腹腔注射药物给药是一种安全有效的非侵入性胰腺损伤方法。本研究比较了小鼠五种不同的腹腔注射方案诱导不同程度的胰腺损伤，并建立了严重胰腺损伤模型，以研究严重急性胰腺炎 （SAP） 的病理变化和治疗策略。

严重急性胰腺炎 （SAP） 的治疗死亡率高，带来了重大的临床挑战。使用动物模型研究与 SAP 相关的病理变化有助于确定潜在的治疗靶点和探索新的治疗方法。既往研究主要通过逆行胆管注射他韦罗胆酸钠诱导胰腺损伤，但手术损伤对动物模型质量的影响仍不清楚。在这项研究中，我们采用不同频率的腹腔注射 Caerulein 联合不同剂量的 LPS 诱导 C57BL/6J 小鼠胰腺损伤，并比较了五种腹腔注射方案的损伤程度。关于诱导小鼠急性胰腺炎，提出了一种腹膜内注射方案，导致 5 天内死亡率高达 80%。具体来说，小鼠每天腹膜内注射 10 次 Caerulein （50 μg/kg），然后在最后一次 Caerulein 给药后 1 小时注射 LPS （15 mg/kg）。通过调整注射药物的频率和剂量，可以有效地控制胰腺损伤的严重程度。该模型表现出较强的可控性，并且复制周期短，因此可以由单个研究人员完成，而无需昂贵的设备。它方便、准确地模拟了在人类 SAP 中观察到的关键疾病特征，同时表现出高度的可重复性。

重症急性胰腺炎的特点是消化系统疾病领域¹ 内起病迅速、进展迅速、死亡率高。其高病死率一直是临床研究的突出重点。由于临床状况的不可预测变化、疾病表现的异质性以及人类标本的有限可用性，建立动物模型对于疾病研究变得越来越重要。

逆行将牛磺胆酸钠注射到胆总管中通常用于创建 SAP² 的大鼠模型。通过模拟胰胆梗阻并诱导胆汁和胰液反流，这种建模技术在复制 SAP 动物模型方面表现出很高的成功率。但是，应该注意的是，侵入性手术确实对动物模型本身有影响。此外，这种方法仅限于大型动物，例如大鼠和狗，它们主要用作实验对象。替代技术，包括十二指肠插管³ （duodenal intubation）、直接十二指肠穿刺⁴ （direct duodenal puncture） 和胆管-胰管直接穿刺⁵ （direct puncture of the bile duct-pancreatic duct），经常用于建模目的。

腹膜内注射和饮食建模方法具有非侵入性优势，可应用于任何大小的动物。通过喂养胆碱缺乏乙硫氨酸 （CDE）⁶ 诱导的 SAP 小鼠模型存在某些并发症，例如难以控制的高血糖和低钙血症，使其不适合评估新的诊断和治疗方法。另一方面，腹膜内注射 Caerulein 联合 L-精氨酸⁷ 是诱导小鼠急性胰腺炎最常用的方法。具体来说，Caerulein（一种胆囊收缩素类似物）的重复腹膜内给药为研究与这种破坏性疾病相关的各个方面提供了一种非常合适的方法，包括发病机制、炎症和再生过程。由于其结构与胆囊收缩素 （CCK） 相似，Caerulein 可有效刺激胆囊收缩和胰酶分泌，导致酶分泌失衡，随后发生自毁⁸。脂多糖 （LPS） 作为一种病原体相关分子模式分子普遍存在并被广泛研究，可通过腹腔注射与 Caerulein 结合，建立有效的 SAP 小鼠模型。这种组合会迅速触发并释放大量炎性细胞因子，导致过度的局部和全身炎症。几项研究报道了通过腹膜内注射 Caerulein 联合 LPS 在小鼠中诱导 SAP 模型。这可能是由于腹腔注射 Caerulein 可引起小鼠胰腺水肿和出血，而加入 LPS 可立即诱导胰腺坏死并加剧全身炎症反应、败血症甚至器官衰竭。目前，腹膜内 Caerulein 注射的剂量和频率存在差异，额外 LPS 剂量也存在不一致。在小鼠 SAP 模型中实现一致性具有挑战性 9,10,11,12;因此，有必要建立一个标准化的协议来获得理想的模型。在本文中，我们描述了一种小鼠腹腔注射方案，并研究了 LPS 的最佳注射频率和额外剂量。

