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* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Die Infektion von neonatalen Mäusen mit biolumineszierendem E. coli O1:K1:H7 führt zu einer septischen Infektion mit signifikanter Lungenentzündung und Lungenpathologie. Hier beschreiben wir Verfahren zur Modellierung und weiteren Untersuchung der neonatalen Sepsis unter Verwendung von längsinaler intravitaler Bildgebung parallel zur Aufzählung systemischer bakterieller Belastungen, entzündlicher Profilierung und Lungenhistopathologie.
Neonate haben ein erhöhtes Risiko für bakterielle Sepsis aufgrund des einzigartigen Immunprofils, das sie in den ersten Lebensmonaten zeigen. Wir haben ein Protokoll zur Untersuchung der Pathogenese von E. coli O1:K1:H7, einem Serotyp, der für hohe Sterblichkeitsraten bei Neonaten verantwortlich ist, erstellt. Unsere Methode nutzt intravitale Bildgebung von neonatalen Welpen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Fortschreitens der Infektion. Diese Bildgebung, parallel zur Messung von Bakterien im Blut, entzündliche Profilierung und Gewebehistopathologie, bedeutet einen strengen Ansatz zum Verständnis der Infektionsdynamik während der Sepsis. Im aktuellen Bericht modellieren wir zwei infektiöse Inokulaums zum Vergleich der bakteriellen Belastungen und der Schwere der Krankheit. Wir stellen fest, dass subscapulare Infektion führt zu einer disseminierten Infektion durch 10 h Post-Infektion. Bis 24 h war eine Infektion mit lumineszierendem E. coli im Blut, in der Lunge und anderen peripheren Geweben reichlich vorhanden. Die Expression von entzündlichen Zytokinen in der Lunge ist bei 24 h signifikant, gefolgt von einer zellulären Infiltration und Hinweisen auf Gewebeschäden, die mit der infektiösen Dosis zunehmen. Intravital-Bildgebung hat einige Einschränkungen. Dazu gehören eine leuchtende Signalschwelle und einige Komplikationen, die bei Neonaten während der Anästhesie auftreten können. Trotz einiger Einschränkungen stellen wir fest, dass unser Infektionsmodell einen Einblick bietet, um die Dynamik der Längsinfektion bei neonataler muriner Sepsis zu verstehen, die bis heute nicht gründlich untersucht wurde. Wir erwarten, dass dieses Modell auch angepasst werden kann, um andere kritische bakterielle Infektionen im frühen Leben zu untersuchen.
Bakterielle Sepsis ist ein wichtiges Anliegen für Neonate, die ein einzigartiges Immunprofil in den ersten Tagen des Lebens aufweisen, die keinen angemessenen Schutz vorInfektionenbieten 1 . Neonatale Sepsis ist nach wie vor ein erhebliches US-Gesundheitsproblem, das mehr als 75.000 Fälle pro Jahr allein in den USA ausmacht2. Um diese Infektionen eingehend zu untersuchen, sind neuartige Tiermodelle erforderlich, die Aspekte menschlicher Krankheiten rekapitulieren. Wir haben ein neonatales Mausinfektionsmodell mit Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli ist die zweithäufigste Ursache für neonatale Sepsis in den USA, ist aber für die Mehrheit der Sepsis-assoziierten Sterblichkeit4,5verantwortlich. Es ist jedoch die Hauptursache, wenn Vor- und sehr niedrige Geburtsgewicht (VLBW) Babys unabhängig betrachtet werden5. Der K1-Serotyp wird am häufigsten mit invasiven Blutkreislaufinfektionen und Meningitis bei Neonaten6,7in Verbindung gebracht. Derzeit gibt es keine anderen Behandlungsmöglichkeiten als Antibiotika und unterstützende Pflege. In der Zwischenzeit steigen die Antibiotikaresistenzraten für viele pathogene Bakterien weiter an, wobei einige Stämme von E. coli gegen eine Vielzahl von Antibiotika resistent sind, die häufig in der Behandlung verwendet werden8. Daher ist es unerlässlich, dass wir weiterhin Methoden generieren, um die Mechanismen der Sepsis und die Wirtsreaktion in Neonaten zu untersuchen. Diese Ergebnisse können dazu beitragen, aktuelle Behandlungen und Infektionsergebnisse zu verbessern.
