人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞在最佳阶段的冷冻保存

本研究为人类干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞的有效冷冻保存提供了详细的方案。

源自人胚胎干细胞 （hESC） 的视网膜色素上皮 （RPE） 细胞是视网膜退行性疾病患者细胞替代疗法的优越细胞来源;然而，关于这些治疗性细胞的稳定和安全储存的研究很少。冻存后RPE细胞的细胞活力和功能恢复变化很大，这是最常遇到的问题。在本方案中，我们旨在通过根据原始实验条件选择最佳的细胞相进行冷冻，从而实现解冻后的最佳细胞回收率。使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷标记测定法测定的指数期冷冻细胞，提高了解冻后的细胞活力和恢复率。解冻后不久即可获得稳定且功能性的细胞，与漫长的分化过程无关。这里描述的方法允许简单、高效和廉价地保存和解冻 hESC 衍生的 RPE 细胞。尽管该协议侧重于RPE细胞，但这种冷冻策略可以应用于许多其他类型的分化细胞。

视网膜色素上皮 （RPE） 是维持视网膜正常功能所必需的色素沉着单层细胞¹。RPE 功能障碍和死亡与许多视网膜退行性疾病密切相关，包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性和 Stargardt 病 ^2,3。RPE替代疗法是^{这些疾病最}有前途的治疗方案之一4,5,6,7。供体RPE细胞的稳定供应对于细胞治疗至关重要。人胚胎干细胞 （hESC） 衍生的 RPE 细胞是细胞治疗的理想细胞来源，因为它们模仿原代 RPE 细胞的功能，并且可以产生理论上无限的供应⁸。然而，分化过程很费力，并且由于随后的上皮-间充质转化 （EMT），获得的 RPE 细胞的保质期相对较短。因此，hESC来源的RPE细胞的冻存是长期储存和按需分发所必需的必不可少的步骤⁹。

冷冻保存诱导的细胞损伤可能会无意中影响治疗效果^10,11。因此，最近关于冷冻保存的研究提出，在设计细胞疗法时，应确定最佳的低温储存条件¹²。成功的冻存保证了高效的细胞回收、高活力和冻融循环后的细胞功能恢复。然而，先前关于哺乳动物细胞贴壁单层冻存的研究报告称，解冻后的存活率变化很大 （35%-95%）13,14,15。许多因素都会极大地影响冷冻保存的结果，尤其是在冷冻阶段^16,17。最近的研究表明，在不同时间点冷冻的RPE细胞在解冻后表现出不同的恢复^率17。据我们所知，目前缺乏关于确定干细胞来源的RPE细胞最佳冷冻时间窗口的研究。在不同的研究中，细胞在不同阶段被冷冻:一些细胞在传代后不久或汇合或色素沉着之前被冷冻 ^8,15,18，^而其他细胞在其他时间点 ^9,19,20,21 被冷冻。此外，没有明确的证据表明用于冻存的RPE细胞的阶段或阶段是否会影响解冻后的RPE功能。在我们之前的研究中，我们首次证明了细胞生长的指数阶段（P2D5）是hESC衍生的RPE细胞冻存的最佳阶段，就细胞活力和细胞特性和功能的恢复而言¹⁷。

本文建立的方法旨在将hESC衍生的RPE冷冻保存在最佳阶段，以达到解冻后细胞活力和功能的最佳保存效果。使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记试验检测冻存前DNA合成的指数阶段，解冻的RPE细胞表现出>80%的活力和附着率、RPE特异性基因表达、极化细胞形态、色素上皮衍生因子分泌、适当的跨上皮抵抗和吞噬能力^8,17,22.尽管该方案侧重于hESC衍生的RPE细胞，并且并非所有治疗细胞都同样冷冻保存，但在指数期冷冻的策略可以应用于许多其他治疗细胞。

1. 细胞解离

1. 如前所述维持RPE细胞^17,22。
   注意:在整个方案期间，所有细胞在37°C下在5%CO₂ 气氛中生长。
2. 在37°C水浴中制备所需量的PBS和培养基，并将细胞解离试剂置于室温下。
3. 丢弃培养溶液，每孔用 1 mL 预热的 PBS 洗涤板两次。
4. 将 1 mL 细胞解离试剂加入 6 孔板中，并在 37 °C 下消化细胞 15 分钟。孵育后，在显微镜下观察边缘收缩和发光的细胞，以确认消化终止。
   注意:不建议使用基于胰蛋白酶的解离，因为它会导致细胞活力低下。
5. 用 1 mL 移液管轻轻上下移液 10 次以解离细胞，并用预热的培养基（不含 Y-27632）以 1:10 的比例稀释细胞悬浮液。然后，在室温下以 250 × g 离心细胞 3 分钟。
6. 离心后迅速倒出上清液，轻轻地将细胞沉淀重悬于 2 mL 培养基中，然后用移液管重悬细胞 10-15 次。
7. 用40μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液，以获得单细胞悬浮液并计算细胞数。
   注:单细胞悬浮液对于解冻后的准确细胞计数和均匀的细胞接种密度至关重要。