该协议由安徽科技大学第一附属医院（中国淮南）伦理委员会审查和批准（伦理守则:2023-KY-905-001）。该研究遵循美国国立卫生研究院 （National Institutes of Health） 关于在所有动物手术中照顾和使用研究啮齿动物的指南。本研究使用体重 20-30 g 的 C57BL/6J 成年小鼠。将小鼠在受控条件下（约 21 °C，昼夜交替循环 12 小时）在动物实验室中饲养一周。小鼠在整个过程中都可以随意获取食物和水。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 动物准备

1. 将 84 只健康的 C57BL/6J 小鼠分为 6 组，包括对照组、胰腺损伤 （PI） I、PI II、PI III、PI IV 和 PI V。
2. 在开始建模程序之前，用耳槽标记每组小鼠，并让它们禁食 12 小时。

2.诱导药物稀释剂的制备

1. 将 Caerulein （1 mg） 溶解在 1 mL PBS 中，并在 -20 °C 下冷藏。
2. 在腹膜内注射药物前 1 小时测量并记录实验小鼠的体重。
3. 根据所有小鼠的总重量，以 50 μg/kg 的比例提取所需的 Caerulein 总质量。
4. 再次用 PBS 稀释获得的 Caerulein 药物。
   注:PBS 稀释液的总体积应等于所有小鼠总重量值的 5 倍。采用相同的稀释法获得 LPS 稀释剂。

3. 腹腔注射

注意:根据 补充表 1 中概述的方案对每组小鼠进行腹膜内注射以诱导模型。另外 10 只小鼠被分组并接受治疗，观察 7 天生存率。

1. 抓住并握住小鼠，使小鼠的腹部朝上，头部的位置低于尾巴，以防止在插入注射器时损伤器官。
2. 使用 75% 酒精棉球对小鼠的腹部进行消毒。
3. 用右手握住注射器（使用测量为 ≤0.5/≥0.3 的针头），然后将针头插入腹部白线左侧的皮下皮肤。
   注:更改为右侧进行下一次进样。
4. 针头到达皮下层后，将其向前移动约 3-5 毫米，然后将注射器针头以 45° 角插入腹腔。在这一点上，人们应该感到一些阻力。
5. 保持针头不动并缓慢注入物质。
   注意:不要超过小鼠体重值的 5 倍作为单次腹膜内注射的体积。
6. 注射后，拔出针头，用无菌棉签轻轻按摩和按压注射部位，使药物充分扩散到小鼠的腹腔中。
7. 使用新注射器对下一个实验小鼠重复。

4. 旷场行为能力测试

注意:最后一次腹膜内注射后 12 小时，进行旷场行为能力测试以评估小鼠的总活动距离和不动时间。

1. 将四个相同的白色框放在相机正下方。
2. 使用视频电缆将相机连接到计算机。
3. 在开始实验之前，请确保实验盒干净且无任何异味。
4. 将动物放在网格的中间，背对实验者，并让它适应环境 10 分钟。
5. 启动视频跟踪软件，然后单击 File 菜单以创建新实验。
6. 为四个同步视野设置监控。
7. 在实时监控屏幕（30 cm × 30 cm）中标记可在箱内移动的实验物体的长度和宽度。
8. 设置完成后，开始视频监控和录制。
9. 记录小鼠的活动 15 分钟。
10. 测试后，将动物从网格中取出并放回笼子中。使用含有二氧化氯的灭菌剂彻底清洁网格。

5. 收集和检测小鼠的外周血

1. 对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。
   1. 腹膜内注射后 36 小时对实验小鼠实施安乐死。在安乐死前测量并记录小鼠的体重。
      注意:腹膜内注射 0.18 mL 10% 水合氯醛，确保对脚趾或尾巴的刺激没有反应。
   2. 用左手固定鼠标，用右手握住剪刀修剪鼠标一侧的胡须。
   3. 轻轻按压眼睛周围的皮肤，以诱导眼球充血和突出。
   4. 使用弯曲的镊子抓住眼球并快速取出，将外周血收集在微量离心管中。
      注意:使用了两种不同类型的微量离心管，一种含有抗凝剂，另一种不含。
   5. 同时，用左手中指轻轻按压小鼠的心脏区域，以增加心脏的泵血速度。
2. 将不含抗凝剂的外周血在室温下放置 30 分钟。
3. 使用自动生化分析仪通过酶速率法和酶循环法（遵循制造商的说明）测量血清淀粉酶 （Amy） 和脂肪酶 （Lip） 的浓度。
4. 使用商用化学发光成像仪（按照制造商的说明），使用化学发光方法确定血浆中炎症指示物的水平，例如降钙素原 （PCT）。
5. 使用 ELISA 试剂盒测量小鼠血清中的 HMGB-1、IL-6 和 TNF-α 水平（遵循制造商的说明）。
6. 使用全自动血细胞分析仪分析用抗凝剂处理的外周血，以评估相关参数。