Der Immunzustand von Neonaten ist sowohl durch phänotypische als auch funktionelle Unterschiede im Vergleich zu Erwachsenen gekennzeichnet. Zum Beispiel, erhöhte Konzentrationen von entzündungshemmenden und regulatorischen Zytokinen, wie Interleukin (IL)-10 und IL-27, haben gezeigt, dass durch Nabelschnurblut-abgeleitete Makrophagen produziert werden und sind in höheren Konzentrationen im Serum der murinen Neonate9,10,11. Dies stimmt mit niedrigeren IFN-α-, IFN-ɣ-, IL-12- und TNF-α überein, die häufig von neonatalen Zellen im Vergleich zu erwachsenen Pendants berichtet werden10. Darüber hinaus ist das neonatale Immunsystem in Richtung einer Th2 und regulatorischen T-Zell-Antwort im Vergleich zu Erwachsenen12verzerrt. Erhöhte Anzahl von Neutrophilen, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten sind auch in Neonaten vorhanden, aber mit erheblichen funktionellen Beeinträchtigungen. Dazu gehören Defekte in der Expression von Zelloberflächenmarkern und Antigendarstellungen, die auf Unreife13,14,15hindeuten. Darüber hinaus sind neonatale Neutrophile signifikant mangelhaft in ihrer Fähigkeit, zu chemotaktischen Faktoren zu migrieren16. Myeloide-abgeleitete Suppressorzellen (MDSCs) sind auch auf erhöhten Niveaus in Neonaten gefunden und vor kurzem gezeigt, dass eine Quelle von IL-2711. MDSCs sind gegenüber T-Zellen17stark unterdrückend. Zusammen zeigen diese Daten Einschränkungen der neonatalen Immunität, die eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen verleihen.
Um das Fortschreiten der bakteriellen Belastung zu untersuchen und schützende Wirtsimmunreaktionen während einer neonatalen Sepsis zu sezieren, haben wir ein neuartiges Infektionsmodell entwickelt. Neonatale Mäuse an den Tagen 3-4 des Lebens sind schwierig, in den intraperitonealen Raum oder Schwanz Vene zu injizieren. In unserem Modell werden Tag 3 oder 4 Welpen das bakterielle inokulum oder PBS subkutan in den Skapulierbereich verabreicht. Eine systemische Infektion entwickelt sich und mit lumineszierenden E. coli O1:K1:H7 können wir einzelne neonatale Mäuse längs abbilden, um der verbreiteten bakteriellen Belastung in peripheren Geweben zu folgen. Dies ist das erste gemeldete Modell, um intravitale Bildgebung zu nutzen, um die Kinetik der Verbreitung von Bakterien während der Sepsis in murinen Neonaten zu verstehen3.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induzieren septischer E. coli-Infektionen bei neonatalen Mäusen3. Wir beschreiben, wie man das bakterielle Inokulum für die Injektion vorbereitet und wie man Gewebe für die Beurteilung der Pathologie, die Messung von Entzündungsmarkern durch Genexpressionsanalyse und die Aufzählung der bakteriellen Belastung erntet. Darüber hinaus wird die Verwendung von lumineszierendem E. coli für die intravitale Bildgebung infizierter Neugeborenen und die Quantifizierung der bakteriellen Tötung durch neonatale Immunzellen beschrieben. Diese Protokolle können auch angepasst werden, um andere wichtige bakterielle Infektionen bei Neonaten zu untersuchen. Die hier vorgestellten Daten stellen einen neuartigen Gesamtansatz zum Verständnis der Infektionsdynamik in einem übersetzbaren neonatalen Sepsismodell dar.
Alle Verfahren wurden von den West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees genehmigt und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durch den National Research Council18durchgeführt.
