相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）在脑切片中成像髓鞘形成的应用

可视化髓鞘形成是许多研究神经系统的研究人员的重要目标。CARS是一种与免疫荧光兼容的技术，可以对组织内的脂质进行天然成像，例如大脑，照亮髓磷脂等特殊结构。

相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）是化学家和物理学家经典采用的一种技术，用于产生分子特征振动的相干信号。然而，这些振动特征也是解剖组织（如大脑）内分子的特征，使其越来越有用和适用于神经科学应用。例如，CARS可以通过特异性激发这些分子内的化学键来测量脂质，从而可以量化组织的不同方面，例如参与神经传递的髓磷脂。此外，与通常用于定量髓磷脂的其他技术相比，CARS还可以设置为与免疫荧光技术兼容，允许与其他标记物（如钠通道或突触传递的其他成分）共同标记。髓鞘形成变化是脱髓鞘疾病（如多发性硬化症）或其他神经系统疾病（如脆性X综合征或自闭症谱系障碍）的固有重要机制，是一个新兴的研究领域。总之，CARS可以以创新的方式用于回答神经科学中的紧迫问题，并为与许多不同神经系统疾病相关的潜在机制提供证据。

动作电位是大脑中信息的基本单位，通过轴突传播的动作电位构成了^{信息处理的}支柱1，^2，3。神经元通常接收来自多个其他神经元的传入输入，并在给定的狭窄时间窗口^4，5内整合这些输入。因此，轴突中作用电位传播的机制受到了研究者的极大关注。

当通过轴突传播时，动作电位沿轴突反复再生，以确保可靠的传播⁶。在颌脊椎动物（gnathostomes）的大多数神经元中，轴突被髓磷脂鞘包围，髓鞘是由附近的少突胶质细胞或雪旺细胞产生的富含脂质的物质，这是神经胶质细胞的类型（回顾于^7，8）。这种髓鞘对轴突进行电绝缘，降低其电容，并允许动作电位高效、快速且能耗更低。髓磷脂不能均匀地覆盖轴突，但它将轴突包裹在它们之间有短间隙的段中，称为Ranvier的节点（在^9，10中回顾）。控制轴突电绝缘水平的髓鞘厚度和控制动作电位沿轴突再生频率的Ranvier节点间距都会影响动作电位传播的速度（^在11中回顾）。

有大量文献表明髓鞘厚度影响轴突¹²，^13，14中动作电位传播的速度。此外，轴突髓鞘形成的改变可导致许多CNS缺陷¹⁵，16，¹⁷，¹⁸，¹⁹，^20，21。因此，许多研究工作的重点涉及轴突髓鞘形成的测量和表征也就不足为奇了。髓鞘厚度的测量最常使用电子显微镜进行，这种技术需要大量的组织准备，并且与免疫组织化学结合使用具有挑战性。然而，还有一种基于相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）的更快、更简单的轴突髓鞘形成测量技术。CARS激光器可以调谐到各种频率，当调谐到适合激发脂质的频率时，髓磷脂可以成像，而无需任何额外的标记²²。脂质成像可以与标准免疫组织化学相结合，使得脂质可以与几个荧光通道一起成像²³。使用CARS对髓鞘形成进行成像明显快于电子显微镜，并且其分辨率尽管低于EM，但足以检测相同类型轴突中髓鞘形成的微小差异。

所有实验均符合所有适用法律、美国国立卫生研究院指南，并已获得科罗拉多大学安舒茨机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 动物

1. 使用从杰克逊实验室获得的C57BL / 6J（股票#000664）小鼠（Mus musculus ）或最初从查尔斯河获得的蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）。

2. 组织准备

1. 对于经心灌注，用戊巴比妥（120 mg/kg体重）过量，并经心灌注磷酸盐缓冲盐水（PBS;137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.76 mM KH 2 PO 4，10 mM Na₂HPO 4），然后用₄%多聚甲醛（PFA）²⁴。
   1. 具体来说，用剪刀打开腹部和肋骨，并用凯利止血钳将肋骨固定到位，露出心脏。
   2. 将连接到灌注泵的 23 GA 针插入左心室，并使用细剪刀快速切割右心房。
   3. 通过灌注泵和心脏中的针头施用PBS10分钟，以清除大脑和体内的血液。
   4. 将灌注泵切换到4%PFA10分钟，并检查四肢和尾巴的硬度以确认成功灌注。
2. 灌注后，将动物斩首并从头骨中取出大脑。在转移到PBS之前，将大脑保持在4%PFA中过夜。将脑干嵌入4%琼脂糖（PBS中），并使用200μm厚的振动切片机进行冠状切片。

3. 染色

1. Nissl的无染色浮动切片，以可视化细胞体（1:100），在抗体培养基（AB培养基:0.1M磷酸盐缓冲液（PB:50mM KH₂PO 4，150mM Na₂HPO₄），150mM NaCl，3mM Triton-X，1%牛血清白蛋白（BSA））中在室温下在标准实验室摇床²⁵上30分钟。
   1. 使用铝箔和/或盖子保护部分免受光照。550 nm或以下波长与CARS成像兼容（图1）。
      注意:虽然我们预计Triton-X或其他试剂不会对脂质的CARS成像产生影响，但可能需要使用特定抗体培养基进行额外的控制。
2. 暂停点:将自由浮动部分（避光）存储在PBS中，直到成像。切片后，在 2 周内对大脑切片进行成像。

