Intravitale Weitfeldfluoreszenzmikroskopie der pulmonalen Mikrozirkulation bei experimenteller akuter Lungenschädigung mit einem vakuumstabilisierten Bildgebungssystem

Die intravitale Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um Leukozyten-Endothel-Interaktionen und Kapillarperfusion in Echtzeit zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Abbildung und Quantifizierung dieser Parameter im pulmonalen Mikrokreislauf mit einem vakuumstabilisierten Lungenbildgebungssystem.

Die intravitale Bildgebung von Leukozyten-Endothel-Interaktionen bietet wertvolle Einblicke in immunvermittelte Erkrankungen bei lebenden Tieren. Die Untersuchung von akuten Lungenverletzungen (ALI) / akutem Atemnotsyndrom (ARDS) und anderen Atemwegserkrankungen in vivo ist aufgrund der begrenzten Zugänglichkeit und der inhärenten Bewegungsartefakte der Lunge schwierig. Nichtsdestotrotz wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um diese Herausforderungen zu meistern. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur intravitalen Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von Echtzeit-Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen in der pulmonalen Mikrozirkulation in einem experimentellen Modell von ALI. Ein In-vivo-Lungenbildgebungssystem und eine 3D-gedruckte intravitale Mikroskopieplattform werden verwendet, um die betäubte Maus zu sichern und die Lunge zu stabilisieren, während verwirrende Lungenverletzungen minimiert werden. Nach der Vorbereitung wird die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Leukozytenadhäsion, das Leukozytenrollen und die Kapillarfunktion zu untersuchen. Während sich das hier vorgestellte Protokoll auf die Bildgebung in einem akuten Modell einer entzündlichen Lungenerkrankung konzentriert, kann es auch angepasst werden, um andere pathologische und physiologische Prozesse in der Lunge zu untersuchen.

Die intravitale Mikroskopie (IVM) ist ein nützliches bildgebendes Werkzeug zur Visualisierung und Untersuchung verschiedener biophysikalischer Prozesse in vivo. Die Lunge ist aufgrund ihrer geschlossenen Lage, der zerbrechlichen Natur ihres Gewebes und der durch Atmung und Herzschlag induzierten Bewegungsartefakte sehr schwierig in vivo abzubilden ^1,2. Verschiedene intravitale Mikroskopie-Setups (IVM) wurden für die Echtzeit-Bildgebung von Leukozyten-Endothel-Interaktionen in der pulmonalen Mikrozirkulation entwickelt, um diese Herausforderungen zu meistern. Solche Ansätze basieren auf der chirurgischen Freilegung und Stabilisierung der Lunge für die Bildgebung.

Tiere werden typischerweise durch chirurgische Eingriffe auf die Lungen-IVM vorbereitet. Zuerst werden die Tiere intubiert und beatmet, was die chirurgische Exzision eines Thoraxfensters und nachfolgende Eingriffe zur Stabilisierung der Lunge für die Bildgebung ermöglicht. Eine Technik besteht darin, das Parenchym auf ein Glasdeckglas³ zu kleben, ein Verfahren, das ein erhebliches körperliches Trauma für das abgebildete Gewebe riskiert. Fortgeschrittener ist die Verwendung eines Vakuumsystems zur Stabilisierung der Lunge unter einem Glasfenster⁴. Dieser Aufbau erleichtert die lose Haftung der Lungenoberfläche am Deckglas über ein reversibles Vakuum, das über einen großen lokalen Bereich verteilt ist, und dehnt die Lunge aus, während die Bewegung in den x-, y- und z-Dimensionen^{4 begrenzt wird}. Das Vakuum wird gleichmäßig durch einen Kanal aufgetragen, der den Bildgebungsbereich des Aufbaus umgibt, und zieht das Gewebe in einen flachen konischen Bereich, der dem bildgebenden Deckglas⁴ zugewandt ist. Durch dieses Sichtfenster kann die Mikrozirkulation der Lunge mit verschiedenen optischen Bildgebungsmodalitäten untersucht werden.

Lung IVM ermöglicht die quantitative Bildgebung einer Vielzahl von mikrozirkulatorischen Parametern. Dazu gehören Messungen wie Leukozytenspurgeschwindigkeit und -länge⁵, Flussgeschwindigkeit der roten Blutkörperchen⁶ und Oxygenierung⁷, Tumormetastasen⁸, die Unterscheidung von Immunzellsubpopulationen 9,10,11, Visualisierung von Mikropartikeln¹², Alveolardynamik 13,14^, Gefäßpermeabilität 15 und Kapillarfunktion ¹⁶ . Der Fokus liegt dabei auf der Leukozytenrekrutierung und Kapillarfunktion. Die Einleitung der Leukozytenrekrutierung in der pulmonalen Mikrozirkulation beinhaltet transiente Rollwechselwirkungen und fest adhäsive Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und Endothelzellen, die beide unter entzündlichen Bedingungen erhöht sind^16,17. Typischerweise wird das Rollen durch die Anzahl der Leukozyten quantifiziert, die eine vom Betreiber definierte Referenzlinie passieren, während die Adhäsion durch die Anzahl der Leukozyten quantifiziert wird, die auf dem Endothel¹⁶ unbeweglich sind. Die Kapillarfunktion kann auch in entzündlichen Zuständen beeinträchtigt sein, was oft zu einer verminderten Perfusion führt. Dies kann auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden, darunter eine Verringerung der Verformbarkeit roter Blutkörperchen¹⁸ und eine vielfältige Expression der induzierbaren NO-Synthase durch Endothelzellen, was zu einem pathologischen Rangieren¹⁹ führt. Typischerweise wird die Gesamtlänge der perfundierten Kapillaren pro Fläche gemessen und als funktionelle Kapillardichte (FCD) angegeben.