1. Herstellung von bakteriellem Inokulum
2. Tieridentifikation
3. Subkapitulare Impfung
HINWEIS: Für diese Studie wurden 2 Experimente mit einer für jedes Experiment bestimmten Niedrig- und Hochdosisgruppe durchgeführt. Im ersten Experiment erhielten 7 Welpen das niedrig dosierte Inokulum (4 Welpen wurden als Kontrollen verwendet), und 5 Welpen aus einem separaten Wurf erhielten die hohe Dosis (3 Welpen wurden als Kontrollen verwendet). Die Welpen aus Experiment 1 lieferten Daten nur für den 24-Stunden-Zeitpunkt. Im zweiten Experiment erhielten 8 Welpen das niedrig dosierte Inokulum (2 Welpen wurden als Kontrollen verwendet), und 6 Welpen erhielten das hochdosierte Inokulum (2 Welpen wurden als Kontrollen verwendet). Welpen aus Experiment 2 lieferten Daten für die 0-, 10- und 24-Stunden-Zeitpunkte.
4. Bewertung von Krankheits- und Endpunktkriterien
5. In-vivo-Bildgebung der bakteriellen Belastung
6. Euthanasie
7. Gewebeernte
8. RNA-Isolierung aus Lungengewebe zur Genexpression
9. cDNA-Synthese
10. Echtzeit-quantitativer PCR-Zyklus (qPCR)
11. Lungenhistopathologie
12. In-vitro-Bakterien-Tötungstest
Dieses Protokoll induzierte bakterielle Sepsis bei neonatalen Mäusen, und wir verwendeten Längsinalintravital-Bildgebung, Aufzählung von Bakterien im Blut, histologische Bewertungen der Pathologie und entzündliche Zytokin-Expressionsprofile, um den Krankheitsverlauf zu untersuchen. Anzeichen einer Morbidität wurden bei neonatalen Welpen beobachtet, die sowohl mit niedrigen (2 x 106 KBE) als auch mit hohen E.coli-Inokulumen (ca. 7 x 106 KBE) infiziert waren. Welpen, die das größere Inokulum erhielten, zeigten prominentere Anzeichen von Bedrängnis, die eingeschränkte Beweglichkeit, die Unfähigkeit, ihre Körperhaltung zu korrigieren, und eine eingeschränkte Fähigkeit, eine aufrechte Position um 24 h nach der Infektion (hpi) zu halten. Es gab jedoch eine Reihe von Morbidität, da einige Welpen schlimmer erschienen als andere. Unmittelbar nach der Infektion starb ein niedrig dosiertes Tier an isoflurane-Exposition während einer Bildgebungssitzung, um die Ausgangsbasis zu bestimmen. Mit 24 PSi erlagen zwei von sechs hochdosierten Tieren der systemischen Infektion (33,3% Sterblichkeit). Infizierte Welpen, die entweder eine hohe oder niedrige Dosis Inokulum erhielten, wogen mit 24 PS deutlich weniger als ihre Kontroll-Wurfgenossen(Abbildung 1A,B). Alle Welpen, die das höhere Inokulum erhielten, erfüllten die Endpunktkriterien bei 24 PSi. Als solche, alle infizierten Welpen in dieser Gruppe wurden nach der Bildgebung eingeschläfert. Bakterien im Blut wurden für eine Untergruppe von Mäusen aufgezählt, die das untere Inokulum erhielten, und für alle Tiere, die das höhere Inokulum erhielten, da sie alle eingeschläfert wurden. Die Ergebnisse zweier experimentenischer Experimente deuten in ähnlicher Weise darauf hin, dass die meisten Tiere zwar einen hohen Bakteriengehalt im Blut (KBE/ml) bei 24 PSi hatten, einige Tiere jedoch keine nachweisbaren Bakterien im Blut hatten(Abbildung 1C). Letztere deuten darauf hin, dass sie die Infektion zu diesem Zeitpunkt gelöscht haben. Wie erwartet, welpen, die das höhere Inokulum erhielten, hatten fast drei Größenordnungen mehr CfUs/ml bei 24 PSi im Vergleich zu Welpen, die die niedrige Dosis Inoculum erhielten (Abbildung 1C).
