الموافقة المسبقة لجمع عينات الأنسجة واستخدام وتخزين العينات من الجهات المانحة في AOUC.
1. إعداد للثقافة
2. إنشاء الثقافات OS الخلية الأولية ونظام التشغيل خطوط الخلايا المتناهية (OSA)
ملاحظة: تم إعداد الثقافات الخلية نظام التشغيل الأساسي من عينات جديدة من الخزعات نظام التشغيل التقليدية التي تم جمعها في "يونيتا ORTOPEDIA Oncologica ه Ricostruttiva"، AOUC Careggi، فلورنسا. جميع الخزعات، التي تم الحصول عليها عن طريق الرشف بالإبرة أو الاستئصال الجراحي لجزء صغير من الورم (الشكل 1A، B)، وضعت على الفور في مستنبت تستكمل مع 100 وحدة دولية / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (7.4 درجة الحموضة) و نقلها إلى المختبر حيث تم معالجتها. وقد أجريت جميع التلاعبات صفها تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء تدفق الصفحي.
3. Sarcosphere الفحص لعزل OS-الخلايا الجذعية السرطانية
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه التجربة على OSA. يرتبط مدة هذه التجربة لقدرة الخلايا على تشكيل هذه المستعمرات المجال (sarcospheres)، ومجموعة من الوقت 7، 14، 21، و 28 د.
خطوط 4. OS-CSC
ملاحظة: OS-الخلايا الجذعية السرطانية يتم الحصول عليها من sarcospheres التي تظهر توسع تمسكا باعادة طرح وreculturing هذه الخلايا في أحادي الطبقة بعد ومطلي هم في الصغيرة 60 مم أطباق بتري لم تعد في ظل ظروف مرفق منخفضة للغاية.
5. في المختبر وnalysis لوصف OS-الخلايا الجذعية السرطانية:
عينات نظام التشغيل التي تم الحصول عليها بواسطة البزل بالإبرة أو الاستئصال الجراحي لجزء صغير من الورم (الشكل 1A، B) تسمح عزل OSA واحدة فقط إذا تم علاجها على وجه التحديد، كما هو موضح في قسم البروتوكول (الشكل 2A، B). وللأسف، فإن عدد الخلايا المعزولة من الخزعات منخفضة، مع مجموعة والانتاج 30-50٪. يعتمد الإخراج على نوع والبعد من الخزعات (الشكل 5A، B). ويجب أن يعامل هذه الخلايا على وجه التحديد. ونتيجة لذلك، ما يقرب من شهر واحد ضروري للثقافات الأولية للوصول إلى confluency في 100 مم طبق بيتري. بعد هذا الوقت، ويتم الحصول على OSA من عينتين OS ملحوظ OSA5 وOSA6 (الشكل 6A، B). ثم، فمن الضروري أن ثقافة فرعية خط الخلية الأساسي للحصول على عدد كاف من الخلايا لإجراء تحليل وتوصيف ولcryopreserve الخلية لينوفاق. في مرور 3 الثالثة من ثقافة فرعية، عند كل OSA خطوط الخلايا الأولية تصل confluency، ومطلي انهم في 6 جيدا لوحات مرفق منخفضة للغاية لفحص sarcosphere. ويستخدم هذا النوع من لوحة لأنه يسمح لنا للحفاظ على الخلايا في دولة مع وقف التنفيذ، لمنع الخلايا الجذعية من التمايز بوساطة المرفق، لمنع الخلايا التي تعتمد على مرسى من الانقسام، وأخيرا، للحد من التعلق الركيزة. وبالتالي، فإن استخدامها يسمح لنا لخلق حالة ضاغطة للحصول على الخلايا السرطانية، وهو أمر ضروري لاختيار الخلايا الجذعية السرطانية. في 24 ساعة بعد بدء الفحص، تظهر خلايا معزولة عن بعضها البعض (الشكل 7). بعد 7 أيام من مراقبة تطور الفحص، بدأت المستعمرات كروية صغيرة لتشكيل ومرئية (الشكل 8). في 28 د، عدة مستعمرات كروية كبيرة التي شكلت في كل بئر يمكن ملاحظتها (الشكل 9A، B). بعد sarcospheres هفتم مثقف ه لمدة 28 د، هذه المستعمرات كروية كبيرة يمكن أن تكون معزولة. ويبين الشكل 10 خطوات لعزل sarcospheres من 6 جيدا لوحات مرفق منخفضة للغاية وreculturing منها في ظل الظروف ملتصقة الشكل 11 يبين مستعمرات كروية العائمة بعد العزلة. المستعمرات كروية كبيرة مطلية في لوحات مرفق العادية تظهر توسع ملتصقة بعد العزلة (الشكل 12A، B). الخلايا التي توسع من sarcospheres احد وربما الخلايا السرطانية مع الجذعية تشبه الخلايا النمط الظاهري. وبالتالي، بعد العزلة، وربما كانت حصلت OS-الخلايا الجذعية السرطانية. تتم تسمية هذه الخلايا الجذعية السرطانية OSA5-وOSA6-الخلايا الجذعية السرطانية (الشكل 13A، B).