2. 确定冷冻保存的最佳细胞阶段

注:由于分化方法和细胞系之间的细胞状态不同，因此应在冷冻前确定在不同实验室培养的RPE细胞的指数阶段。

1. 在4°C的冰上解冻一小瓶基底膜基质溶液过夜。将基质稀释到 12 mL 冷 DMEM/F-12 中并充分混合。每孔添加一个盖玻片，并用 0.25 mL 稀释溶液包被 24 孔板的每个孔。使用前将板在室温下孵育1小时或在4°C下孵育过夜，并在接种细胞之前吸出包被溶液。
   注:等分试样体积的说明基于蛋白质浓度的批次特异性说明，可在产品规格表中找到。
2. 将步骤 1.7 的 RPE 单细胞以 10⁵/cm² 的密度接种在 1 mL 培养基中的基底膜基质包被盖玻片上。每 2-3 天更新一次培养基。
3. 在指定的时间点（传代后 1、3、5、7 和 11 天），将 RPE 细胞与 10 μM EdU 在培养基中孵育 24 小时。按照手册中所述，用反应混合物固定、透化和染色细胞，以检测掺入的 EdU。
4. 在荧光显微镜下从五个随机场捕获图像，并计算EdU阳性细胞的百分比。绘制相应的 EdU-正比例-时间曲线以生成生长曲线。然后，根据生长曲线确定每个细胞系的冷冻窗口或指数阶段。
   注意:重建的六边形细胞形态表明细胞退出指数阶段。

3. 冷冻保存

1. 遵循步骤1.1至1.7，除了消化时间减少至5分钟外，将细胞悬浮液在室温下以250× g离心3分钟。
2. 离心后快速倒去上清液，将细胞沉淀轻轻重悬于冻存培养基中，密度为 2 × 10⁶ 个细胞/mL，并将 1 mL 细胞悬液转移到 1.2 mL 低温瓶中。
3. 立即将低温小瓶放入冷冻容器中，在-80°C下冷冻过夜以达到-1°C / min的冷却速率，然后将小瓶转移到液氮中长期储存。

4. 解冻

1. 在37°C水浴中加热培养基，并将10mL预热的培养基预填充到15mL管中。
2. 使用自动解冻系统快速解冻直接从液氮储存中取出的低温样品瓶。
3. 将0.5-1 mL预热的培养基滴入低温瓶中，以确保冷冻细胞逐渐适应新环境。然后，将 1.5-2 mL 细胞悬液转移到 15 mL 管中的 10 mL 培养基中，并在室温下以 250 × g 离心细胞 3 分钟。
4. 离心后快速倒去上清液，将沉淀重悬于 2 mL 预热的培养基中，并使用血细胞计数器计数细胞数，以使用标准台盼蓝排除物（0.4% 台盼蓝染色剂）确定回收率和存活率。
5. 在补充有Y-27632（终浓度:10μM）的培养基中，以10⁵ 活细胞/^{cm 2} 的密度在基底膜基质包被表面上培养细胞。24小时后取出Y-27632。
6. 为了确定附着率，再次解离细胞并在解冻后24小时计数细胞数。

5. 验证最佳冷冻阶段

1. 为了验证步骤 2.4 中确定的最佳冷冻阶段，解冻在不同时间点冷冻的 RPE 细胞并培养 28 天。收获细胞进行 qPCR 和免疫染色分析，以评估 RPE 标志物的表达，如前所述¹⁷。

在这里，将 P1D35 的 hESC 衍生的 RPE 细胞传代并以 10⁵/cm² 的密度接种。在播种后的一周内，特征性的六边形形态和色素沉着在滞后期（约 2 天）丢失。RPE细胞在指数阶段（约5天，图1A）逐渐重新采用六边形形态，并进入减速阶段（约6天），形态更多多边形。如果细胞培养再持续一周，细胞增殖会显着减少，细胞间连接起主要作用，边缘会亮起;此时，细胞不再处于指数阶段（图1A，P2D11）。除细胞形态外，还进行了 EdU 细胞增殖测定以帮助确定相位。图1B表明，P2D5细胞表现出更高的增殖率（指数期），而P2D11细胞已进入减速期。