Die Live-Tierbildgebung von leuchtmbissigen Bakterien bestätigte die Verbreitung von Bakterien und das Wachstum von Neugeborenenwelpen im Laufe der Zeit mit 10 und 24 PSi(Abbildung 2 und Abbildung 3). Zusätzlich konnten wir mit intravitaler Bildgebung mit dem microCT Infektionsherde identifizieren, einschließlich des Gehirns (Abbildung 2B), der Lunge (Abbildung 2B, Abbildung 3A,B) und anderer peripherer Gewebe (Abbildung 2B). Die Lunge einiger hochinfizierter Mäuse zeigte undurchsichtige Regionen, die mit der entzündlichen Konsolidierung im Einklang stehen und das zu einem leuchtenden bakteriellen Signal kolokalisiert sind (Abbildung 3A). Diese Regionen mit vermutetem entzündlichem Exulat finden sich nicht in nicht infizierten Kontrolllungen (Abbildung 3A). Weitere Hinweise auf eine ausgeprägte entzündliche Zytokin-Reaktion in der Lunge infizierter Welpen werden durch genexpression-Analyse von IL-1, IL-6 und TNF-α nachgewiesen. Für alle drei Zytokine sowohl in den unteren als auch in den hohen Inokulumgruppen wurde ein signifikanter Anstieg der Expression im Verhältnis zu den Kontrollen beobachtet (Abbildung 4A). Die Histopathologie der Lunge wurde auch bei 24 PSi unter Kontrolle und infizierten Welpen untersucht. Trotz ähnlicher entzündlicher Zytokinprofile wurde häufig eine fortschreitende Zunahme der Pathologie vom unteren zum höheren Inokulum beobachtet. Im Vergleich zu Gewebe aus nicht infizierten Kontrollen zeigten die Lungen infizierter Welpen bemerkenswerte entzündliche Veränderungen, Verdickung der Alveolarwand, erhöhte Alveolarblutungen und entzündliche Infiltration (Abbildung 4B). Bei den schwersten Infektionen trugen die Lungenverstopfung und Blutungsgebiete zu einer massiven Verringerung des Freiraumes bei (Abbildung 4B). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass in unserem Modell der früh auftretenden neonatalen Sepsis die Verbreitung von Lumineszierenden Bakterien im Laufe der Zeit von einer subskaulären Impfstelle bis hin zu wichtigen Infektionsherden verfolgt werden kann und bei schwer infizierten Tieren signifikante Entzündungen und Pathologien verursachen kann.
Um Wirtsfaktoren zu untersuchen, die zur bakteriellen Tötung durch angeborene Immunzellen wie Monozyten, Makrophagen und Neutrophilen beitragen, haben wir einen empfindlichen In-vitro-Assay entwickelt, um die bakterielle Clearance zu messen. Ly6B.2+ Zellen, die aus den Milz von neonatalen Mäusen isoliert wurden, wurden mit biolumineszierenden E. coli in einer Reihe von MOIs für 1 h infiziert und dann mit Gentamicin behandelt, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Bei 3, 6, 20 und 48 PSi wurde die intrazelluläre Lumineszenz mit einem Multimode-Reader gemessen. Wie erwartet wurde mit steigendem MOI bei 3 h mehr Leuchtsignal aufgezeichnet (Abbildung 5). Allmählich ging dieses Signal verloren, was auf eine bakterielle Clearance hindeutet (Abbildung 5). Dieser Test ist für ergänzte Zytokine, Neutralisierung von abgesonderten Effektoren und die Zugabe von pharmakologischen Inhibitoren von zellulären Bahnen zugänglich, um Interventionen zu untersuchen, die die bakterielle Clearance fördern und dazu dienen können, die Ergebnisse im hier beschriebenen neonatalen Sepsis-Modell zu verbessern.
Abbildung 1: Veränderungen des Körpergewichts und der bakteriellen Replikation bei septischen neonatalen Mäusen.