Die Untersuchung der Leukozytenrekrutierung in der Lunge in Echtzeit erfordert die Markierung biologischer Ziele mit Fluoreszenzfarbstoffen oder fluoreszenzmarkierten Antikörpern²⁰. Alternativ können verschiedene transgene Mausstämme wie Lysozym M-grün fluoreszierendes Protein (LysM-GFP) verwendet werden, um spezifische Immunzelluntergruppen wie Neutrophile^21,22 abzubilden. Die fluoreszenzmarkierten Leukozyten können dann mittels Weitfeldfluoreszenzmikroskopie, konfokaler Mikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie sichtbar gemacht werden. Diese Techniken erreichen Kontrast, indem sie spezifische Anregungswellenlängen verwenden und emittierte Fluoreszenz detektieren, während sie gleichzeitig die Detektion der Anregungswellenlänge blockieren und so das markierte Objekt hervorheben.

Bestehende Forschungen zur Quantifizierung von Leukozytenrollen, Adhäsion und funktioneller Kapillardichte in der murinen Lunge stützten sich hauptsächlich auf die manuelle Videoanalyse. Möglich wird dies durch Open-Source-Software wie Fiji^6,23, proprietäre Software wie CapImage¹² oder maßgeschneiderte Bildverarbeitungssysteme ²⁴. Umgekehrt ermöglichen verschiedene proprietäre Softwareplattformen (z. B. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) die automatisierte Messung einer Vielzahl anderer physiologischer Parameter, einschließlich vieler der zuvor hier genannten 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Wichtige Beobachtungen wurden in Bezug auf die Pathologie der akuten Lungenschädigung (ALI) und des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) unter Verwendung von Lungen-IVM gemacht. ARDS ist durch eine Vielzahl von pathophysiologischen Prozessen in der Lunge gekennzeichnet, einschließlich Lungenödem und Alveolarschäden, die durch eine Funktionsstörung des Endothels und der Epithelbarriere^{verursacht werden 25}. Unter Verwendung eines murinen Modells wurde festgestellt, dass Sepsis-induzierte ALI mit signifikanten schädlichen Veränderungen des Immunzelltransports in der Lungenumgebung assoziiert ist²⁶. Es wurde festgestellt, dass Neutrophile, die in den Kapillaren von Mäusen mit Sepsis-induziertem ALI rekrutiert wurden, die Mikrozirkulation behindern und dadurch die Hypoxie bei ALI²⁶ erhöhen. Darüber hinaus wurde IVM verwendet, um Einblicke in den zugrunde liegenden Reparaturmechanismus nach dem Einsetzen von ARDS²⁷ zu gewinnen. Die Lungen-IVM war auch ein wertvolles Werkzeug zum Verständnis pathophysiologischer Veränderungen bei verschiedenen obstruktiven Lungenerkrankungen. Zum Beispiel hat die Visualisierung des Schleimtransports bei Krankheiten wie Mukoviszidose (CF) und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) die Untersuchung neuartiger und bestehender Behandlungen für die Schleimentfernung^{erleichtert 28}. Der Leukozytenhandel unter diesen Bedingungen wurde ebenfalls^{analysiert 17}.

Dieses Protokoll erweitert den ursprünglich von Lamm et ^al.29 beschriebenen Ansatz, Leukozyten-Endothel-Wechselwirkungen unter Verwendung herkömmlicher Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Die beschriebenen Verfahren verwenden ein In-vivo-Lungenbildgebungssystem , das eine 16,5 cm x 12,7 cm große Metallbasis, einen Mikromanipulator und ein Vakuumbildgebungsfenster umfasst (Abbildung 1). Das System ist in einer 20 cm x 23,5 cm großen 3D-gedruckten Plattform (Supplemental File 1) montiert, um eine sichere Befestigung für den Ventilatorschlauch und das Heizkissen zu gewährleisten. Diese Methode bietet eine reproduzierbare und quantifizierbare Bildgebung der murinen pulmonalen Mikrozirkulation in vivo. Wichtige Aspekte der chirurgischen Vorbereitung sowie der ordnungsgemäße Einsatz eines vakuumstabilisierten Lungenbildgebungssystems werden ausführlich erläutert. Schließlich wird ein experimentelles Modell von ALI verwendet, um eine repräsentative Bildgebung und Analyse des veränderten Leukozytenrollens, der Leukozytenadhäsion und der Kapillarperfusion im Zusammenhang mit Entzündungen bereitzustellen. Die Verwendung dieses Protokolls soll weitere wichtige Untersuchungen zu pathophysiologischen Veränderungen der pulmonalen Mikrozirkulation während akuter Krankheitszustände erleichtern.

