盐水条件下丛枝菌根 （AM） 真菌接种物的生产及水稻与 AM 共生的表型评价

本文介绍了一种生成丛枝菌根 （AM） 真菌接种物的方案，以研究 AM 增强的水稻耐盐性。

水稻 （Oryza sativa L.） 是全球一半以上人口的重要粮食作物。然而，它的生长受到盐碱土壤的严重影响，这对全球作物生产构成了重大挑战。丛枝菌根 （AM） 真菌与超过 90% 的农业植物和 80% 的陆生植物物种形成互惠共生关系，已被证明可以增强水稻植物的耐盐性。AM 真菌是专性共生体，没有宿主根就无法完成其生命周期。因此，有效利用植物生产 AM 真菌接种物对于推进该领域的研究至关重要。在这项研究中，我们提出了一系列稳健的方法，这些方法首先使用 Allium tuberosum L 生成含有不规则根瘤菌孢子的沙子接种物。这些方法包括用沙子接种物接种水稻幼苗，分析菌根稻的生长表型，以及在盐胁迫下使用台盼蓝染色量化真菌定植水平。这些方法可以有效地产生 AM 真菌接种物，以进一步研究 AM 共生如何增强水稻的耐盐性。

盐渍土壤是全球作物生产的重大障碍 ^1,2,3。最近的研究表明，到 2050 年，由于盐碱化，高达 50% 的耕地将退化⁴。受盐影响的土壤主要由于钠 （Na⁺） 和氯离子 （Cl⁻） 在植物组织中积累而对植物造成毒性。这些离子在盐渍土壤中占主导地位，也是对植物最有害的离子 ^5,6,7。例如，钠会抑制许多胞质酶活性⁸。盐胁迫还会影响光合效率，并诱导离子毒性、渗透压和细胞壁结构的变化，共同导致活性氧 （ROS） 的积累9,10,11,12,13。

丛枝菌根 （AM） 共生是 Glomeromycota 门真菌与植物根之间的内共生关联，大约在 400-4.5 亿年前随着早期陆地植物的出现而进化^14,15。超过 80% 的维管植物可被 AM 真菌定植¹⁶。这种互惠关系增强了植物从土壤中吸收养分，从而提高了生长和抗逆性 17,18,19,20。例如，在盐胁迫期间，AM 真菌可以维持离子平衡，并有助于提高水和养分的可用性、抗氧化活性、光合作用效率和植物的次生代谢物产生 2,21,22,23。此外，AM 共生可防止 Na+ 的过度吸收和从根部到芽的运输，促进 K⁺、Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 等必需阳离子的吸收。这个过程增加了盐水条件下植物中的 Mg²⁺/Na⁺ 或 K⁺/Na⁺ 比率 23,24,25,26,27,28,29。

水稻 （Oryza sativa L.） 是全球一半以上人口的重要粮食作物，属于禾本科 （Poaceae） 科，极易受到盐胁迫³⁰。研究还强调了 AM 真菌在增强水稻耐盐胁迫性方面的作用 31,32,33。例如，AM 真菌 Claroideoglomus etunicatum 提高了盐胁迫下水稻 （Oryza sativa L. cv. Puntal） 的 CO₂ 固定效率³¹。此外，在盐胁迫下，与 液泡钠螯合和 Na + 从芽到根再循环相关的关键水稻转运蛋白基因的表达在 AM 定植植物中增强³²。此外，在盐碱条件下，接种 Glomus etunicatum 的陆地稻植物显示出增强的光合能力、更高的渗透液产生、更高的渗透潜力和更高的谷物产量³³。我们之前的研究还表明，菌根稻 （Oryza sativaL. cv. Nipponbare） 表现出更好的芽和生殖生长，芽中的 K⁺/Na ⁺ 比率明显更高，并且由于 AM 共生³⁴ 提高了活性氧 （ROS） 清除能力。这些发现都通过表型方法证明了 AM 共生对水稻耐盐胁迫性的积极影响。然而，实验方法尚未以视频格式发布。

AM 真菌是专性共生体，需要宿主根才能完成其生命周期，这使得利用植物产生 AM 真菌接种物对研究进展至关重要³⁵。基于基质的生产系统，其中 AM 真菌在蛭石或沙子等基质中生长，并收集孢子用于接种³⁶，为大规模 AM 真菌接种物生产提供了一种经济高效的解决方案。孢子生产的效率取决于植物的相容性和生长，这会影响真菌的定植和繁殖^37,38。然而，这种方法通常很耗时，传统方法需要长达 120 天，并且孢子产量很低。最近的改进已将生产周期缩短到 90 天，在 LED 光照条件下使用玉米作为寄主植物³⁹。然而，提出了一种在 10 周内使用 Allium tuberosum L. 生成含有 Rhizophagus irregularis 孢子的沙子接种物的稳健方法。这种沙子接种物可用于分析菌根稻的生长表型，并在盐胁迫下使用台盼蓝染色量化真菌定植水平。这些方法有效地产生 AM 真菌接种物，用于进一步研究 AM 共生如何增强水稻的耐盐性。