6. 收集胰脏组织并准备石蜡切片

1. 将小鼠置于仰卧位并将它们固定在泡沫板上。
2. 剃除并消毒该区域，然后在腹部中间切开，将小肠管向右翻转，以完全暴露胰腺。
3. 断开十二指肠和幽门管，找到胰腺下方的小肠。沿肠导管完全释放胰腺组织。
4. 用无牙镊子夹住脾脏，轻轻向上拉。
   注意:请勿直接接触胰组织，并在整个解离过程中避免用力过猛。
5. 锐利地解剖胰后韧带组织直至胰头，并断开胆管和血管。
6. 取出胰组织，用吸水纸拍干表面水分，称重并记录。
7. 用 4% 多聚甲醛固定一半胰腺组织，并将另一半储存在 -80 °C 的冰箱中。
8. 按照以下步骤准备胰腺石蜡切片。
   1. 用 75% 酒精清洁固定的胰腺组织，并将其修剪成大约 0.5 厘米× 0.5 厘米的尺寸。
   2. 将组织浸入 70% 乙醇中 20 分钟，再用 80% 乙醇浸泡 20 分钟，用 90% 乙醇浸泡 15 分钟。
   3. 用 95% 乙醇处理组织两次，每次 15 分钟，然后用 100% 乙醇处理两次，每次 5 分钟。
   4. 用二甲苯溶液对组织进行两轮 12 分钟和 5 分钟的处理以提高透明度。
   5. 将透明纸巾在 65 °C 的蜡罐中浸泡 1 小时。
   6. 将组织包埋在融化的石蜡中并使其冷却。用切片机（厚度:5 μm）获得胰腺石蜡切片。
   7. 将获得的石蜡切片在45°C水中压平，封片并干燥（烘烤条件:40°C持续14-16小时）。

7. 苏木精和伊红 （H&E） 染色

1. 将胰腺石蜡切片置于二甲苯 I 和 II 中 30 分钟，然后在无水、95%、85% 和 75% 酒精中各 5 分钟，在超纯水中各 5 分钟。
2. 用苏木精对细胞核染色 160 秒，然后用流水缓慢冲洗。
3. 应用盐酸醇分化液 5-10 秒，然后用流水快速冲洗。
4. 用无水酒精处理切片 5 分钟。
5. 将细胞质与伊红孵育 30 秒，然后用流水冲洗。
6. 将切片浸入 75%、85%、95% 和 100% 乙醇中各 10 秒，然后用二甲苯处理 5 分钟脱水。
7. 最后，用中性树脂密封切片并在显微镜下观察。
8. 进行病理评分和标准¹³.
   注意:根据水肿、腺泡坏死、出血、出血和脂肪坏死以及炎症和血管周围炎症等指标确定胰腺炎的严重程度。使用之前发布的¹³ 分实施指南。

8. 免疫组化染色

1. 在二甲苯中对胰腺组织的石蜡包埋切片脱蜡，然后在乙醇溶液的梯度中再水化。
2. 膜破裂 30 分钟后，使用 3% H₂O₂ 进行内源性酶封闭 20 分钟。
3. 在室温下用 5% 牛血清封闭抗体 30 分钟，然后在 4°C 下用 1:1500 稀释的兔抗 HMGB1 孵育过夜。
4. 用 PBS 冲洗切片，然后在 37 °C 下将它们与相应的二抗孵育 30 分钟。 之后，进行 DAB 显色、苏木精复染，并用中性胶密封。