في هذه المرحلة، لا بد من المضي قدما في توصيف الجذعية تشبه الخلايا النمط الظاهري لاثنين من خطوط OS-CSC التي تم الحصول عليها، كما هو موضح أعلاه. التحليلات لتوصيف ور النمط الظاهري تشبه الخلايا الجذعيةيقوم الإلكترونية على مرور ال 4 من ثقافة فرعية بعد أن تم عزل sarcospheres لكل خط OS-CSC. أظهرت خطوط الخلايا اثنين، OSA5-الخلايا الجذعية السرطانية وOSA6-الخلايا الجذعية السرطانية، إيجابية قوية للعلامات السلامة البحرية السطحية (CD105 وCD44) (الشكل 14A، B) والشكل (15A، B)، في حين أنها أظهرت إيجابية معتدلة للعلامة MSC سطح Stro- 1 (الشكل 16A، B). وقد تأكدت لدينا ملاحظات نتائج سلبية حصلت مع الخط التجاري ومتباينة خلية سرطان القولون HCT8 (الشكل 14C، 15C الشكل، الشكل 16C). وقد لوحظ انعدام تام للتلطيخ محددة وغير محددة لهذه العلامات السطحية في خط الخلية HCT8.
لتقييم النمط الظاهري MSC من اثنين OS-الخلايا الجذعية السرطانية، ونحن أيضا يحلل أداء cytometric التدفق. كل من خطوط OS-CSC أعربت مستويات عالية من CD44 وCD105. ومع ذلك، من الخلايا في كل من خطوط الخلايا، أعربت٪ فقط 1.14 STRO-1. لذلك، هذا إعادةأكد السلط وجود معتدلة من STRO-1 كما يتضح من تلطيخ المناعي. في المقابل، أعربت 99.62٪ من OSA5-الخلايا الجذعية السرطانية CD44 وأعرب 87.38٪ من هذه الخلايا CD105. وأعرب 99.88٪ من OSA6-الخلايا الجذعية السرطانية CD44 في وأعرب 95.79٪ من هذه الخلايا CD105. بالإضافة إلى ذلك، كل من خطوط الخلايا هي CD45-.
قمنا بتقييم التعبير عن 3 علامات ESC (NANOG، أكتوبر 3/4، Sox2) ومن الجين CD133، علامة الخلايا الجذعية السرطانية آخر، عن طريق RT-PCR. لاحظنا أن كل من هذه الجينات وأعرب في كلا الخطين OS-CSC (الشكل 17). أظهرت فحوصات التمايز مكون الشحم والمكونة للعظم قدرة على حد سواء معزولة خطوط OSA-CSC على التمايز إلى بانيات (الشكل 18A - D والشكل 19A - D) وفي الخلايا الشحمية (الشكل 20A - D).