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在材料表中。

1. 使用 Allium tuberosum L 生成含有 Rhizophagus irregularis 孢子的沙子接种物。

1. 用自来水清洗沙子并高压灭菌。
2. 将 2/3 的沙子加入花盆中（顶部直径 14.7 厘米，底部直径 11.5 厘米，高度 13 厘米）。添加 1,000 个 AM 真菌 Rhizophagus irregularis 孢子。盖上一层薄薄的沙子。加入 30 颗韭菜 （Allium tuberosum L.） 种子，用沙子盖住种子。
3. 在 23.5 °C（55% 相对湿度）下以 16 小时/8 小时昼夜循环在腔室中种植大蒜韭菜。在第一周（接种后 1 周，wpi），用氧化铝纸盖住韭菜以阻挡光线，并每周浇水 3 次。
4. 从 2 wpi 开始，每周两次用含有 25 μM KH₂PO₄ 的 80 mL 半强度 Hoagland 溶液给韭菜施肥。每周用 80 mL 水施肥一次。
5. 10 周后，收获韭菜的根部进行台盼蓝染色，以评估真菌定植的水平。如果定植水平超过 70%，请停止给韭菜浇水，直到沙子变干（约 5 周）。将所有沙子接种物放入塑料袋中，并将其存放在 4 °C 的冰箱中。

2. 台盼蓝染色以检查真菌定植水平

1. 将根块在 >90 °C 的 10% KOH 中孵育 30 分钟。去除 KOH。
2. 用双蒸水 （ddH₂O） 冲洗根块 3 次。
3. 将根块与 0.3 M HCl 孵育 15 分钟至 2 小时。去除 HCl。
4. 加入 1 mL 0.1% 台盼蓝，并将样品在 >90 °C 下孵育 8 分钟。
5. 用 50% 酸性甘油清洗根块。将 10 个根块转移到载玻片上，并加入一滴 50% 酸性甘油。
6. 密封盖玻片并用指甲油滑动。
7. 在显微镜下检查每个根的 10 个视野，以记录真菌结构的存在。以百分比计算真菌定植水平。
   注意：50% 酸性甘油：通过将甘油和 0.3 M HCl 以 1：1 的比例混合来制备。0.1% 台盼蓝：将 100 mg 台盼蓝溶于 2：1：1 乳酸、甘油和 ddH₂O 的混合物中。

3. 用沙子接种和盐胁迫处理接种水稻幼苗

1. 从水稻种子中取出外壳（外壳）。
2. 用 70% 乙醇 （EtOH） 对种子消毒 4 分钟和 30 秒。
3. 将水稻种子放入离心管中。加入 3% 漂白剂（用无菌 dH₂O 制备）并摇动 30 分钟。
4. 去除漂白剂，在层流罩内用无菌 dH₂O 3-4 次洗涤种子。
5. 将种子在含有 0.8% 琼脂的半强度 Murashige-Skoog （1/2 MS） 培养基中于 30 °C 下在黑暗中生长 5 天。
6. 在 30/28 °C 和 70% 空气湿度下以 12 小时的昼夜循环种植水稻幼苗 2 天。
7. 将水稻幼苗转移到装有消毒沙的塑料管中。添加无接种物 （mock） 或 5 mL 含有不 规则根瘤 菌 （Ri） 孢子的沙子接种物。
8. 接种后第一周每周 7 天用 dH₂O 给水稻植株浇水。每隔一天用含有 25 μM KH₂PO₄ 的半浓度 Hoagland 溶液给植物施肥。
9. 接种后 5 周 （wpi），用 150 mM 的 NaCl（盐水条件）处理一批，让另一批没有 NaCl（非盐水条件）的批次。
   1. 对于非盐分条件，周二用含有 25 μM KH₂PO₄ 的半强度 Hoagland 溶液给植物浇水，并在一周的剩余时间里用水浇水。
   2. 对于盐水条件，周二用含有 25 μM KH₂PO₄ 的半强度 Hoagland 溶液给植物浇水，周一、周三和周五用 150 mM NaCl 浇水，并在本周剩余时间内用水浇水。
10. 在 8 wpi 时，收获植物以测量其新鲜重量。将植物置于 70 °C 的烘箱中 2 天以测量干重。通过台盼蓝染色分析真菌定植水平。

分步工作流程如图 1 所示。在接种后 10 周 （wpi），在大蒜韭菜根部内清楚地观察到囊泡和孢子等真菌结构，这是晚期和 AM 共生的特征（图 2A）。根内菌丝、丛枝、囊泡、根外菌丝和孢子水平分别为 80% 、 47% 、 63% 、 4% 和 1%，表明韭菜根部内部真菌发育的进展。因此，总定植水平达到 80% （图 2C）。这些结果表明，韭菜大蒜与 AM 真菌之间的共生关系成功建立，AM 真菌能够完成其生命周期并产生更多的孢子。利用韭菜和AM真菌共生产生的沙子接种物，水稻植物成功地被AM真菌定植。在 8 wpi 时，在水稻根系内观察到囊泡和孢子（图 2D），根内菌丝、丛枝、囊泡、根外菌丝、孢子和总真菌结构的水平分别为 91%、82%、95%、46%、2% 和 93%（图 2E）。然后，将水稻植株在没有（模拟）或有这种沙子接种物的情况下生长 5 周，然后在没有或用盐溶液（150 mM NaCl）处理 3 周。在盐胁迫下，菌根植物比模拟植物表现出更少的枯萎叶尖（图 2F）。在非盐碱条件下，菌根稻植物的芽生物量高于模拟稻草（图 2G）。在盐胁迫下，模拟植物的枝条生物量严重降低，而菌根植物保持其枝条生物量，比模拟植物高 1.4 倍（图 2G）。在这两种条件下，AM 共生都没有显着影响根生物量（图 2G）。这些结果表明，AM 共生有助于水稻植物在盐胁迫下维持更好的芽生长。在非盐水和盐水条件下，真菌定植水平分别达到 84% 和 83%，表明 AM 真菌成功定植水稻根系。此外，在盐胁迫下，根外菌丝水平较高。在非盐水和盐水条件下的其他真菌结构中没有观察到显着差异，表明盐胁迫对 AM 共生有轻微影响（图 2H）。

图 1：分步工作流程。 （A） 使用以下步骤制备沙子接种物： 第 1 步：在锅底放一层棉花，将 2/3 的消毒沙加入锅中。用切尖均匀分布约 1000-2000 个 Rhizophagus irregularis 孢子，然后用剩余的 1/3 灭菌沙覆盖。将 30 颗 Allium tuberosum L. 种子均匀地撒在沙面上，并用氧化铝纸覆盖以阻挡光线。将植物在 23 °C 下孵育一周。第 2 步：种子在 23 °C 下以 16/8 光照/黑暗循环生长 10 周，然后停止浇水。检查根的定植水平。第 3 步：将沙子风干，在接种后 15 周 （wpi） 收集，充分混合，并储存在 4 °C 冰箱中。（B） 水稻种子在品红色盒子中发芽。步骤 1 和 2：用水 70% 乙醇对水稻种子消毒 4 分钟 30 秒，并用 3% 的高氯酸钠代替乙醇。将种子摇动 30 分钟，然后用无菌水冲洗 5 次。将种子在含有 0.8% 琼脂的 1/2 Murashige 和 Skoog （MS） 培养基上发芽，在 30 °C 下在黑暗中放置 5 天，在光照下放置 2 天（在 30/28 °C 下昼夜循环 12/12 小时）。第 3 步：第 7^~ 10^天转移 水稻幼苗。（C） 接种和盐水处理。第 1 步：将水稻幼苗移植到含有无菌沙子的塑料管中，不含 （mock） 或含有 5 mL 含有 不规则根瘤菌 （Ri） 孢子的沙子接种物。植物在 30/28°C 下以 12 小时昼夜循环的生长室中生长，并且植物每周用含有 25 μM 磷酸盐 （Pi） 的一半 Hoagland 溶液生长两次。第 2 步：在 5 wpi 时，将菌根和模拟植物分为两组。一组用 150 mM 氯化钠 （NaCl） 处理（盐水条件），另一组在非盐水条件下生长。第 3 步：在 8 wpi 时，收集所有植株，然后分离芽和根，评估鲜重和干重。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：Allium tuberosum L 的表型。 （大蒜韭菜）、O. sativa L. japonica cv. Nipponbare（水稻）和 Rhizophagus irregularis（AM 真菌）。 （A） 10 wpi 的菌根大蒜韭菜根的照片。（B） 菌根大蒜韭菜植株在 10 wpi 下的照片。（C） 大蒜韭菜根的真菌定植水平。（D） 菌根稻根在 8 wpi 的照片。（E） 水稻根系真菌定植水平。（F） 盐胁迫下模拟和菌根稻植物的表型。（G） 非盐胁迫下假稻和菌根稻植株的干重，以及 （H） 8 wpi 盐胁迫下菌根稻根系的真菌定植水平。在 （A-C） 中，用 200 个孢子的 AM 真菌 （R. irregularis， Ri） 接种韭菜，在 25 μM 磷酸盐条件下生长，并在接种后 10 周 （wpi） 收获。在图 （D） 和 （E） 中，用水稻植株接种 5 mL 沙子接种物，该沙子接种物来源于大蒜韭菜和 AM 真菌（Rhizophagus irregularis，Ri）之间的共生关系，在 25 μM 磷酸盐条件下生长，并在接种后 8 周收获 （wpi）。在图 （F） 中，水稻植株在没有（模拟）或含沙接种物的情况下生长 5 周，然后用盐溶液（150 mM NaCl）处理 3 周。在图 （A） 和 （D） 中用台盼蓝对根进行染色。在这些面板中，孢子用白色箭头表示，囊泡用白色箭头表示，根外菌丝用黑色箭头表示。比例尺：面板 （A） 和 （D） 中为 100 μm;面板 （B） 中 1 cm;面板 （F） 为 10 cm。缩写：int 菌丝，根内菌丝;外部菌丝，根外菌丝。标准误差由 3-4 次生物学重复计算得出。不同的字母表示处理之间的显著差异（p < 0.05，双因素方差分析后跟事后检验差异最小）。请单击此处查看此图的较大版本。

有一些关于沙子接种物的制备和使用的小贴士。首先，根据我们的经验，大蒜韭菜的定植水平应高于 70%（图 2C）。否则，对其他植物（如番茄和水稻）的以下接种在接种后 7 周 （wpi） 时将无法成功达到 50% 以上（图 2E）。其次，沙子接种物在储存前应彻底风干，并保存在冰箱的干净塑料袋中，以防止其再次变湿（步骤 1.5）。否则，砂接种物的质量会变差。第三，沙子接种物可以在冰箱中存放约 10 个月，没有任何问题。第四，在将沙子接种物加入花盆中接种其他植物之前，必须通过摇动储袋将沙子接种物充分混合（步骤 3.7）。

关于台盼蓝染色，应将根切成约 1-1.5 厘米长的块进行染色，以便可以用台盼蓝均匀地染色真菌结构（步骤 2.1）。为了准确表示根的菌根定植水平，必须以几乎相等的间隔从根的一端到另一端观察十个视野（步骤 2.7）。

关于模拟稻和菌根稻的盐胁迫处理，用酒精对稻种进行消毒的时间必须精确;否则，会影响水稻的发芽率（步骤 3.2）。由于沙子被用作栽培介质，因此确保水稻在整个生长过程中获得足够的水分非常重要。否则，水稻可能会同时经历干旱和高盐胁迫，从而难以准确评估生长结果（步骤 3.8-3.9）。

通过遵循该方案，可以在水稻品种 Nipponbare 中观察到 AM 增强的盐胁迫耐受性。然而，这种盐胁迫处理是否也可用于观察其他水稻品种的 AM 增强盐胁迫耐受性尚不清楚。如果没有，可以修改一些步骤，例如使用更多的沙子接种物，在 5 wpi 后开始盐胁迫处理，增加盐胁迫的时间段，或在盐胁迫后重新给植物浇水。

AM 真菌是专性共生体，需要宿主根来完成其生命周期，这使得植物性接种物生产对于研究至关重要³⁵。基于基质的系统，其中真菌在蛭石或沙子等材料中生长，提供了一种经济高效的方法来生产大规模接种物。然而，传统方法可能需要长达 120 天的时间，并产生低孢子数^36、37、38。最近的改进已将 LED 灯下使用玉米的 90 天缩短^{到 39} 天。在这里，提出了一种使用 Allium tuberosum L. 在短短 10 周内在沙子中产生 Rhizophagus irregularis 孢子的方法。该接种物可用于研究水稻生长、真菌定植和耐盐性，为 AM 共生研究提供有效工具。

作者声明他们没有利益冲突。

我们感谢 Yun-Hsin Chen 建立了研究水稻中 AM 增强盐胁迫耐受性的系统，以及 Kai-Chieh Chang 建立了产生沙子接种物的系统。这项工作得到了台湾国家科学技术委员会 （NSTC 113-2326-B-002 -008 -MY3） 的资助。