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden mit vorheriger Genehmigung des Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA) durchgeführt.

1. Vorbereitung

1. Lungenbildgebungssystem: Um das Fenster vorzubereiten, verabreichen Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf die Oberseite des äußeren Rings, während eine Kontamination des Vakuumkanals vermieden wird. Legen Sie einen sauberen 8 mm Glasabzug auf das Fenster und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, um eine Abdichtung zu erzeugen.
2. Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop: Führen Sie die Bildgebung mit einem herkömmlichen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop durch, das mit einem 20x/0,40-Objektiv mit langem Arbeitsabstand und einer Schwarz-Weiß-CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) mit einer Bildrate von 25 FPS ausgestattet ist. Wenden Sie einen 530-550 nm Bandpass-Anregungsfilter an, um Rhodamin-6G anzuregen, und einen 460-490 nm Bandpassfilter, um Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) anzuregen.
3. Vakuumsystem: Schließen Sie das Bildfenster an eine Vakuumpumpe an, die mit einem digitalen Manometer ausgestattet ist, das eine konstante Absaugung von 50-60 mmHg liefern kann, wie in Ergänzende Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, schließen Sie das Bildfenster über 1,0 mm I.D. Polyethylenschläuche, 1,0 cm I.D. Polyethylenschläuche, einen Vakuumkolben und einen Inline-0,2-μm-Filter an die Pumpe an.
4. Beatmungsgerät: Stellen Sie ein kleines Nagetierbeatmungsgerät ein, um eine druckgesteuerte Belüftung mit einer Rate und einem Volumen bereitzustellen, die auf dem Gewicht der Maus basieren. Geben Sie für die Dauer des Experiments einen positiven endexspiratorischen Druck (PEEP)bei 5 cmH 2 O an und stellen Sie den Zieldruck auf 20 cmH₂O ein.
5. Anästhesie: Mit einem Low-Flow-Anästhesie-Abgabesystem, Prime eine 5,0 ml Spritze mit 99,9% Isofluran. Verwenden Sie ein Abgasabsaugsystem, um das Risiko einer Inhalation durch den Chirurgen zu minimieren.

2. Anästhesie

1. Legen Sie eine 20-25 g 12 Wochen alte männliche C57Bl/6 Maus in die Anästhesie-Induktionskammer. Wenn die Kammer sicher geschlossen ist, beginnen Sie mit der Induktion mit Isoflurangas in einer Konzentration von 3% und einer Durchflussrate von 500 ml/min.
2. Sobald die Maus betäubt ist (visualisiert durch verlangsamte Atmungsrate), geben Sie sie auf den Intubationsständer und befestigen Sie die oberen Schneidezähne an der hängenden Naht.
3. Ziehen Sie die Naht fest, um die Schnauze im Nasenkegel zu befestigen. Beginnen Sie den Gasfluss durch den Nasenkegel in einer Konzentration von 2,5%.
4. Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen.

3. Intubation

1. Drehen Sie den Ständer so, dass die Rückseite des Ständers und die dorsale Seite der Maus dem Chirurgen zugewandt sind.
2. Führen Sie die Spitze eines 20 cm langen Glasfaserkabels durch eine 20 G endotracheale Kanüle und tauchen Sie die Spitze in Lidocain HCl (1%), um den Durchgang des Kabels durch den Kehlkopf zu erleichtern.
3. Heben Sie mit stumpfen Pinzetten den Unterkiefer an und verschieben Sie die Zunge, um einen freien Durchgang in die Atemwege zu gewährleisten.
4. Setzen Sie ein modifiziertes Otoskop ein (~60° Spekulumfangsumfang entfernt), so dass die oberen Schneidezähne in den Spalt im Spekulum passen. Passen Sie das Zielfernrohr und die Zungenposition an, bis die Epiglottis und die Stimmbänder deutlich sichtbar sind.
5. Führen Sie das mit der Endotrachealkanüle beladene Lichtwellenleiter durch den Spalt im Spekulum und in den Kehlkopf ein. Mit kleinen kreisenden Bewegungen führen Sie das Kabel durch die Stimmbänder und in die Luftröhre.
6. Schieben Sie die Kanüle entlang des Glasfaserkabels und führen Sie zwischen den Stimmbändern in die Luftröhre.