وعلاوة على ذلك، وكفو على أظهرت ssay (الشكل 21) على نسبة جيدة من الكفاءة مولد الرمع، مع 13٪ للOSA5-الخلايا الجذعية السرطانية و 14٪ للOSA6-CSC. وقد أظهرت عدة دراسات حديثة أن مستويات عالية من النشاط ALDH هي سمة من أنواع مختلفة من السرطان. هذه المعلمة يمكن استخدامها بوصفها علامة الخلية الجذعية السرطانية ويرتبط ارتباطا مع بسوء التشخيص. أظهر فحص النشاط ALDH أن كلا الخطين OS-CSC لديهم مستويات عالية من النشاط ALDH (الشكل 22)، في حين لوحظ نشاط ALDH في الحد الأدنى للقياس الكمي في خط الليفية التي تم استخدامها كعنصر تحكم السلبية في هذا الاختبار.
الشكل 1. أمثلة من عينات الخزعة نظام التشغيل. (A). عينة الخزعة التي تم الحصول عليها بواسطة البزل بالإبرة. (B). عينة الخزعة التي حصلت عليها الاستئصال الجراحي لجزء من الورم.884 / 53884fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تبويب الميكانيكية من عينة نظام التشغيل. (A) تجزئة عينة باستخدام الملقط بيري وانسيت. (ب) شظايا معلقة في CM (الذي يشير إليه السهم). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. المعدات والمستهلكات اللازمة لعزل Sarcospheres. (A). جميع المعدات اللازمة لعزل الخلايا. 1. محقنة معقمة مع حامل مرشح غشاء العقيم. 2. اثنان وسائل الإعلام المختلفة: جنرال موتورزالثانية SCGM. 3. معقم الزجاج ماصة باستير. (ب) تفاصيل عن حقنة تجميعها على الدعم، مع حامل تصفية الغشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. وحدة الترشيح. العديد من العناصر اللازمة لتجميع وحدة الترشيح (A) (يشار تصفية صافي بالسهم). الملاحظة النقيض المرحلة من 40 ميكرون تنسجم (يشار شبكة واحدة بواسطة السهم) من صافي مرشح (B). التكبير الأصلي: 10X. وحدة الترشيح تجميعها (C - D). وحدة الترشيح تعقيمها (E). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر هاءrsion من هذا الرقم.
الرقم 5. الثقافات الخلية الأولية من نظام التشغيل التقليدية. الملاحظة المرحلة تباين الثقافات الخلية الأولية من ارتفاع OS الصف. في الفقرة (أ)، عدة شظايا العظام مشرقة واضحة، بينما في (B)، وجود عدة كرات الدم الحمراء مدورة وصغيرة عائمة. التكبير الأصلي: 10X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. التقليدية ساركوما العظام خطوط الخلايا المتناهية (OSA). (A) OSA5 و (ب) OSA6. الملاحظة في المرحلة التباين.التكبير الأصلي: 10X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. Sarcosphere الفحص من OSA5 وOSA6. وبعد 24 ساعة من بدء فحص الخلايا ويتحرك ومعزولة عن بعضها البعض (يشار إلى الخلايا عن طريق السهام). المراقبة في مرحلة التباين. الأصلي التكبير: 20X الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8. Sarcosphere الفحص من OSA5 وOSA6 في 7 د 7 د في الفحص، والعديد من spherica صغيرويمكن ملاحظة المستعمرات ل محاطة الخلايا وحيدة. وsarcospheres (بعض هذه sarcospheres بالرمز الأسهم) تبدو عائمة في وسط أو تسوية قليلا الى اسفل قاع البئر. المراقبة في مرحلة التباين. التكبير الأصلي: 20X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9. Sarcosphere الفحص من OSA5 وOSA6 في 28 د بعد 28 يوما، لوحظ العديد sarcospheres العنبر كبيرة في كل بئر من لوحات لكل خط الخلية OSA، OSA5 (A) وOSA6 (B). حجم شريط: 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 10. ممرات لعزل Sarcospheres خطوات sarcospheres عزل من 6 جيدا لوحات مرفق منخفضة للغاية وreculturing في ظل ظروف تمسكا ترد (A) جميع المعدات اللازمة لعزل.: 1. واحد 6 جيدا لوحة منخفضة للغاية مع sarcospheres شكلت في كل بئر، 2. حقنة مع حامل تصفية صافي، 3. ماصة، 4. 