在液氮中冷冻1-3个月后，解冻RPE细胞。解冻后，一些细胞降解为亚细胞碎片，一些细胞凋亡，其余细胞存活。24小时后，在P2D5冷冻的RPE细胞比其他时间点冷冻的RPE细胞表现出更高的附着率（图2A）。此外，它们早在解冻后 14 天就表现出成熟 RPE 细胞的特征性六边形形态，具有明显的细胞间粘附（紧密连接）。相比之下，在其他时间点冷冻的细胞通常采用成纤维细胞表型（图2A），表明它们正在经历相对较长的EMT过渡期。解冻28天后，在P2D5冷冻的RPE显示出更高表达和更正确定位的RPE细胞标记物，如qPCR（图2B）和免疫荧光染色（图2C，D）所示。

为了测试该协议在不同冻存培养基中的稳定性，比较了该协议中应用的两种冻存培养基的性能。结果表明，两种冻存培养基在实现高细胞活力和解冻后的附着方面表现同样出色（图3）。

图 1:即用型冷冻 RPE 细胞的代表性图像。 （A） P2D5 的 RPE 细胞比 P2D11 的六边形形态和色素沉着较少。（B） 如 EdU 测定所示，P2D5 的 RPE 细胞比 P2D11 的 RPE 细胞表现出更高的增殖率。比例尺 = 100 μm。缩写:RPE=视网膜色素上皮;BF = 明场;EdU = 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:解冻后 RPE 细胞的代表性图像。 （A） 在P2D5冷冻的RPE细胞在解冻后24 h表现出更好的附着力（左列），在解冻后更早-14天表现出六边形形态（右列）。突出显示了 P2D5 组中具有致密形态（箭头）的特征性 RPE 细胞，P2D11 组中具有不满意的成纤维细胞样形态（箭头）和细胞碎片（黄色箭头）。（B-D）这些图像修改自 Zhang 等人¹⁷。（B，C）在P2D5冷冻的RPE细胞在解冻28天后表现出更高的典型RPE标记基因的mRNA和蛋白质表达水平。统计差异通过双向方差分析和 Bonferroni 事后检验进行评估。*P < 0.05。（D） 解冻后 28 天沿顶端至基底轴的免疫染色分析显示，冷冻在 P2D5 的 RPE 细胞极性更好。细胞核用DAPI复染。比例尺 = 50 μm （A）， 25 μm （C，D）。缩写:RPE=视网膜色素上皮;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:方案中应用的两种冻存培养基的性能。 （A） 在解冻冻冻态 P2D5 的 hESC 衍生的 RPE 细胞时测量细胞活力率。（B） 解冻后 24 小时从两种不同的冷冻培养基（#1 和 #2）解冻的 RPE 细胞的明场图像。比例尺 = 100 μm。缩写:RPE=视网膜色素上皮;hESC = 人类胚胎干细胞。 请点击这里查看此图的较大版本.

在本研究中，描述了用于研究和临床需求的 hESC 衍生的 RPE 细胞的成功冻融方案。与永生化的 RPE 细胞系 ARPE-19 不同，具有适当特征性上皮表型和功能的 RPE 细胞，如干细胞衍生的 RPE 细胞，对冻存更敏感。如果保存不当，不到 32% 的细胞在解冻后 24 小时内保留¹⁷。冷冻保存时间是一个关键参数。永生化细胞冻存的一个既定观点是在指数生长阶段冷冻细胞。分化的细胞离开细胞周期。因此，对于分化的细胞，很少考虑生长期对冻存的影响。我们证明，hESC分化的RPE细胞在短时间内恢复了增殖能力，并在传代后进入指数阶段。通过在指数期¹⁷ 期间冷冻保存 RPE 细胞，可以实现更好的结果。

该协议的局限性在于仅测试了两种类型的冻存培养基。不同的冷冻保存介质可能以不同的方式预防冷冻损伤²³;因此，冻存培养基可能会影响RPE细胞冻存的最佳阶段。应进一步评估冻存培养基是否影响最佳冷冻时间。

本研究中提出的冷冻保存方案可以很容易地适应不同实验室的使用，通过在冷冻RPE细胞之前确定RPE细胞的指数阶段，使其更不受特定培养期、分化方法或细胞系的影响。除了评估细胞形态外，EdU 检测还提供简单的评估，以确保细胞在指数期保存。

目前的方案是一种简单有效的冷冻保存RPE细胞的方法。该策略可用于冷冻保存其他类型的分化细胞。

作者没有要披露的利益冲突。

这项工作由国家自然科学基金（81970816）资助，以梅江;国家自然科学基金面上基金面上项目（82201223年）朱新月;以及上海市科委科技创新行动计划（2014090067000）授予刘海云。