(A,B) Individuelle Mausgewichte innerhalb einer Gruppe (niedrig und hoch) ausgedrückt als Prozentsatz des mittleren Gewichts der Wurfmate-Kontrollwelpen. Die Daten werden als mittlerer Prozentsatz ± SEM dargestellt. Einzelne T-Tests an jedem Zeitpunkt nach der Infektion zeigen signifikante Unterschiede bei 24 h zwischen Kontrollwelpen und Welpen, die das niedrige Inokulum (p<0.0001) (A) erhielten, oder zwischen Kontrollwelpen und Welpen, die das hohe Inokulum erhielten (p=0,0031) (B). (C) CFU/ml im Blut mit 24 PS wurden log transformiert und als mittelwertiger ± SEM dargestellt. Mann-Whitney-Test zeigt einen Trend zur Signifikanz zwischen den niedrigen und hohen Inokulumen (p=0,0882). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Intravitale Bildgebung zeigt die Verbreitung von Bakterien bei neonatalen Mäusen im Laufe der Zeit.
(A) Eine repräsentative Neonatalmaus (#1), die mit einem Inokulum von 2 x 106 KBE infiziert ist, wird zum Zeitpunkt 0, 10 und 24 PSi angezeigt. Für jeden Zeitpunkt wird eine farbmetrische Skala mit den minimalen und maximalen Strahlungswerten pro Zeitpunkt angezeigt. Mäuse bei 0 und 10 h werden sowohl auf ihrer Zeitpunktskala als auch auf der 24-Stunden-Skala angezeigt, um Veränderungen des Bakterienwachstums im Laufe der Zeit zu demonstrieren. (B) Repräsentative 3D rekonstruierte MikroCT-Bilder derselben Neonatalmaus mit 10 und 24 PSi werden gezeigt. Jeder Zeitpunkt hat Bilder an Overhead-, transaxialen und koronalen Perspektiven. Im transaxialen Bild mit 24 PSi hat sich die Ebene in Richtung der Peripherie der Maus bewegt, um Infektionsherde im peripheren Gewebe besser anzuzeigen. Weiße Pfeile zeigen das Gehirn und die Niere bei 10 PSi und die Niere und Lunge bei 24 PSi an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Lunge ist ein Ort der großen Infektion während der bakteriellen Sepsis in Neonaten.
(A) Repräsentative 3D-rekonstruierte MikroCT-Bilder einer neonatalen Maus (#5), die mit einem Inokulum von 7 x 106 KBE infiziert ist, werden mit 24 PSi im Vergleich zu einer nicht infizierten Kontrolle gezeigt. Beide Mäuse werden in der transaxialen Perspektive angezeigt und die Lunge wird durch weiße Pfeile angezeigt. Die infizierte Maus wurde auf zwei Strahlstufen (Photonen/Sek.) gesetzt. Maßstab #1 umfasst alle 6 Wellenlängen (500, 520, 560, 580, 600, 620 nm) und #2 umfasst nur 500, 520 und 560 nm Wellenlängen. Diese zweite Skala ermöglichte es uns, ein erhöhtes Signal in Bakterien in der Lunge zu visualisieren, weil niedrigere Wellenlängen stärker vom Gewebe absorbiert werden und ein stärkeres Signal erzeugen. (B) Repräsentative 3D-rekonstruierte MikroCT-Bilder einer neonatalen Maus (#4), die mit einem Inokulum von 7 x 106 KBE infiziert ist, werden mit 24 PSi gezeigt. Dieser Zeitpunkt hat Bilder an den Overhead-, sagittalen, transaxialen und koronalen Perspektiven. Weiße Pfeile weisen auf Infektionsherde in der Lunge hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Entzündung und damit verbundene histopathologische Befunde in der Lunge septischer Neonate.
Bei 24 PS i wurden die Lungen von Welpen geerntet, die 2 x 106 oder 7 x 106 KBE oder nicht infizierte Kontrollen erhielten. (A) RNA wurde isoliert und die Expression von IL-1, IL-6 oder TNF-α wie im Verhältnis zu nicht infizierten Kontrollen durch quantitative Echtzeit-PCR unter Verwendung der Formel 2- Ctbestimmt. Die Daten werden als die mittlere Log2 transformierte Änderung des Ausdrucks ± SEM für jedes Inokulum wie angegeben angezeigt. Die statistische Signifikanz wurde anhand ungepaarter T-Tests von Ct-Werten zwischen einzelnen Zytokingenen und der internen Kontrolle im 95%-Konfidenzintervall ermittelt. Sternchen zeigen p<0.01 an. (B-D) Histopathologische Abschnitte von H&E gebeizten Lungengeweben (20x, Interessenbereich in Clipping-Maske konstruiert und zur Klarheit vergrößert) werden gezeigt. Gezeigt werden Lungengewebe aus einer repräsentativen nicht infizierten Kontrolle (B) oder infiziertem Neugeborenen am niedrigen (C) oder hohen (D) Inokulum. Gelbe Pfeile zeigen Alveolare Verdickung (C) oder Blutungen (D). Skalenbalken = 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Ein In-vitro-Test für die bakterielle Clearance.