1000 ميكرولتر نصائح عقيمة، 5. 2 ملاقط معقمة بيري، 6. 2 وسائل الإعلام ثقافة مختلفة ، 7. معقم ماصة باستير 8. أطباق بتري. (ب) جمع sarcospheres. المتوسط الواردة في كل بئر يتم جمعها باستخدام ماصة مع معقم طرف 1000 ميكرولتر. (ج) جمع تعليق في المحقنة. يتم نقل تعليق جمعها إلى حقنة لبدء عملية الترشيح الطبيعية باستخداممرشح حامل الغشاء. (D) الترشيح الطبيعي. (E) تفكيك حامل تصفية غشاء من الحقنة. بعد يتم تصفية كل تعليق، يتم أخذ صافي حامل مرشح على حدة ووضعها في طبق بتري. (F) تفكيك حامل تصفية الغشاء. وترد Sarcospheres في المسام من صافي مرشح في حامل تصفية صافي، لذلك لا بد من الافراج عن استخدام ملاقط بيري. (G، H) إزالة sarcospheres من غشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 11. Sarcosphere العزلة. تطفو sarcospheres معزولة في المتوسط في طبق بتري 60 مم. المراقبة في مرحلة التباين.التكبير الأصلي: 40X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 12. Sarcosphere بعد عزل. Sarcospheres من OSA5 (A) وOSA6 (ب) خطوط الخلايا في بداية التوسع ملتصقة التالية إعادة وreculturing في أحادي الطبقة في ظل ظروف ملتصقة في 48 ساعة بعد العزلة. المراقبة في مرحلة التباين. التكبير الأصلي: 20X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 13. Sarcospheres في 7 D بعد عزل. أظهرت Sarcospheres من OSA5 (A) وخطوط الخلايا OSA6 (ب) التوسع ملتصقة التالية إعادة وreculturing في أحادي الطبقة في ظل ظروف ملتصقة في 7 أيام بعد العزلة. المراقبة في مرحلة التباين. التكبير الأصلي: 20X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 14. المناعي تلطيخ لCD105. تلطيخ المناعي للCD105 في خطوط OSA-CSC-OSA5 الخلايا الجذعية السرطانية (A) وOSA6-الخلايا الجذعية السرطانية (ب) وفي خط الخلية المستمر HCT8 (C)، والذي تم استخدامه كوسيلة لمراقبة سلبية. LSCM في اللون التقليدي : أخضر لCD105 والأحمر للالهيكل الخلوي. التكبير الأصلي: 10X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 15. المناعي تلطيخ لCD44. تلطيخ المناعي للCD44 في خطوط OSA-CSC-OSA5 الخلايا الجذعية السرطانية (A) وOSA6-الخلايا الجذعية السرطانية (ب) وفي خط الخلية المستمر HCT8 (C)، والذي تم استخدامه كوسيلة لمراقبة سلبية. LSCM في الألوان التقليدية: أخضر لCD44 والأحمر للالهيكل الخلوي. التكبير الأصلي: 10X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ضمن الصفحات = "1">
الرقم 16. المناعي تلطيخ Stro1. تلطيخ المناعي للSTRO-1 في خطوط OSA-CSC-OSA5 الخلايا الجذعية السرطانية (A) وOSA6-الخلايا الجذعية السرطانية (ب) وفي خط الخلية المستمر HCT8 (C)، والتي كانت تستخدم كقاعدة للسلبية مراقبة. LSCM في الألوان التقليدية: أخضر لSTRO-1 والأحمر للالهيكل الخلوي. التكبير الأصلي: 10X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 17. التعبير عن علامات ESC النووية ومن CD133 جين. RT-PCR تبين التعبير عن NANOG، أكتوبر 3/4، Sox2 وCD133 في OSA5-الخلايا الجذعية السرطانية (A) وفي OSA6-الخلايا الجذعية السرطانية ( B). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 18. المكونة للعظم التمايز الفحص - ALP التمايز المكونة للعظم في 0 د (A، B) وبعد 10 د (C، D) الحث على النحو الذي يحدده تلطيخ cytochemical لحزب العمال الاسترالى باستخدام سريع الأزرق BB. في الزرقاء، ALP + الخلايا. في أحمر، counterstained النواة مع يوديد propidium. الملاحظة المركبة في brightfield وفي مضان. التكبير الأصلي: 20X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 19. المكونة للعظم التمايز الفحص - HA التمايز المكونة للعظم في 0 د (A، B) وبعد 20 د (C، D) الحث على النحو الذي يحدده تلطيخ cytochemical لهيدروكسيباتيت (HA) مع الصبغ الأحمر الأحمر S. ويتناقض الخلايا في هي ملطخة الودائع الزرقاء / الرمادية، ومحبب من HA باللون الأحمر. المراقبة في مرحلة التباين. التكبير الأصلي: 40X. حجم شريط: 100 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 20. مكون الشحم التمايز الفحص. التمايز مكون الشحم في 0 د (A، B) وبعد 14 د (C، D) الحث على النحو الذي يحدده cytochتلطيخ ال- مع النفط الأحمر O. والأحمر، والحويصلات شحمي (يشار إلى الحويصلات أكبر من السهام أسود / أحمر؛ ويشار إلى الحويصلات أصغر من السهام أبيض / أسود)؛ في الأزرق / البنفسجي، نوى counterstained بواسطة haematoxylin. المراقبة في brightfield. التكبير الأصلي: 40X. حجم شريط: 100 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 21. كفو الفحص. كفو فحص خطوط OSA-CSC ملطخة طولويدين الأزرق. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
/> الشكل 22. ALDH آخر الفحص. مقايسة اللونية ALDH اكتشاف مستويات عالية من النشاط ALDH في خطين OS-CSC، OSA5-الخلايا الجذعية السرطانية وOSA6-الخلايا الجذعية السرطانية، في حين أن فحص الكشف عن عدم وجود هذا النشاط في خط خلية متمايزة محدود من الخلايا الليفية، الاكذوبه. أشرطة الخطأ: SD. **: ع <0.001 مقابل الاكذوبه. *: ص <0.01 مقابل الاكذوبه الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
جينة | أليغنوكليوتيد] | تسلسل (5¹-3¹) | حجم Amplicon (بي بي) | Tₐ (درجة مئوية) | |
NANOG | إلى الأمام التمهيدي عكسي التمهيدي | 87 | 60 | ||
أكتوبر 3/2 | إلى الأمام التمهيدي عكسي التمهيدي | GGGAGGAGCTAGGGAAAGA TCCTTCCTTAGTGAATGAAGAACT | 77 | 60 | |
Sox2 | إلى الأمام التمهيدي عكسي التمهيدي | TGCAGTACAACTCCATGACC GGACTTGACCACCGAACC | 125 | 55 | |
CD133 | إلى الأمام التمهيدي عكسي التمهيدي | CCAGAAGCCGGGTCATAAAT ATTCACTCAAGGCACCATCC | 127 | 56 | |
بي بي، بأزواج القواعد من حجم amplicon، Tₐ، الصلبدرجة الحرارة |
الجدول 1. قائمة مفصلة من التمهيدي متواليات لNANOG، أكتوبر 3/4، Sox2 وCD133 مع حجم Amplicon ودرجة الحرارة التليين
الخلايا الجذعية السرطانية لها العديد من الخصائص التي تسمح بتحديد هوية هذه المجموعة الفرعية الخلوية خاصة في الجزء الأكبر الورم. على أساس هذه الخصائص، مثل المقاومة المكتسبة لالسامة للخلايا وكلاء العلاج الكيميائي للoverexpression من ATP ملزم كاسيت المتعددة النقل هروب رأس المال 28، 32، 33، أو لupregulation من التعبير عن الانزيمات إزالة السموم مثل ALDH 32، للتعبير من علامة سطح معينة، مثل CD133، CD44، CD34، CD90، والبعض الآخر 30، 34، 35، 41، عدة أساليب مختلفة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية وقد وضعت 42-44. واحدة من هذه التقنيات هو فحص تكوين المجال، والتي تقوم على قدرة الخلايا الجذعية السرطانية على النمو في ظروف غير ملتصقة.