9. TUNEL 方法检测胰腺切片细胞凋亡

1. 将胰腺石蜡切片在二甲苯中脱蜡 5 分钟，重复两次并用梯度乙醇洗涤（100% 5 分钟，90% 2 分钟，70% 2 分钟，蒸馏水 2 分钟）。
2. 使用 PBS 洗去石蜡切片周围多余的液体。用 100 μL 蛋白酶 K 处理每个样品，确保完全覆盖组织。将样品在 37 °C 下孵育 20 分钟。随后，将样品浸泡在 PBS 中 3 次，每次 5 分钟。
   注:蛋白酶 K 溶液的制备方法是用 PBS 以 1:9（体积）的比例稀释原始蛋白酶 K （200 μg/mL） 溶液，得到 20 μg/mL 的最终浓度（不包括 DNase）。彻底洗涤蛋白酶 K 对于避免干扰后续标记反应至关重要。
3. 在组织上加入适量的 3% H₂O₂ （用 PBS 稀释）使其完全浸润并孵育 20 分钟。用 PBS 冲洗组织 3 次，每次 5 分钟。
   注意:石蜡切片应保持湿润。为了灭活组织中的内源性过氧化物酶，孵育时间不应太长，以防止由于 3% H₂O₂ 引起的 DNA 断裂而导致假阳性。
4. 用 50 μL 平衡缓冲液覆盖待测样品的整个区域并孵育 10 分钟。
5. 去除尽可能多的平衡缓冲液。然后，向每个组织样品中加入 56 μL TdT 孵育缓冲液并孵育 1 小时（在室温下）。
   注意:不应让载玻片干燥，并应避免暴露在光线下。根据制造商的说明制备 TdT 孵育缓冲液（重组 TdT 酶:生物素-dUTP 标记混合物:平衡缓冲液 = 1 μL:5 μL:50 μL）。
6. 立即用 PBS 洗涤组织样品。冲洗 4 次，每次 5 分钟。用滤纸轻轻去除样品周围多余的 PBS 溶液。
7. 向每个组织样品中加入 100 μL 先前稀释的链霉亲和素-HRP 反应溶液（链霉亲和素-HRP:TBST = 1:300）进行链霉亲和素-HRP 反应。孵育 30 分钟。然后，用 PBS 洗涤样品并冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 通过向每个石蜡切片中加入 50 μL DAB 进行 DAB 染色。在显微镜下实时观察染色。出现阳性染色后，立即将载玻片放入潮湿的盒子中。用纯水洗涤以终止反应。
9. 将载玻片浸入苏木精染色溶液中 3-5 分钟，然后用纯水冲洗。
10. 在苏木精分化溶液中分化约 2 秒，然后立即用纯水冲洗。
11. 使用苏木精 rebluing 溶液几秒钟获得蓝色，然后用纯水冲洗玻片。
    注意:核染色后进行显微镜检查。如果染色太暗，请将载玻片放回鉴别溶液中。如果染色太浅，请从细胞核染色步骤重新开始染色过程。
12. 用 4 轮新鲜无水乙醇脱水样品，每轮 5 分钟。然后，将它们浸泡在丁醇中 5 分钟，在二甲苯中浸泡 5 分钟。最后，再使用新鲜的二甲苯 5 分钟。
13. 使用中性胶安装载玻片。让它们自然风干或在 60 °C 的烤箱中干燥。
14. 使用白光显微镜进行组织学检查。凋亡细胞核呈棕色。
15. 计算相应的凋亡指数 （AI）。
    注意:以双盲方式观察载玻片。在 TUNEL 阳性载玻片中，在高放大倍率 （400x） 下随机选择 5 个阳性区域，并在每个区域中计数至少 100 个腺泡细胞以确定阳性细胞的百分比。AI =（凋亡细胞总数/细胞总数）× 100%。

10. 流式细胞术

1. 获得新鲜的胰腺组织，并在用 PBS 灌注后彻底清洗它们。
2. 准备 0.5% 胶原酶 IV 消化液，并使用无菌组织剪刀充分消化胰腺组织。
3. 根据胰腺碎片的状况和液体浊度，加入 5% BSA 消化终止溶液，并在低温下离心混合物 5 分钟（~300 x g ，4 °C）。
4. 弃去上清液以终止消化。
5. 制备含有苯基甲烷磺酰氟 （PMSF） 和 2.5% 胎牛血清细胞悬液的细胞培养基，以重悬胰腺细胞。
6. 通过 200 目尼龙网过滤胰腺腺泡细胞悬液，以通过细胞过滤获得细胞悬液。
7. 在低温下离心胰腺泡细胞悬液（遵循步骤 10.3 中提到的条件）。
8. 丢弃上清液。
9. 用预冷的 PBS 洗涤细胞。
10. 通过离心重悬，将细胞轻轻重悬于预冷的 1x 结合缓冲液中。
11. 调整细胞浓度后，根据制造商的说明用 Annexin V-FITC/PI 标记胰腺腺泡细胞。
12. 在 1 小时内使用流式细胞术检测胰腺腺泡细胞中的细胞凋亡。