图1:CARS成像可以与免疫荧光成像相结合。 该图显示CARS成像发生在660/640nm红色信号光谱²⁶处。该波长与绿色、蓝色或紫外线范围足够远，允许CARS信号与这些范围内的免疫荧光相结合。具体而言，该图还显示了用蓝色荧光团标记的Nissl的激发和发射，在收集本出版物的代表性结果期间，将其与CARS相结合。 请点击此处查看此图的大图。

4. 成像

注意:CARS激光器设置包含一个提供80 MHz时钟的光纤激光器和一个可调范围为770-990 nm的OPO（光学参量振荡器）激光器，斯托克斯光束固定在1031 nm，这是收集CARS信号所必需的。两个光束都有一个孔径。

1. 在将样品带到显微镜之前，打开并预热CARS激光器至少1小时，对准CARS激光器，Koehler将聚光镜光学元件和显微镜的光圈用于前向CARS成像。
   注意:此步骤对于CARS显微镜的正常运行至关重要。
   1. 对于两个激光束（泵浦和斯托克斯）的空间对准，通过CARS激光GUI访问两个内部PSD（位置敏感探测器）。
   2. 通过使用CARS激光GUI中的延迟功能实现时间对准，该功能可以帮助重叠两个激光器（泵浦和斯托克斯）的脉冲，这两个激光器由于波长不同而具有不同的色散。因此，泵浦和斯托克斯光束的时间和空间重叠都是通过GUI的用户输入完成的。
   3. 调整外部潜望镜（设置的最后两个镜子），将空间重叠的两个激光器居中到显微镜的扫描头镜上。
   4. 为了获得最佳的前向CARS非去扫描检测，请确保聚光镜是科勒的（这意味着聚光镜居中并聚焦在光圈上以实现均匀的照明）
2. 对于免疫荧光共聚焦成像和CARS成像，通过结合配备可见激光进行荧光成像的共聚焦显微镜，将CARS激光器与正向和落射CARS非去扫描探测器（NDD）安装在一起（图2）。
3. 将切片放入带有盖玻片（用于倒置显微镜）的培养皿中，PBS以避免组织变干，玻璃砝码以使组织靠近盖玻片。
4. 使用60X，1.2 NA红外校正水镜拍摄z堆栈或单个图像，该物镜用于在落射方向上收集CARS信号，并在正向上通过0.55 NA聚光镜对梯形体（MNTB）的内侧核等大脑区域进行成像。
   1. 使用 CARS 激光 GUI 在大约 600 mW 泵浦/探头和 300 mW 斯托克斯下拍摄 CARS 图像。这些激光功率值由系统在内部测量。两个激光器在样品位置的功率都小于25 mW，对组织样品是安全的。
   2. 在空间和时间上重叠泵和斯托克斯梁。将OPO调谐到797.2 nm。这产生了 650 nm 的 CARS 波长。由于更高的能级，由此产生的基态返回是反斯托克斯（蓝移）到激励的。
   3. 使用带通滤光片（640-680 nm）在落射或前向非去扫描检测器中捕获CARS信号，然后顺序检测免疫荧光标记物（在本例中为荧光标记的Nissl）。
      注意:NISSL神经元体细胞标记物未被CARS 640-680 nm带通滤光片捕获，允许在下面显示的图像中结合荧光和CARS成像。
   4. CARS和荧光不共享PMT。 使用这些设置获得最佳脂质信号以选择性地对大脑区域的髓鞘形成成像。
      注意:保护用户免受激光束的伤害
5. 将图像另存为.oib文件，可以将其导入图像分析程序以进行进一步量化（图3）。

图 2:CARS 仪器图，显示 CARS 激光器（红色箭头）和非去扫描 （NDD） 外延和前向检测整合到激光扫描共聚焦上。在正向NDD中，我们在515nm（橙色箭头）处获得C-H键（深红色箭头）和SHG（二次谐波产生）的CARS。在epi NDD中，我们获得了C-H键（深红色箭头）和2PE（双光子发射）自发荧光（浅蓝色箭头）的CARS。可以依次采集荧光共聚焦图像（绿色箭头表示可见激光，蓝色箭头表示共聚焦检测）。请点击此处查看此图的大图。

图 3:CARS 可以照亮脑组织（脑干）中的髓磷脂（洋红色），同时还可以成像 Nissl （青色）或荧光标记物。两个面板显示了蒙古沙鼠（单图像M. unguiculatus，图3A，C，E）和小鼠（z-stack最大投影M. musculus，图2B，D，F）大脑的代表性结果，表明该技术可以跨物种使用。图3A，B显示青色的尼斯尔，C，D显示洋红色的CARS信号，E，F分别将尼斯尔和CARS信号与沙鼠或鼠标的每个面板组合在一起。两组图像都显示了脑干中梯形体（MNTB）的内侧核的一部分。MNTB中的神经元接收来自重度髓鞘轴突的输入，这些轴突终止于Held的花萼，这是一种巨大的突触²⁷。比例尺为 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。