وقد وصفت قدرة الخلايا الجذعية الأنسجة والخلايا الجذعية السرطانية لتشكيل المجالات للمرة الأولى في الدراسات على تحديد الخلايا الجذعية العصبية من قبل رينولدز وآخرون. 37. وفي وقت لاحق، جيبس وآخرون. 38 لناإد هذه الدراسات للبدء في عزل الخلايا الجذعية السرطانية من الأورام الصلبة، على وجه الخصوص، من الأورام اللحمية العظام. لقد قررت استخدام طريقة فحص تكوين المجال يتضح من جيبس وآخرون لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا OSA تم الحصول عليها من الخزعات نظام التشغيل التقليدية. نحن تكييف طريقة الأصلي لتحسين نتائج هذا الاختبار وتسهيل استنساخ من أجل خطوط الخلايا السرطانية الأخرى. مع الإشارة إلى إنشاء مقايسة تشكيل المجال، تحققنا من الطلاء 40000 خلية / جيدا هو ممارسة جيدة للحفاظ على الخلايا في عزلة في بداية الفحص. هذه الحيلة هي مهمة جدا لتجنب احتمال أن المستعمرات كروية تنشأ من تجميع الخلايا وليس من قدرة خاصة وحصرية لديوان الخدمة المدنية واحد لتنمو في ظل ظروف غير ملتصقة وتشكيل مستعمرة كروية. هذه القدرة هي النقطة الحرجة بشكل خاص من هذا الاختبار.
نحن أيضا شهادة أن الحصول على نسبة جيدة من تشكيل المجال، فإنه يكفي لتحديث aliquots من عوامل النمو كل 3 د وليس كل يوم كما هو موضح في طريقة الأصلي. في هذه الدراسة، ونحن كما أنشأت وصفت على نطاق واسع وسيلة جيدة لعزل المستعمرات الكروية التي شكلت عندما مثقف في ظل ظروف غير ملتصقة. هذه خطوة حاسمة في هذا الاختبار لأنه من المهم جدا لمحاولة عزل أكبر عدد ممكن من المجالات ممكن أن تتشكل في كل بئر من دون تعرضها للتلف. ومن المهم أيضا لعزل فقط المجالات وليس الخلايا واحد، والتي يمكن أن تبقى في تعليق لمدة الفحص. للتغلب على هذه النقاط الحرجة، قمنا بتطوير طريقة العزل معين، والتي، كما هو مبين أعلاه، أعطى نتائج جيدة لديوان الخدمة المدنية العزلة. ومن الواضح أن هناك إمكانية أن ليس كل المجالات التي شكلت يمكن استردادها، ولكن نسبة خسارة منخفضة جدا. في الواقع، لدينا أيضا إمكانية استخدام فلتر مع 40 ميكرون المسام لعزل المجالات بعد أن تصبح كبيرة (شكلإد حوالي 100-200 الخلايا).
توقف هذه العزلة تشكيل المجال ولكن يسمح للخلايا واحدة، وهي جزء من بقايا ميثيل، وأصغر المجالات لتتم تصفيته. يتم تنفيذ هذا القضاء عن طريق الترشيح شامل كما هو موضح في البروتوكول.
وعلاوة على ذلك، واختيار من أكبر مستعمرات كروية من خلال 40 ميكرون مع شبكة يترتب على ذلك من فقدان أصغر مستعمرات كروية يسمح احد لتحديد الخلايا الجذعية السرطانية مع قدرة أعلى على شكل مستعمرات كروية وبمزيد من stemness. تم تنفيذ كل هذه التعديلات لتحسين الفحص ومساعدة الباحثين على دراسة الخلايا الجذعية السرطانية لفهم وإنتاج الخطوة الأكثر أهمية من الأسلوب الأصلي للمقايسة تشكيل المجال.