Ly6B.2+ Zellen wurden aus den Milz ens von nicht infizierten Kontroll-Neonaten isoliert. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten gesät und mit luziferase-exezierenden E. coli O1:K1:H7 bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10, 50 oder 250 wie angegeben infiziert. Nach 1 h wurde das Medium durch frisches, das Gentamicin enthielt (100 g/ml), ersetzt. Für ein einzelnes Experiment, das für mehrere repräsentativ ist, werden mittlere relative Lichteinheiten (RLU) ± SE gezeigt. Die statistische Signifikanz im 95%-Konfidenzintervall wurde anhand von ungepaarten t-Tests mit Welchs Korrektur ermittelt; Sternchen zeigen p<0.05 an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Unser subskapulares Infektionsmodell zur Induktion von bakteriellen Sepsis bei neonatalen Mäusen ist eine neuartige Methode, um die Längsausbreitung bakterieller Krankheitserreger in Echtzeit zu untersuchen. Intravital-Bildgebung bietet die Möglichkeit, die bakterielle Verbreitung in Echtzeit in Neonaten zu erforschen. Dies ist entscheidend, um die Kinetik der bakteriellen Verbreitung zu verstehen und die Reaktion und den Schaden des Wirts in der entsprechenden Krankheitsphase weiter zu untersuchen. Mauswelpen wird eine subkutane, subskapuliere Injektion von bakteriellem Inokulum verabreicht. Diese Injektionstechnik ist einfacher als andere häufig verwendete Alternativen, wie die Schwanzvene und intraperitoneale Infektionen, da es weniger Präzision innerhalb einer Injektionsstelle erfordert. Dies ist wichtig angesichts der geringen Größe der Welpen. Die intravitale Bildgebung ermöglicht eine Längsauswertung der bakteriellen Proliferation und Verbreitung in peripheren Geweben und dem zentralen Nervensystem im Laufe der Zeit, ohne dass das Tier geopfert werden muss. Ähnliche bildgebende Ansätze und Technologien wurden für das Studium der Krebsbiologie und Metastasierung20,21verwendet. Während eine andere Studie die Verwendung von biolumineszierender Bildgebung während einer E. coli-Infektion bei neonatalen Ratten22zitiert hat, haben wir hier den Ansatz auf neonatale Mäuse angewendet, wobei unsere Methodik die Bewertung der bakteriellen Kinetik während der murinen Sepsis ermöglicht. Die Visualisierung der Bakterien basiert auf der Emission von biolumineszierendem Licht bei verschiedenen Wellenlängen von Bakterien (z.B. bakterielle Luziferase-Aktivität) innerhalb des Tieres. Die Biolumineszenz wird dann durch eine gekühlte charged coupled device (CCD) Kamera visualisiert. Die daraus resultierende visualisierte Biolumineszenz kann dann zu einem 3D-Bild rekonstruiert werden, das sowohl räumlich- als auch zeitlich abhängige Wirkungen von Bakterien innerhalb eines Tieres zeigt. Für eine zusätzliche, differenziertere Datenerfassungsschicht ermöglicht eine erfolgreiche Tieridentifikation durch Schwanztätowierung eine wiederholte Messbewertung einzelner Welpen über die Zeit und die Identifizierung möglicher Ausreißer innerhalb einer bestimmten Versuchsgruppe.