与其他技术相比，CARS显微镜的最大优势之一是与荧光成像的兼容性²³。 图1 显示了CARS光谱与用免疫荧光标记标记的Nissl相比，光谱几乎没有重叠。 图2 显示了结合共聚焦显微镜的CARS激光设置。 图3 显示了两个代表性图像，一个是单个堆栈，另一个是来自沙鼠和小鼠的z-stack最大投影，可以使用显示细胞体（青色）和髓鞘信号（品红色）的CARS成像获得。

越来越多的文献强调髓磷脂在大脑功能中的作用¹³，¹⁶，^21，28。此外，我们知道髓鞘厚度和髓鞘形成模式可以在多种神经系统疾病中发生变化，例如多发性硬化症（²⁹ 年回顾）、衰老（30 年回顾）、自闭症^20、31 等。因此，越来越多的研究人员需要在几种医疗条件下以及在越来越多的实验情况下评估脑组织和动物模型的髓鞘形成也就不足为奇了。对脑组织中髓鞘形成进行成像的传统方法包括抗体标记，然后是光学显微镜和电子显微镜（EM）。这两种技术都很耗时，并且需要多步骤的组织制备方案，这与可能的错误和组织成分的变化有关。我们展示了一种替代方法，由于能够更快地成像髓磷脂，并且可以与其他荧光显微镜结合使用，因此可以更快地产生类似的结果。重要的是，该技术可用于对脑组织中的脂质进行成像，而无需额外的标记或标签。该技术不仅允许沿着完整的轴突对髓磷脂进行成像，而且还允许对髓磷脂分解产物（例如斑块或液滴³²）进行成像，这些产物已被证明发生在例如多发性硬化^症33中。

CARS激光调谐的频率适合使图像严重偏向于脂质，从而产生整体高质量的髓鞘形成图像，因为髓磷脂是迄今为止大脑中最常见的富含脂质的物质。该技术的原理是，可以将可以调谐到各种频率的CARS激光器调谐到792.2 nm，这是适合激发CH₂ 键的频率。它们在脂质中含量丰富，脂质含有CH₂ 基团的长链，这些基团通过碳-碳键连接，末端有一个末端羧酸基团。以该频率激发脂质产生信号，然后可以使用标准共聚焦显微镜检测技术对其进行成像。所得图像的质量支持可由人类观察者或自动算法完成的定量分析³⁴。然而，这种方法不能专门标记髓磷脂，因为CH₂ 键不是髓磷脂独有的，因此CARS的特异性不如抗体。结果，图像显示一些标签，这与髓磷脂无关。重要的是，这种背景标签不会影响测量质量或定量分析的能力。

CARS成像的分辨率是衍射限制的，类似于两个光子显微镜（~250nm），因此低于EM。因此，旨在评估髓鞘形成厚度的非常小差异的研究人员，例如在某些医疗条件下，需要意识到这种限制。小样本中的其他EM对照可以确认分辨率足以满足其研究目的。

除了速度和易用性之外，CARS用于髓磷脂成像的一个主要优势是能够将无标记脂质成像与荧光共聚焦显微镜相结合。根据用于CARS的显微镜，可以对两个甚至三个额外的通道进行成像，以便髓磷脂成像可以与抗体标记，Nissl染色，表达荧光蛋白的转基因小鼠系或类似物相结合。使用较长波长荧光团的潜在限制主要是因为CARS信号是通过640-680 nm带通滤光片观察到的，该滤光片可以捕获绿色和/或红色荧光团的发射。然而，用于CARS激发的皮秒激光器的峰值脉冲能量比用于双光子激发的标准飞秒激光器小~10倍，转化为~100更少的荧光。此外，用于CARS激发的797.2 nm脉冲皮秒激光器在光谱上与可见荧光团的双光子截面吸收峰值相去甚远。因此，CARS皮秒激光器对于可见荧光团的双光子激发效率非常低，使得荧光信号对于进入CARS检测可以忽略不计。然而，这应该通过对没有任何荧光标记的阴性对照样品进行成像来测试，与带有荧光标记的样品相比。

总之，CARS成像是一种合适的脑组织中髓磷脂成像的技术。虽然分辨率与标准光学显微镜相当，因此低于EM，但速度和易用性使该技术成为现有方法的有吸引力的替代方案。

作者声明不存在利益冲突。

由 NIH R01 DC 17924、R01 DC 18401 （Klug） 和 NIH 1R15HD105231-01、T32DC012280 和 FRAXA （McCullagh） 提供支持。CARS成像是在科罗拉多大学安舒茨医学院神经技术中心的先进光学显微镜核心部分进行的，部分由NIH P30 NS048154和NIH P30 DK116073支持。