من بين الدراسات المتعلقة في طرق المختبر لالخلايا الجذعية السرطانية عزل، فإن هذه الدراسة تهدف الى اظهار كيف ان هذه تكييفها مجال تشكيل الفحص يمكن أن يكون وسيلة جيدة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية منخطوط الخلايا OSA. ووصفت التكيف مع أسلوب الأصلي وتقنية عزل مفصلة تحسين فعاليته. في وقت قصير، ويمكن الحصول على عدد لا بأس به من الخلايا الجذعية السرطانية، ويستخدم لعدة تجارب. لذلك، فمن الممكن لتأكيد بسرعة الظواهر مثل الجذعية، وعلى وجه الخصوص، لدراسة مثل الجذعية النمط الظاهري المزدوج الذي يميز OS-الخلايا الجذعية السرطانية. وبالتالي، يمكن لهذا الفحص المعدلة يكون أسلوب جيد لعزل الخلايا الجذعية السرطانية، ودراسة علم الأحياء الخاصة بهم. في المستقبل، وهذه الطريقة، مع تعديلات إضافية، ويمكن أيضا أن تستخدم لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من خطوط الخلايا السرطانية محدود الأخرى التي حصلت عليها خزعات من الأورام الصلبة نادرة.
إمكانية عزل الخلايا الجذعية السرطانية من الأورام الصلبة نادرة، مثل نظام التشغيل، يسمح تحسن من الدراسات حول هذا السرطان معين فحسب، بل يمتد أيضا إلى دراسات من أنواع مختلفة من السرطان لتطوير طرق أفضل لعزلتهم وللدراسات المستقبلية للبيولوجيا هذه المجموعة الفرعية الخلوية الهامة. ولذلك، ونحنفعلت في هذه الدراسة، من المهم تحسين أساليب CSC العزلة من خلال دراسة علم الأحياء ديوان الخدمة المدنية، مع الهدف النهائي المتمثل في إيجاد أهداف جزيئية وتطوير علاج مضاد للسرطان محددة للغاية الموجهة ضد هذه المجموعة الفرعية الخلوية معينة، والتي ربما تكون مسؤولة عن الحفاظ على الورم الرئيسي، وتطوير تكراره، وأصل الانبثاث في عدة أجهزة. دراسة البيولوجيا CSC مهمة لإيجاد العلاجات التي يمكن أن تكون قاطعة في العلاج من السرطان، مثل نظام التشغيل، والتي ومعدل البقاء على قيد الحياة بعد العلاج المواد الجديدة المساعدة لا تزال سيئة للغاية أيضا.
The authors declare that they have no competing financial interest.
This study was supported by ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | LONZA | BE17-513F | _ |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | LONZA | BE17-512F | _ |
Porcine Trypsin 1:250 | BD Difco | 215310 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate(EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130 | Solvent: Buffer Solution, pH 7.4. Stock concentration: Powder |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | BDH Chemicals-VWR | 10323 | _ |
Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | F6636 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma-Aldrich | 49752 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 5 mg/mL |
β-Glycerol phosphate disodium salt pentahydrate | Sigma-Aldrich | 50020 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 1 M |
Insulin. Human Recombinant | Sigma-Aldrich | 91077 | Solvent: NaOH 0.1 M. Stock concentration: 10 mM |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 500 mM |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 200 mM |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 1 mM / 100 µM. Store in liquid nitrogen to maintain the biological activity |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | _ |
Fetal Bovine Serum South America | EUROCLONE | ECS0180L | _ |
Penicillin-Streptomycin (PEN-STREP) 10,000 U/mL | LONZA | DE17-602E | _ |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | 274429 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: 2% |
Putresceine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T-1147 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 25 mg/mL |
Human Epidermal Growth Factor (EFGF) | Sigma-Aldrich | E5036 | Solvent: DPBS pH 7.4. Stock concentration: 10 µg/mL |
Fibroblast Growth Factor-Basic Human | Sigma-Aldrich | F0291 | Solvent: DPBS + 0.2% BSA. Stock concentration: 25 µg/mL |
Selenous Acid | Sigma-Aldrich | 211176 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 30 mM |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Solvent: ETOH. Stock concentration: 10 mM |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Oil Red O | ICN Biochemicals | 155984 | Solvent: 2-Propanol. Stock concentration: Powder |