Die erfolgreichste Anwendung des beschriebenen Modells erfordert Genauigkeit bei der Herstellung des bakteriellen Inokulums. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode zur bakteriellen Präparation mit einer vorab etablierten und validierten E. coli-Wachstumskurve, die die Variation zwischen dem Ziel und dem tatsächlichen Inokulum reduziert. Dies ermöglicht die experimentelle Reproduzierbarkeit an einem beabsichtigten Inokulum. Die Aufnahme von zwei Inokulumen in unser Modell zeigte dosisabhängige Ergebnisse bei LEINEN, Sterblichkeit und Lungenpathologie. Einige Aspekte des Krankheitsverlaufs waren jedoch nicht dosisabhängig. Das Versäumnis, bei infizierten Tieren an Gewicht zu gewinnen, war bei 24 PSi nicht vom Inokulum abhängig. Zusätzlich wurden ähnliche Konzentrationen der entzündlichen Zytokinexpression in der Lunge als Reaktion auf eine Infektion mit beiden Inokulumen beobachtet. Ob sich dieses Muster in allen Geweben, in denen Bakterien beobachtet wurden, wie Niere, Leber, Milz und Gehirn, wiederholen würde, bleibt abzuwarten. Neben der Sepsis ist E. coli O1:K1:H7 mit Meningitis bei der neonatalen Population23assoziiert. Diese Gehirninfektion tritt auf, wenn Bakterien aus der Peripherie eindringen und in die Blut-Hirn-Schranke eindringen. Zukünftige Studien werden diesen Aspekt des Modells durch die Analyse von Veränderungen in der engen Junction-Proteinexpression untersuchen und verschiedene Bereiche von bakteriellen Inokulumen testen. Eine zusätzliche Modifikation während der intravitalen Bildgebung umfasst die Zugabe einer einzigartigen Baumwollkugel, die in Isofluran dosiert wird und während der Bildgebung etwa 2-3 Zoll von den Mäusen entfernt platziert wird. Als Reaktion auf frühere Experimente, bei denen die neugeborenen Welpen während der Bildgebung das Bewusstsein wiedererlangt haben, wodurch eine genaue Bildaufnahme verhindert wurde, platzieren wir nun die Baumwollkugel nah genug an die Mäuse, um sie während der Bildgebung kontinuierlich anästhesiert zu halten. Es ist jedoch wichtig, dass dies nicht so nah geschieht, dass sie sich nicht von der Anästhesie erholen.
Obwohl flexibel und leicht anpassungsfähig für die Untersuchung der Kinetik verschiedener Bakterien in verschiedenen Tier- und Krankheitsmodellen, hat unser Protokoll einige Einschränkungen zu berücksichtigen. Die erste zu berücksichtigende Einschränkung ist, dass der subskapitare Infektionsweg nicht einen natürlichen Übertragungsweg widerspiegelt. Ein vorrangiges Ziel bei der Entwicklung unseres Modells war jedoch von Anfang an, eine leicht reproduzierbare Art der Verabreichung zu etablieren, die verwendet werden könnte, um eine systemische Infektion zu etablieren, die Aspekte menschlicher Krankheiten repliziert. Daher beschreiben wir in diesem Bericht ein Modell des menschlichen Sepsis-Syndroms, nicht ein Modell der natürlichen Übertragung. Es gibt ein etabliertes Modell der oralen Verabreichung bei neonatalen Ratten, die einige Aspekte der gemeinsamen menschlichen Übertragung repliziert, wie die anfängliche Besiedlung der E. coli-Infektion im Nahrungskanal und die anschließende Verbreitung an den Blutkreislauf und periphere Gewebe, einschließlich des Gehirns22. Das von Witcomb und Kollegen erstellte Modell beinhaltet auch biolumineszierende E. coli und intravitale Bildgebung. Darüber hinaus ist es entscheidend, die Exposition von Isofluran e.H. zu minimieren sowie Die Injizieren, Schwanztätowierung und Welpen so schnell wie möglich zu behandeln, ohne die Genauigkeit und Präzision der Techniken zu beeinträchtigen, um den Stresspegel sowohl für die Neonate als auch für die Dämme zu verringern. In einigen Fällen, wenn die Welpen erleben verbesserte menscheninduzierte und /oder experimentelle Manipulationen, die Dämme können aufhören, pflege und pflege die Welpen, was zu einem verminderten Überleben, das nichts mit der Infektion zusammenhängt. In ähnlicher Weise haben Welpen, die Isofluran über einen längeren Zeitraum über die ungefähr 10 Minuten einer Bildgebungssitzung hinaus ausgesetzt sind, ein erhöhtes Sterberisiko; daher ist es entscheidend, gerade genug Isofluran zu liefern, um die Mäuse ausreichend zu beästhesieren, aber nicht genug, um sie einzuschläfern. Ein letzter Aspekt ist die Grenze der Sensibilität. Gewebe, in denen weniger als 104 KBE/ml E. coli aufgezählt wurden, die lumineszierenden Signal-Stürze am unteren Ende des nachweisbaren Bereichs, entsprechend der Skalierungsmethode, die in der Bildgebungssoftware verwendet wird3. So können einige Gewebe mit niedrigen Bakterienkonzentrationen besiedelt werden, erscheinen aber ohne sichtbare Biolumineszenz.