11. Caspase-3 和 HMGB-1 的蛋白质印迹检测

1. 提取胰蛋白。
   1. 提取 50 毫克胰腺组织并将其切成小块。
   2. 加入 1 mL RIPA 裂解缓冲液（含有 PMSF 和磷酸化蛋白酶抑制剂）。
   3. 使用电动研磨机将胰腺组织在冰上匀浆 5 分钟。
   4. 将匀浆组织在冰上轻轻摇动孵育 2 小时。
   5. 将匀浆在 4 °C 下以 4,500 x g 离心 10 分钟。
   6. 收集上清液并储存在 -80 °C。
2. 进行蛋白质定量。
   1. 将一定量的 BSA 标准品样品 （25 mg/mL） 稀释至 0.5 mg/mL 的浓度。
   2. 通过将 50 体积的 BCA 溶液 A 与 1 体积的 BCA 溶液 B 混合，制备一定量的 BCA 工作溶液，确保充分均匀混合。
   3. 将 BSA 标准样品按量程为 0、1、2、4、8、12、16 和 20 μL 放入 96 孔板上的标准样品孔中。用蒸馏水平衡每个孔的体积，得到 20 μL 的总体积。
   4. 将 2 μL 样品加入样品孔中，然后依次加入 18 μL 蒸馏水进行稀释 （1:9）。
   5. 用 200 μL BCA 工作溶液填充每个孔，并使其在 37 °C 下静置约 20-30 分钟。
   6. 测量 562 nm 波长处的吸光度。根据标准曲线计算样品的蛋白质浓度。
   7. 加入特定体积的 RIPA 裂解液和稀释缓冲液，稀释样品直至浓度达到 5-10 μg/μL，认为这是合适的。
   8. 蛋白质变性后（100°C;10分钟），将样品储存在-20°C。
3. 进行 Western 印迹。
   1. 为 SDS-PAGE 做准备。
      1. 安装制胶模具并检查其密封性能。
      2. 将 TEMED 添加到 10% 分离胶粘剂中并混合均匀。
      3. 将混合物注入模具中，约占体积的三分之二，同时避免气泡。
      4. 将异丙醇加入模具中，压制粘合剂约 40 分钟。
      5. 使用相同的程序配置 5% 的浓缩胶粘剂。
      6. 倒出异丙醇并立即加入粘合剂。
      7. 将梳子垂直放置，直到胶水完全聚合。
   2. 执行电泳操作。
      1. 按照预期的实验对照顺序，以相反的顺序将待测样品添加到 SDS-PAGE 粘合剂的采样孔中。
      2. 同时添加 Protein Mark 以确定目标蛋白和内部参比蛋白的位置。
      3. 样品添加完成后，将样品放入电泳槽中。
      4. 最初，在 80 V 下运行 30 分钟，然后在 100 V 下运行凝胶以分离蛋白质 60 分钟。
         注意:应注意溴酚蓝的位置，以避免过度电泳。
   3. 进行蛋白质转移。
      1. 剪下右上角的 PVDF 薄膜作为标记。
      2. 将 PVDF 薄膜置于甲醇溶液中 5-10 秒以活化。
      3. 将 PVDF 膜浸泡在电泳缓冲液中约 15 分钟。
      4. 电泳后小心地去除凝胶并修剪多余的凝胶，确保凝胶在整个过程中保持湿润。
      5. 按以下顺序组装夹板: 负板→海绵 → 三层滤纸→ PVDF 膜→凝胶→三层滤纸→海绵→正板。
         注意:确保凝胶和 PVDF 薄膜之间没有气泡。
      6. 将组装好的夹子放入湿的旋转槽（黑色到黑色）中，并在其周围放置冰块。
      7. 打开电源并以 400 mA 开始胶片传输 100 分钟。
   4. 进行 PVDF 薄膜密封，以及一抗和二抗的孵育。
      1. 转移后轻轻去除 PVDF 薄膜，用 TBST 冲洗 10 分钟，重复该过程 3-5 次。
      2. 将 PVDF 薄膜密封在 5% 脱脂牛奶中 2 小时。
      3. 去除 PVDF 薄膜，用 TBST 冲洗 10 分钟，重复该过程 4 次。
      4. 将 PVDF 薄膜和稀释的一抗一起放入 4 °C 的冰箱中，轻轻摇动并孵育过夜。
      5. 第二天去除 PVDF 薄膜，用 TBST 冲洗 10 分钟，重复该过程 4 次。
      6. 将 PVDF 膜在 HRP 标记的二抗稀释剂中孵育约 2 小时。
      7. 用 TBST 冲洗 PVDF 薄膜 10 分钟，重复该过程 4 次。
   5. 曝光胶片并进行分析。
      1. 将准备好的 ECL 溶液均匀地涂在薄膜上。
      2. 将胶片在暗室中用曝光计曝光约 2-3 分钟，然后存放。
      3. 使用 Image J 软件进行分析。