4. Belüftung

1. Holen Sie die Maus aus dem Intubationsständer und legen Sie sie auf ein Heizkissen in der rechten seitlichen Dekubitusposition.
2. Schließen Sie die Kanüle an den Beatmungsschlauch an und starten Sie das Beatmungsgerät. Reduzieren Sie die Anästhesiekonzentration auf 1,5% und überwachen Sie die Tiefe, indem Sie auf Pedalreflex testen. Wenn der Reflex anhält, erhöhen Sie die Konzentration schrittweise auf bis zu 2%.
3. Geben Sie Tränengel in die Augen der Maus, um ein Austrocknen zu verhindern.
4. Befestigen Sie die Kanüle mit medizinischem Klebeband an der Schnauze. Beschriftungsband befestigen Sie die rechte Vorderpfote am Heizkissen in etwa der 9-Uhr-Position. Strecken Sie die linke Hinterpfote kaudal aus und sichern Sie sich ungefähr in der 6-Uhr-Position.
5. Dehnen Sie die linke Vorderpfote mit einem Stoffband leicht in die 12-Uhr-Position und befestigen Sie das andere Ende des Bandes an der Oberseite der IVM-Plattform, wie in Abbildung 2A dargestellt (die Aufrechterhaltung einer leichten Spannung erleichtert hier die anschließende Thorakotomie).
6. Setzen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein und befestigen Sie den Fühler, indem Sie ihn an das Heizkissen kleben. Legen Sie ein Pulsoximeter auf die rechte Hinterpfote und befestigen Sie es am Heizkissen, wobei Sie darauf achten, die Durchblutung nicht zu stören.
7. Sobald die Temperatur bei 37,0 ° C ± 0,1 ° C stabil ist, fahren Sie mit der Thorakotomie fort.

5. Thorakotomie

1. Sterilisieren Sie den Thorax und den Bauch mit einem 70% igen Alkoholtuch. Tragen Sie eine leichte Schicht Mineralöl auf, um das Haar auf der linken Seite der Maus zu befeuchten - vom Brustbein bis zur Wirbelsäule und von der Schulter bis zum Boden des Brustkorbs.
2. Machen Sie mit stumpfer Pinzette und gerader Schere einen kleinen Längseinschnitt in der Nähe des Bodens des Brustkorbs, um die darunter liegende Muskelschicht freizulegen.
3. Wenn Sie sich ventral bewegen, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um das Epithel- und Fettgewebe von der Muskelschicht zu trennen. Kauterisieren Sie alle exponierten Blutgefäße. Sobald das Risiko eines Blutverlustes gemindert wurde, verlängern Sie den ursprünglichen Schnitt ventral bis zum xiphoiden Prozess.
4. Wiederholen Sie diesen Vorgang dorsal bis ~ 5 mm seitlich zur Wirbelsäule.
5. Wenn Sie sich schädelig bewegen, verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um den Brustkorb freizulegen. Kauterisieren Sie alle exponierten Blutgefäße, um die hämodynamische Stabilität zu erhalten.
6. Sobald das Risiko eines Blutverlustes gemindert wurde, verlängern Sie den Einschnitt vom Xiphoid-Prozess auf die Achselhöhle.
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der dorsalen Seite des Einschnitts, bis Sie dem linken Ohr ~ 1 cm unterlegen sind.
8. Greifen Sie mit einer hämostatischen Pinzette das sezierte Epithel- und Fettgewebe und entfernen Sie das Operationsgebiet (Abbildung 2B).
9. Injizieren Sie eine Lösung von Rhodamin-6G (0,5 mg/ml; 1,5 ml/kg) zur Visualisierung von Leukozyten und Rinder-FITC-Albumin (50 mg/ml; 1 ml/kg) zur Visualisierung der Kapillarperfusion über die Schwanzvene.
10. Greifen Sie mit einer Zahnzange die Rippe unmittelbar niedriger als die Position der Lungenbasis bei der Endinspiration und ziehen Sie sie leicht zurück, um die Rippe von der Lunge wegzuziehen. Schneiden Sie die Rippe ab, um einen Pneumothorax zu induzieren.
11. Verlängern Sie den Schnitt seitlich entlang des Interkostalmuskels in beide Richtungen und achten Sie darauf, die freiliegende Lungenoberfläche nicht zu berühren.
12. Greifen Sie mit stumpfer Pinzette die nächsthöhere Rippe und ziehen Sie sie leicht zurück, damit die Lunge von der Brustwand abfallen kann. Wenn sich die Lunge nicht löst, drücken Sie die Brustwand leicht gegen die Lunge, damit die Lunge an der darunter liegenden Pleura haftet und somit leichter abfällt.
13. Setzen Sie den ursprünglichen Schnitt ventral bis zum Brustbein und kranial fort, bis die Spitze der Lunge freigelegt wird. Verwenden Sie Baumwollapplikatoren und Gaze, um auftretende Blutungen zu mildern.
14. Heben Sie den Brustkorb an, um interkostale Blutgefäße auf dem dorsalen Aspekt der Brusthöhle freizulegen. Achten Sie darauf, die Lunge nicht zu schädigen, kauterisieren Sie das unterlegenste Interkostalgefäß in der Nähe der Wirbelsäule und schneiden Sie dann die Rippe ab. Bewegen Sie sich kranial und ventral, wiederholen Sie den Vorgang, bis ein etwa 1 cm x 1,5 cm großer Teil des Brustkorbs ausgeschnitten ist (Abbildung 2C).
15. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeitsansammlungen in der Brusthöhle durch Kapillarwirkung mit kleinen Mullstreifen.
16. Während Sie mit der Mikroskopie fortfahren, lassen Sie ~ 5 Minuten für die intrapleurale Flüssigkeit zerstreuen, um eine sicherere Schnittstelle zwischen der Lunge und dem Bildgebungsfenster zu schaffen.