Derzeit, die meisten Studien nutzen erwachsene Methoden der bakteriellen Verbreitung, wie intraperitoneal (i.p.) und Schwanz Veneninjektionen für Neonomen. Pluschke und Pelkonen analysierten die Wirkung von E. coli K1 auf neonatale Mäuse durch i.p., Schwanzvene und orale Infektionen24. Diese Studie zeigte, dass verschiedene Genotypen von Mäusen mit Immundefekten anfälliger für den K1-Stamm sind; viele Aspekte der Wirtsimmunantwort auf Infektionen sowie die Mechanismen für die bakterielle Ausbreitung bleiben jedoch unadressiert. Deshmukh und Kollegen infizierten neonatale Mäuse intraperitoneal mit E. coli K1 oder K. pneumoniae und maßen KBE in Milz und Leber bei 72 psi25. Diese Studie analysierte auch einige Aspekte der Wirtsreaktion auf Infektionen basierend auf der Vorexposition von Mäusen mit Antibiotika. Eine gründliche Untersuchung der bakteriellen Verbreitung an peripheren Geweben und Blut im Laufe der Zeit parallel zur entzündlichen Profilierung im selben Gewebe (außer Granulozytose) wurde jedoch nicht angesprochen. Andere Studien zur neonatalen Sepsis bei Mäusen mit Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Gruppe B Streptococcusund E. coli untersuchen verschiedene Aspekte des Wirtsimmunsystems als Reaktion auf eine Infektion. Jedoch, keine dieser Studien nutzen intravitale Bildgebung, um die Kinetik der bakteriellen Verbreitung oder Lokalisierung von Infektionsherden23,25,26,27zu erforschen. Unsere Methode der Infektion und intravitale Bildgebung, kombiniert mit bakteriellen Belastungsbewertungen und entzündlicher Profilierung von peripheren Geweben, ermöglicht es uns, Aspekte des Wirts und des Erregers während der Infektion umfassend zu untersuchen, was ein genaueres Verständnis des Wirts-Pathogen-Zusammenspiels während der Sepsis ermöglicht.
Wir beabsichtigen, dieses Infektions- und Bildgebungsmodell zu nutzen, um unser Verständnis der früh einsetzenden neonatalen Sepsis unter Verwendung einer Vielzahl von pathogenen Bakterien zu fördern, die häufig für Sepsis in Neugeborenen verantwortlich sind, einschließlich Streptokokken der Gruppe B, K. pneuomoniaeund Listeria monocytogenes. Dieses Infektionsmodell wird es uns ermöglichen, die Verbreitung verschiedener bakterieller Krankheitserreger parallel zur Wirtsreaktion bei Neonaten längs zu vergleichen. Darüber hinaus ist dieses Modell anpassungsfähig an den Adoptivtransfer spezifischer (fluoreszierend konjugierter) Immunzelltypen, um deren Migration an Infektionsstellen und anschließenden Einfluss auf die Wirtsreaktion und -kontrolle von Bakterien zu untersuchen. Dies bietet die Möglichkeit, die Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen, die während der Sepsis im frühen Leben auftreten, auf eine Weise besser zu verstehen, die bisher nicht nachgewiesen wurde.
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Diese Arbeit wurde durch institutionelle Mittel an C.M.R. unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
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