实验小鼠建模的过程如图 1 所示。注射完成 12 小时后，使用旷场录像机监测不同实验组小鼠的运动距离和不动持续时间 5 个周期（图 2A）。在 5 个周期中，PI V 组小鼠在 3 分钟内保持低水平的运动距离，而 3 分钟内的不动率随着随后的每个周期而增加（图 2B、C）。此外，对不同实验组小鼠在 5 个周期内的总运动距离进行统计分析。与其他实验组相比，PI V 组的总移动距离最小，差异具有统计学意义 （p < 0.001）（图 2D，E）。除对照组和 PI I 组外，其他实验组小鼠的 D 值体重均表现出负增长。其中，PI V 组的体重变化最大，与其他实验组相比体重变化的差异具有统计学意义（图 2F）。在评估每个实验组另外 10 只小鼠的存活率后，结果显示 PI V 组小鼠在^第 5 天的死亡率达到 80%。然而，其他四个实验组和对照组小鼠之间的死亡率没有统计学上的显着差异（图 2G）。

使用高功率显微镜，在 PI IV 和 PI V 小鼠组中观察到明显的细胞肿胀、坏死和炎性细胞浸润（图 3A、B）。使用补充表 2 中提供的评级标准，评估了不同实验组小鼠的胰腺病理，并观察到与对照组小鼠相比胰腺病理评分存在显着差异 （p < 0.001）（图 3C;补充图 1）。此外，与对照组相比，PI II 至 PI V 实验组测定小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平显著升高，差异有统计学意义。有趣的是，PI I 组小鼠没有统计学上的显着差异（图 3D，E）。采用 ELISA 方法评估小鼠血清中炎症标志物¹⁴ 的水平，包括 TNF-α 和 IL-6。结果显示，PI V 组小鼠的 TNF-α 和 IL-6 水平显著高于其他实验组，差异有统计学意义（图 3F，G）。与对照组相比，所有四个实验组的 PCT 水平都有所增加，但只有 PI V 组的差异具有统计学意义 （p < 0.05）（图 3H）。

不同实验组小鼠胰腺组织的凋亡状态
通过对每组小鼠的胰腺组织进行 TUNEL 染色，观察到不同实验组胰腺组织中的细胞坏死状态（图 4A）。使用 Image J 软件对胰腺组织切片每单位面积的灰度值 （OD） 和细胞坏死阳性率进行半定量分析。结果表明，与其他实验组相比，PI V 组小鼠胰腺组织中的细胞坏死水平显着增加，差异具有统计学意义 （p < 0.001）（图 4B，C）。进行蛋白质免疫印迹实验以评估来自不同实验组小鼠胰腺组织中半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3 （Caspase-3） 的表达水平，这是一种细胞坏死标志物（图 4D）。caspase-3 表达定量显示，PI V 组胰腺组织中 caspase-3 蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义 （p < 0.001）。蛋白质表达水平被定量并标准化为内部对照 GapDH（图 4E）。此外，用 Annexin V-FITC/PI 标记新鲜胰腺腺泡细胞悬液，并通过流式细胞术分析。发现，与其他小鼠实验组相比，PI V 组的细胞死亡率阳性率显着升高，这在统计学上显着 （p < 0.001）（图 4F，G）。

外周血清中 HMGB-1 的含量及胰腺组织中 HMGB-1 的表达水平
为探讨 HMGB-1 蛋白与胰腺损伤的关系，对各实验组小鼠胰腺组织进行免疫组化染色和定量。实验组和对照组之间存在统计学上的显着差异 （p < 0.001） （图 5A，B）。ELISA 检测不同实验组小鼠血清中 HMGB-1 水平。结果显示，与对照组相比，所有实验组的 HMGB-1 血清水平均显著升高，其中 PI V 组的血清水平最高，差异具有统计学意义 （p < 0.001） （图 5C）。此外，Western blot 分析检测到所有实验组小鼠胰腺组织中 HMGB-1 蛋白的表达升高，与对照组相比具有统计学意义差异 （p < 0.001） （图 5D，E）。

图 1:实验流程图。 第 2 天和第 3 天:腹膜内注射。第 4 天:旷场实验在最后一次腹膜内注射 12 小时后开始。第 5 天:腹膜内注射后 36 小时安乐死。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:PI 小鼠模型中的宏观变化。 （A） 描绘了小鼠的实时运动轨迹图。（B） 不同实验组小鼠在每个监测期内的总运动距离。（C） 不同实验组小鼠在每个监测期内不动时间的百分比。（D，E）分析不同实验组小鼠 15 min 内的总运动距离和不动时间百分比。（F） 显示了建模过程前后小鼠体重的 D 值。（G） 观察每组 10 只小鼠在腹腔注射后 7 天的存活率。数据表示为 SEM ±平均值，n = 4。"ns" 表示不显著，*P < 0.05，****P < 0.001。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:不同实验组小鼠胰腺炎的病理变化。（A） 不同实验组小鼠胰腺组织的 H&E 染色组织学切片（石蜡包埋的胰腺组织切片用苏木精和伊红染色，放大倍数分别为 100 倍和比例尺 200 μm，以及 400 倍和比例尺 50 μm）。黄色长箭头表示小岛;红色长箭头表示腺泡细胞;棕色长箭头表示血管;蓝色长箭头表示导管）。（B） 小鼠胰腺重量与体重之比的计算。（C） 小鼠胰腺的病理评分。（D，E）检测小鼠血清淀粉酶和脂肪酶水平。（F-G）小鼠血清 TNF-α 和 IL-6 水平的 ELISA 测量。（H） PCT 水平评估。数据表示为 SEM ±平均值，n = 4。"ns" 表示不显著，*P < 0.05，****P < 0.001。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:小鼠胰腺组织凋亡。 （A） 从小鼠的胰腺石蜡切片和放大区域图像中获得 TUNEL 染色的代表性图像。（400x，比例尺 50 μm，棕黄色是阳性细胞）。（B，C）定量分析小鼠胰腺组织 TUNEL 染色切片每单位面积的灰度值和阳性染色死细胞的百分比。（D） Western blot 检测胰腺组织中 Caspase-3 的表达水平。（E） 胰腺组织中 Caspase-3 表达的定量。（F） 采用流式细胞术评估小鼠胰腺腺泡细胞的细胞死亡程度。（G） 小鼠胰腺腺泡细胞中晚期死细胞的计数。数据表示为 SEM ±平均值，n = 4。"ns" 表示不显著，*P < 0.05，****P < 0.001。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:HMGB-1 在小鼠胰腺组织中的表达。 （A） 胰腺切片上 HMGB-1 免疫组织化学染色的代表性图像和放大图像（x400，比例尺 50 μm）。棕黄色表示阳性细胞 （n = 4）。（B） 胰腺组织切片中 HMGB-1 阳性细胞的百分比 （n = 24）。（C） 小鼠血清中 HMGB-1 的水平 （n = 4）。（D，E）进行 Western blot 检测胰腺组织中 HMGB-1 的表达水平并获得定量结果 （n = 4）。数据表示为 SEM ±平均值，"ns"表示不显著，*P < 0.05，****P < 0.001。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图 1:PI V 组小鼠模型中的多器官损伤。 （A） 使用 H&E 染色 （200 倍放大倍率，比例尺 50 μm） 分析从 CON 和 PI V 组小鼠收集的胰腺、肺、肝脏和肾脏组织学变化的代表性图像。与腺泡细胞坏死相关的病理改变用黑色箭头表示。黄色箭头表示以肺泡间质出血和水肿为特征的病理变化。肝细胞水肿和坏死用绿色箭头表示。肾小球出血相关的病理改变用红色箭头标记。（B） 对 CON 组和 PI V 组小鼠获得的胰腺、肺、肝和肾组织进行组织学评分计算。 请点击此处下载此文件。

补充表 1:腹膜内注射方案。请点击此处下载此文件。

补充表 2:胰腺炎严重程度的病理评分标准。请点击此处下载此文件。

目前，缺乏有效的方法来改善严重急性胰腺炎患者的高死亡率。研究药物在增强免疫稳定机制方面的疗效至关重要。迫切需要一种理想的严重急性胰腺炎动物模型。具有 C57BL/6J 遗传背景的小鼠广泛用于生物医学研究，包括 SAP 病理生理学研究。B6J 小鼠 70 多年的遗传分化导致几个外显子自发缺失¹⁵，导致对 Caerulein 诱导的胰腺损伤的敏感性降低¹⁶。此外，现有的急性胰腺炎动物模型存在局限性，例如手术创伤或仅适用于大型动物，这阻碍了使用这些模型的科学研究。因此，使用这种特定的基因株建立稳定、高效和方便的动物模型非常有价值。

Caerulein 是胆囊收缩素的类似物，当小鼠禁食并储存足够量的消化液时，通过高频注射在短时间内通过高频注射引起胰腺消化液和酶分泌的相对阻塞来诱导胰腺组织损伤¹⁷。LPS 是细菌细胞壁中发现的主要成分，可导致小鼠 MODS 和 SIRS¹⁸。先前的一项研究表明，将不同频率的 Caerulein 注射与通过腹膜内注射给药的不同剂量的 LPS 相结合，可诱导在人类 SAP 中观察到的类似病理变化^19,20。本研究使用非侵入性方法，通过将不同频率的 Caerulein 注射与不同剂量的 LPS 腹膜内注射相结合，诱导不同程度的胰腺损伤。在方案制定过程中，确保腹膜均匀吸收至关重要。为了满足这一要求，严格遵守腹腔注射的步骤至关重要，以确保对每种药物给药的精确控制。此外，每次注射药物后，用无菌棉签轻轻摩擦和对注射部位施加适当的压力对于药物在整个腹膜腔的均匀分布至关重要。此外，将针头准确且精确地放置在腹膜腔中，使针头指向上腹部的中央区域，这一点至关重要。应进行事先培训，以使操作员能够准确感知将针头插入腹腔时是否有任何阻力。使用微量定量输液泵代替手动操作可能会提高药物注射质量;不幸的是，这在这项研究中没有实施。然而，通过采用不同的注射方案，我们诱导了不同程度的胰腺损伤，并有效观察到在相同的技术条件下，Caerulein 联合 LPS 注射诱导的不同频率和剂量引起的胰腺损伤的差异。这为未来在 Caerulein 用于严重急性胰腺炎诱导的非侵入性动物模型中的使用提供了有价值的见解。

Caerulein 和 LPS 的组合导致血清淀粉酶和脂肪酶水平显著升高、胰腺重量增加和组织学变化，包括炎症细胞的广泛浸润、胰腺腺泡细胞水肿、坏死和出血，如苏木精和伊红 （HE） 染色所示。此外，随着 LPS 剂量的增加，胰腺的病理变化变得更加明显。然而，值得注意的是，PI IV 组和 PI V 组之间的胰腺病理评分没有明显差异，而 PI III 组的胰腺组织细胞坏死程度与 PI IV 组相比更为明显。这一观察结果表明，Caerulein 的给药频率可能是导致胰腺损伤的主要因素，而 LPS 会加剧其进展，导致全身炎症损伤^18,21。HMGB-1 是一种根据其位置发挥作用的蛋白质²².细胞外 HMGB-1 作为一种参与炎症警告信号的蛋白质，与急性胰腺炎的严重程度密切相关 23,24,25。在本研究中，与对照组相比，所有实验组小鼠的血清 HMGB-1 水平均显著升高，其中 PI V 组升高最为显著。免疫组织化学和蛋白质电泳实验也证实了 HMGB-1 在胰腺组织中的高表达。这种重要的蛋白质可作为抑制严重急性胰腺炎炎症风暴的治疗靶点。

总之，在小鼠中开发一种非侵入性、简单且易于执行的 SAP 模型至关重要。在该实验方案中，使用 Caerulein 联合 LPS 诱导胰腺损伤是可靠且有效的。通过以 50 μg/kg 的剂量腹膜内注射 Caerulein 连续 10 天，然后单次腹膜内注射 15 mg/kg LPS，可以建立稳定、可靠、经济高效、高效的 SAP 动物模型。

作者没有需要披露的利益冲突。

这项研究得到了淮南市健康与医学科学研究项目 （No.HNWJ2023005）;淮南市市指导科技计划项目（2023151号）;安徽省大学生创新创业训练计划（第S202310361254号）;"50·"科技之星"创新团队 淮南市和安徽省临床重点专科建设项目。感谢安徽科技大学第一附属医院检验科提供相关检测数据。