6. Mikroskopie

1. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und stellen Sie den Druck auf ~50–60 mmHg ein.
2. Übertragen Sie die IVM-Plattform auf die Mikroskopstufe. Positionieren Sie den Metallpfosten und den Mikromanipulator so, dass sich das Bildfenster direkt über der freiliegenden Lunge befindet und sich der Fensterarm der Lunge von ungefähr der 3-Uhr-Position nähert.
3. Senken Sie das Bildgebungsfenster vorsichtig mit dem Mikromanipulator ab, bis es an der Lungenoberfläche haftet und diese stabilisiert (Abbildung 3A).
4. Identifizieren Sie mit dem 20-fachen Objektiv und dem 460-490-nm-Bandpass-Erregungsfilter eine Lungenvenule basierend auf dem konvergenten Muster des Blutflusses. Zentriere das Schiff im Sichtfeld und zeichne 30 s Video auf.
   1. Wechseln Sie zum Bandpass-Erregerfilter 530-550 nm und nehmen Sie 30 s Video im selben Sichtfeld auf.
   2. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis fünf Lungenvenolen abgebildet wurden.
5. Identifizieren Sie mit dem Bandpass-Erregungsfilter 460-490 nm eine Lungenarteriole basierend auf dem divergenten Muster des Blutflusses. Zentriere das Schiff im Sichtfeld und zeichne 30 s Video auf.
   1. Wechseln Sie zum Bandpass-Erregerfilter 530-550 nm und nehmen Sie 30 s Video im selben Sichtfeld auf.
   2. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis fünf Lungenarteriolen abgebildet wurden.
6. Lokalisieren Sie mit dem Bandpass-Anregungsfilter 460-490 nm einen Bereich von Alveolen und Kapillaren, der nicht von größeren Gefäßen durchschnitten wird, und zeichnen Sie 30 s Video auf.
   1. Wechseln Sie zum Bandpass-Erregerfilter 530-550 nm und nehmen Sie 30 s Video im selben Sichtfeld auf.
   2. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis fünf Kapillarregionen abgebildet sind.

7. Euthanasie und Reinigungsprotokoll

1. Entfernen Sie die IVM-Plattform von der Mikroskopstufe und passen Sie die Isofluranabgabe für 5 Minuten auf 5% an, um die Maus einzuschläfern.
2. Entsorgen Sie während des Wartens das Deckglas und trennen Sie das Bildfenster von der Plattform. Reinigen Sie das Bildfenster mit einer kleinen Bürste und verwenden Sie eine 30-G-Spritze, die in den Kanal eingeführt wird, um es mehrmals mit destilliertem Wasser zu spülen. Dann mit der Vakuumpumpe mit 95% Ethanol spülen.
3. Nach Ablauf von 5 Minuten stoppen Sie das Beatmungsgerät und sorgen Sie für eine vollständige Euthanasie durch Zervixdislokation.

Um die durch dieses Protokoll erreichbaren Ergebnisse zu veranschaulichen, wurde die akute Lungenverletzung (ALI) 6 h vor der Bildgebung unter Verwendung eines Modells der intranasalen bakteriellen Lipopolysaccharid-Instillation (LPS) induziert. Kurz gesagt, Mäuse (n = 3) wurden mit Isofluran betäubt, und kleine Tröpfchen von LPS aus Pseudomonas aeruginosa in steriler Kochsalzlösung (10 mg / ml) wurden in einer Dosierung von 5 mg / kg in die linke Naris pipettiert. Dies wurde mit naiven Mäusen verglichen (n = 3; keine intranasale Verabreichung).

Bei der Bildgebung ist eine erfolgreiche chirurgische Vorbereitung durch mehrere Faktoren identifizierbar. Die Lunge sollte relativ stabil sein, wobei die Atmung zyklische Rahmenverschiebungen von nicht mehr als 25 μm verursacht. Die Alveolen sollten deutlich sichtbar sein und können eine Gezeitendehnung / -kontraktion aufweisen. Die Anregung durch blaues Licht (450-490 nm Wellenlänge) ermöglicht die Visualisierung der Direktionalität des Blutflusses, und es kann möglich sein, einzelne rote Blutkörperchen zu unterscheiden (Supplemental Movie 1, Supplemental Movie 3 und Supplemental Movie 5). Leukozyten werden bei Anregung durch grünes Licht (530-560 nm Wellenlänge, Supplemental Movie 2, Supplemental Movie 4 und Supplemental Movie 6) eindeutig identifizierbar sein. Nach Abschluss der Bildgebung und Entfernung des Saugfensters kann es zu leichten Blutergüssen der Lungenoberfläche kommen, wenn auch nicht innerhalb des abgebildeten Bereichs, wie in Abbildung 3B dargestellt.

Mehrere technische Herausforderungen können die experimentelle Durchführbarkeit beeinträchtigen. Die Ansammlung von Blut auf der Lungenoberfläche beeinträchtigt die Vakuumstabilisierung und kann sogar den Kanal verstopfen. Um dies zu vermeiden, ist bei jedem Operationsschritt äußerste Vorsicht geboten. Ein zu hoher Vakuumdruck kann die Lunge schädigen und die Mikrozirkulation beeinträchtigen. Dies kann durch Alveolarstauung oder übermäßige Blutergüsse an der Lungenoberfläche erkennbar sein (Abbildung 3C) und kann durch Druckreduzierung der Vakuumpumpe behoben werden. Außerdem können Fehler bei der intravenösen Fluorophorinjektion zu einer schlechten Visualisierung des Leukozytenhandels und des Blutflusses führen.

Nach Abschluss des Protokolls wurde die blinde manuelle Analyse mit Fidschi²¹ in einer Weise durchgeführt, die der vorherigen Literatur²⁸ entsprach. Fünf Venolen, Arteriolen und Kapillarregionen von Interesse (ROIs) wurden von jedem Tier analysiert. Die Leukozytenadhäsion in Venolen und Arteriolen wurde definiert als die Anzahl der Zellen, die während 30 s Beobachtung pro Bereich der Endotheloberfläche am vaskulären Endothel haften bleiben. Dies wird in Zellen/mm² weitergeleitet. Die Leukozytenadhäsion in Kapillaren wurde definiert als die Anzahl der Zellen innerhalb des ROI, die während 30 s Beobachtung pro analysierter Gesamtfläche am vaskulären Endothel haften bleiben. Dies wird auch in Zellen/mm² weitergeleitet. Leukozytenrollen war definiert als die doppelte Anzahl von Zellen, die während des Beobachtungszeitraums von 30 s einen Referenzpunkt im Gefäß passierten. Frei fließende Leukozyten wurden ausgeschlossen, indem die Durchgangsgeschwindigkeit mit der des Flusses der roten Blutkörperchen verglichen wurde, und dies wird in Zellen / min übertragen. Um die mikrozirkulatorische Perfusion zu messen, wurde FCD als die Summe der Längen der mit roten Blutkörperchen durchbluteten Kapillaren pro Beobachtungsgebiet definiert. Dies wird in cm/cm² übertragen. Jeder Parameter wird als Mittelwert für jedes Tier gemeldet.

Ein häufiger Trend der Leukozytenrekrutierung wurde bei Lungenvenulen beobachtet, mit erhöhter Adhäsion und Rollen bei LPS-behandelten Mäusen im Vergleich zu naiven (Abbildungen 4C, D). Dieser Trend wurde durch die Adhäsion der arteriolaren Leukozyten rekapituliert, obwohl sowohl die Roll- als auch die Adhäsionsstufen in der naiven Gruppe sehr unterschiedlich waren (Abbildungen 5C, D). Insbesondere führte die LPS-Verabreichung zu einem erheblichen Anstieg der Leukozytenadhäsion in den ROIs der Lungenkapillare (Abbildung 6C). LPS-Mäuse zeigten auch eine reduzierte FCD im Vergleich zu naiven Mäusen (Abbildung 7C). Diese Effekte innerhalb der Lungenkapillaren stimmen mit der früheren Literatur überein, die einen Anstieg der Immunzellen pro Sichtfeld und eine Störung der normalen Kapillarperfusion nach verschiedenen Entzündungsreizen identifiziert ^4,5,16.

Abbildung 1: Lungenbildgebungssystem. Das kundenspezifische Bestellsystem umfasst (1) eine eloxierte Metallbasis, (2) ein Bildgebungsfenster, (3) einen Vakuumeinlass und (4) einen Mikromanipulator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Chirurgische Vorbereitung. (A) Die Maus wird an der IVM-Plattform in der rechten lateralen Dekubitusposition befestigt. (B) Ribcage wird mittels stumpfer Dissektion exponiert, um die Hämodynamik zu erhalten. (C) Die Thorakotomie wird durchgeführt, um die linke Lunge freizulegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Vakuumstabilisierung. (A) Die Anwendung des Vakuumbildfensters stabilisiert die Lungenoberfläche. (B) Die Verwendung von Vakuumdrücken unter 75 mmHg minimiert die Schädigung der Lunge, insbesondere im abgebildeten Bereich. (C) Höhere Vakuumdrücke können zu erheblichen Blutergüssen führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Leukozytenhandel in Lungenvenolen. Die Anregung von Rhodamin 6G ermöglicht die Visualisierung von adhärenten und rollenden Leukozyten. Umrissene Bereiche stellen analysierte Teile des vaskulären Endothels dar, die durch Anregung von FITC-Albumin bei (A) naiven und (B) LPS-behandelten Mäusen bestätigt werden. (C,D) Die intranasale LPS-Verabreichung wirkt sich auf das Rollen und die Adhäsion von Leukozyten in Lungenvenulen aus. Werte werden als Mittelwert ± SD angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Leukozytentransport in Lungenarteriolen. Die Anregung von Rhodamin 6G ermöglicht die Visualisierung von adhärenten und rollenden Leukozyten. Umrissene Bereiche stellen analysierte Teile des vaskulären Endothels dar, die durch Anregung von FITC-Albumin bei (A) naiven und (B) LPS-behandelten Mäusen bestätigt werden. (C,D) Die intranasale LPS-Verabreichung wirkt sich auf das Rollen und die Adhäsion von Leukozyten in den Lungenarteriolen aus. Werte werden als Mittelwert ± SD angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Adhärent Leukozyten in Lungenkapillaren. Die Anregung von Rhodamin 6G ermöglicht die Visualisierung von Leukozyten innerhalb von ROIs in (A) naiven und (B) LPS-behandelten Mäusen. (C) Die intranasale LPS-Verabreichung wirkt sich auf die Leukozytenadhäsion bei LPS-behandelten Mäusen aus. Werte werden als Mittelwert ± SD angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Pulmonale Kapillarfunktion. Die Anregung von FITC-Albumin ermöglicht die Visualisierung des kapillaren Blutflusses innerhalb von ROIs bei (A) naiven und (B) LPS-behandelten Mäusen. (C) Die intranasale LPS-Verabreichung wirkt sich auf FCD in Lungenkapillaren aus. Werte werden als Mittelwert ± SD angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei: Datei für 3D-druckbare IVM-Plattform. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Diagramm des Vakuumsystems. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzender Film 1: Beispielvideo des Blutflusses in der Lungenvene. Der grüne Pfeil zeigt die Richtung des Blutflusses an. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 2: Beispielvideo des Handels mit Leukozyten in der Lungenvenule. Rote Pfeile kennzeichnen adhärente Leukozyten innerhalb des Gefäßes. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 3: Beispielvideo des Blutflusses in der Lungenarteriole. Der grüne Pfeil zeigt die Richtung des Blutflusses an. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 4: Beispielvideo des Leukozytenhandels in Lungenarteriolen. Rote Pfeile kennzeichnen anhaftende Leukozyten innerhalb eines Gefäßes. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 5: Beispielvideo des Blutflusses in Lungenkapillaren. Grüne Pfeile kennzeichnen mehrere gut visualisierte Bereiche von roten Blutkörperchen-durchbluteten Kapillaren. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Supplemental Movie 6: Beispielvideo des Handels mit Leukozyten in Lungenkapillaren. Rote Pfeile kennzeichnen adhärente Leukozyten im Sichtfeld. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Das hier vorgestellte Protokoll erfordert Übung und Aufmerksamkeit für einige kritische Schritte. Zunächst ist es wichtig, das Bildgebungsfenster vor Beginn der Intubation und Operation vorzubereiten. Verwenden Sie eine minimale Menge an Vakuumfett, um den äußeren Ring des Bildfensters zu beschichten, tragen Sie das Deckglas auf und testen Sie die Absaugung mit einem Tropfen destilliertem Wasser. Wenn Sie dies im Voraus vorbereiten, wird verhindert, dass die exponierte Lunge während des Setups austrocknet. Während es möglich ist, mit warmer Kochsalzlösung zu spülen, kann dies das Risiko eingehen, das zerbrechliche Lungengewebe zu schädigen.

Nach der Intubation, während der Übertragung der Maus auf die IVM-Plattform, kann die Kanüle gelegentlich verschoben werden. Um dies zu verhindern, sollten Sie die Kanüle an die Vorderzähne der Maus binden oder an die Haut um ihren Mund nähen. Bei druckgesteuerter Belüftung sollte das Tidalvolumen während des gesamten Verfahrens sorgfältig überwacht werden. Es sollte bei etwa 0,20 ml stabil bleiben, da deutlich niedrigere Werte (z. B. ~ 0,10 ml) auf eine einzelne Lungenbeatmung hinweisen können. In diesem Fall kann das Problem durch leichtes Zurückziehen der Endotrachealkanüle behoben werden. Die Verwendung von Inhalationsanästhesie (Isofluran) erleichtert die Kontrolle der Anästhesietiefe, während die Maus beatmet wird. Andere Mittel der Anästhesie (z. B. intravenöses Ketamin / Xylazin^10,11) wurden von anderen Laboratorien eingesetzt^, und jedes hat seine jeweiligen Vor- und Nachteile.

Während der Operation wird eine stumpfe Dissektion eingesetzt, um das Risiko einer Durchtrennung der Blutgefäße zu minimieren. Dies ist von besonderer Bedeutung bei der Sezierung des dicken und stark vaskularisierten Fettgewebes in der Nähe der Schulter. Die Resektion des Brustkorbs erfordert sowohl Geschwindigkeit als auch Genauigkeit. Die Hitze des Kauterisators ist intensiv genug, um die Lunge zu verbrennen, wenn sie übermäßig verwendet wird. Beim Sezieren des Brustkorbs sollte zwischen der Lunge und der Brustwand ein leerer Raum vorhanden sein. Wenn die Lunge an der Brustwand haftet, fördert das leichte Drücken auf die Außenseite des Brustkorbs die Haftung an der darunter liegenden parietalen Pleura. Alternativ können Sie eine stumpfe Nadel verwenden, um eine kleine Menge warmer Kochsalzlösung zwischen der Lunge und dem Brustkorb zu injizieren, um die Freisetzung zu erleichtern. Es wird empfohlen, den Fensterarm auf der 3-Uhr-Position zu positionieren, um einen unerwünschten Druck auf die Rippen während der Bildgebung zu vermeiden (Abbildung 3A). Es wird auch mehr Abstand zwischen dem Mikromanipulator und dem Mikroskopobjektiv lassen, was einen leichteren Zugang für Manipulationen ermöglicht. Beim Absenken des Bildgebungsfensters ist es wichtig, den zentralen Bereich der Lunge anzuvisieren, da der Kontakt mit der Kante zu einer unzureichenden Abdichtung und einem übermäßigen Bewegungsartefakt während der Bildgebung führt. Auch mehrere Versuche, das Fenster herunterzulassen, können die Lunge beschädigen. Ebenso tragen Zyklen der Ablösung und Restabilisierung zu Lungenverletzungen bei und können die experimentelle Genauigkeit beeinträchtigen. Bei korrekter Durchführung ist das hier vorgestellte Präparat jedoch stabil genug, um eine hochauflösende intravitale Bildgebung mit einem 20-fachen Objektiv zu ermöglichen.

Ein strenges Reinigungsprotokoll ist notwendig, um eine Kontamination und Verstopfung des Vakuumkanals innerhalb des Bildgebungsfensters zu verhindern. Die Verwendung einer 30-G-Nadel unmittelbar nach den Experimenten, um wiederholt mit destilliertem Wasser zu spülen, ist wirksam, um die meisten Verunreinigungen zu entfernen. Es folgt eine Spülung mit konzentriertem Ethanol und eine abschließende Spülung mit destilliertem Wasser, bevor sie wieder an die Vakuumleitung angeschlossen wird, um Feuchtigkeit zu entfernen. Die Verwendung von Aceton oder starken Reinigungsmitteln kann ausreichen, um schwerwiegende Blockaden zu lösen, falls sie auftreten.

Insbesondere verwendet dieses Protokoll eine höhere Anzeige des Vakuumdrucks im Vergleich zu einigen anderen berichteten Methoden ^4,11, und dies kann Bedenken hinsichtlich einer Schädigung des Lungengewebes aufwerfen. Ein wichtiger Unterschied ist jedoch, dass das hier verwendete digitale Messgerät den Druck nur an der Vakuumpumpe misst. Dieser Druck wird durch schmale Schläuche und den extrem schmalen Kanal des Bildgebungsfensters selbst abgegeben, bevor er über eine größere Oberfläche der Lunge verteilt wird. Daher wurden in diesen Experimenten nach intravitalen Sitzungen keine Hinweise auf eine Schädigung der abgebildeten Region beobachtet. Darüber hinaus zeigten die abgebildeten Alveolen eine Gezeitendehnung und -kontraktion, was darauf hindeutet, dass dieses physiologische Phänomen nicht signifikant gestört war.

Trotz der zunehmenden Beliebtheit der Lungen-IVM als Werkzeug zur Untersuchung von Krankheiten in vivo gibt es Einschränkungen für diese Technik. Erstens induziert die invasive und terminale Natur der Operation eine nicht zu vernachlässigende Wirkung auf den physiologischen Zustand der Maus und beschränkt das Verfahren auf eine einzige Bildgebungssitzung. Es sollte jedoch beachtet werden, dass mehrere Längslungen-IVM-Ansätze^{entwickelt wurden 30}. Zweitens kann die Verwendung von mechanischer Beatmung einen Grad an beatmungsassoziierter Lungenverletzung (VALI)³¹ induzieren, obwohl dies durch die kurze Dauer des Verfahrens begrenzt ist. Drittens kann der Kontakt zwischen der viszeralen Pleura und dem Glasdeckel und die Anwendung von Vakuumdruck zu einem veränderten mikrovaskulären Blutfluss führen. Schließlich besteht die vielleicht bedeutendste Einschränkung dieses Ansatzes darin, dass die Bildgebung auf subpleurale Alveolen in nicht abhängigen Lungenregionen beschränkt ist, die nicht repräsentativ für die gesamte Lunge^{sind 32}.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um Leukozyten-Endothel-Interaktionen in der pulmonalen Mikrovaskulatur mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen. Während diese Experimente Endotoxin-induzierte Lungenverletzungen verwenden, ein akutes Modell, das auf der Grundlage früherer Forschungen ausgewählt wurde, kann dieses Protokoll auch angepasst werden, um andere pathologische und physiologische Prozesse in der Lunge zu untersuchen. Darüber hinaus ist das hier verwendete Lungenbildgebungssystem für eine Reihe von Mikroskopieansätzen geeignet, und das Bildgebungsfenster ist groß genug, um Öl-Tauchobjektive mit hoher numerischer Apertur aufzunehmen. Daher sollen die beschriebenen Verfahren die weitere Erforschung der Auswirkungen verschiedener Krankheitszustände auf die pulmonale Mikrozirkulation erleichtern.

Dr. Kamala D. Patel ist Präsidentin und Mitbegründerin von Luxidea, dem Unternehmen, von dem das in diesem Experiment verwendete Bildgebungsfenster gekauft wurde.

Die Autoren danken Dr. Pina Colarusso, die bei der Bearbeitung und Überarbeitung dieses Manuskripts eine bedeutende Expertise zur Verfügung gestellt hat.