Naphtol AS-MX Phosphate Disodium Salt | Sigma-Aldrich | N5000 | Solvent: DMSO. Stock concentration: Powder |
Fast Blue BB Salt | Sigma-Aldrich | F3378 | Solvent: Tris HCL, pH 9.0. Stock concentration: Powder |
Fast Red Violet LB Salt | Sigma-Aldrich | F3381 | Solvent: Tris HCL, pH 9.1. Stock concentration: Powder |
Bovine Serum Albumin, Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | A-4503 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 2% |
Alizarin Red S | ICN Biochemicals | 100375 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 533998 | 4% |
Triton-100X | MERCK | 11869 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 0.2%. Danger - Use only under chemical hood |
Calcein | MERCK | 2315 | Solvent: DPBS . Stock concentration: 200 µg/mL |
2-Propanol | MERCK | 109634 | Danger - Use only under chemical hood |
Ab-CD105 (Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | Abcam | ab11415 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD44 (Mouse monoclonal [F10-44-2] to CD44 (PE/Cy7®) ) | Abcam | ab46793 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD45 (Mouse monoclonal [MEM-28] to CD45 (PerCP)) | Abcam | ab65952 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD105 (Human CD105 Purified Antibody) | Invitrogen | MHCD10500 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-CD44 (Anti-CD44 Antibody) | Abcam | EPR1013Y(ab51037) | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-Stro-1 (Mouse anti-STRO-1) | Invitrogen | 398401 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 488 (Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)) | Invitrogen | A-21206 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L)) | Invitrogen | 61-6511 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 635 Phalloidin | Invitrogen | A34054 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
AutoMACS™Running Buffer MACS Separation Buffer | Miltenyi | 130,091,221 | Liquid. Store at 4 °C |
QIAzol®Lysis Reagent | QIAGEN | 79306 | Danger - Use only under chemical hood |
QUANTITECT® Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205314 | _ |
Chlorophorm | Sigma-Aldrich | C2432 | Liquid. Danger - Use only under chemical hood |
Laminar flow hood | GELAIRE | BSB6A | _ |
Chemical hood | ARREDI TECNICI Villa | Modello DYNAMICA | _ |
Centrifuge | EPPENDORF | 5415R | _ |
Laser Scanning Confocal Microscopy LSM 5109 Meta | ZEISS | _ | _ |
iCycler PCR Thermalcycler | BIORAD | _ | _ |
CyFlow®SPACE | (PARTEC) | _ | _ |
Inverted Micrposcope Axiovert 200M | ZEISS | _ | _ |
Freezing container , | Nalgene | _ | _ |
Original Pipet-Aid | pbiBrand | _ | _ |
Micropipettes | EPPENDORF | _ | _ |
Glass Pasteur Pipette | SIGMA | _ | _ |
VICTOR3™ | PERKIN ELMER | _ | _ |
Conical tubes (15 and 50 mL) | BD FALCON | 352096 (for 15 mL) 352070 (for 50 mL) | _ |
24-Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell-Cell-Culture-Plate | BD FALCON | 353047 | _ |
6-Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple-Well-Plates | CORNING | 3471 | _ |
Serological pipettes (5 and 10 mL) | BD FALCON | 357543 (for 5 mL) 357551 (for 10mL) | _ |
Syringe (5mL) | B|BRAUN | 4617053V | _ |
Petri dish 100X20 mm | BD FALCON | 353003 | _ |
Röhren Tubes (3.5 mL, 55x12mm, PS) | SARSTEDT | 55,484 | _ |
Petri dish 60X15 mm | BD FALCON | 353004 | _ |
Cryovials 1.5 mL | NALGENE | 5000-1020 | _ |
Cell-Culture Flasks 25 cm² | BD FALCON | 353014 | _ |
Nylon Net Filter, Hydrophilic | MERCK | NY4104700 | _ |
Swinnex Filter Holder | MERCK | SX0002500 | _ |
Perry tweezer | _ | _ | _ |
Lancet | _ | _ | _ |
Dounce | _ | _ | _ |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved