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该方案提出了一种从腔室载玻片中生长的 铜绿假单胞 菌生物膜中分离 RNA 以进行高通量测序的方法。
铜绿假单胞 菌是一种机会性细菌病原体,可引起囊性纤维化 (CF) 患者的气道感染。 铜绿假单 胞菌以其形成受胞外多糖基质保护的生物膜的能力而闻名。这种基质使微生物对外部因素(包括抗生素治疗)更具弹性。用于研究的生物膜生长最常见的方法之一是在微量滴定板或腔室载玻片中。这些系统的优点是它们允许测试多种生长条件,但它们的缺点是它们产生有限量的生物膜用于 RNA 提取。本文的目的是提供详细的分步方案,说明如何从少量质量和数量足够高的生物膜中提取总 RNA,以进行高通量测序。该协议允许研究这些生物膜系统内的基因表达。
大多数慢性细菌感染,例如囊性纤维化 (CF) 患者的肺部感染和假体相关感染,其特征是生物膜内生物体的生长。生物膜1 是包裹在主要由多糖2 组成的基质中的细菌群落。生物膜内的细菌可以缓慢生长、代谢休眠,并且在厌氧、缺氧条件下。由于抗生素渗透性降低、药物外排泵表达增加和细胞分裂减少等因素,生物膜对抗生素的耐药性更强3。由于这些和其他原因,它们具有极大的研究兴趣。
为了准确研究 CF 患者的慢性铜绿假单胞菌感染等持续感染,需要在体外准确反映生物膜形成的生长条件。一种常见的高通量方法是在腔室载玻片或微量滴定板中培养它们,并通过共聚焦显微镜监测生物膜的形成4。众所周知,从浮游或自由漂浮到生物膜细菌生活方式转变的关键调节因子是第二信使 cyclic-di-GMP5。cyclic-di-GMP 水平升高会增加促进生物膜生长的特定基因的表达。小的非编码调节 RNA 和群体感应在生物膜形成的调节中也起着重要作用5。通过对提取的细菌 RNA 进行测序来测量生物膜基因表达可能具有挑战性。例如,铜绿假单胞菌产生三种胞外多糖(Psl、Pel 和藻酸盐),它们在生物膜中大量产生 6,7。这些多糖会干扰 RNA 提取和纯化,导致制备物含低水平细菌 mRNA8。市售的 RNA 提取试剂盒能够从浮游细菌培养物中产生高质量的 RNA,但可能无法很好地与生物膜培养物配合使用 9,10,11。有一些商业 RNA 提取试剂盒声称适用于生物膜,其中一种我们与这种方法一起使用。
在本手稿中,我们描述了在腔室载玻片中培养铜绿假单胞菌生物膜和提取细菌 mRNA 以进行高通量测序的程序12,13。利用从 CF 患者痰液样本中收集的临床分离株,我们证明这些方法可用于具有不同生长特征的分离株。与以前的出版物相比,详细描述了该协议,以便在研究细菌生物膜基因表达方面取得更大的成功 11,14,15,16。
研究伦理委员会 (REB) 是收集和处理人类受试者痰液样本所必需的。这项研究得到了病童医院 (REB#1000019444) 的批准。研究伦理委员会 (REB) 需要收集和储存人类受试者的痰液样本。这些研究得到了病童医院 REB#1000058579 的批准。
1. 生物膜形成
2. 生物膜回收
注:每个载玻片包含八个独立的孔。单个样品由四个带有生物膜的孔组成,这些孔将被合并17.该提取方案适用于 1 个样品(4 个孔),其中生物膜一次从 2 个孔中回收。使用市售 RNA 提取试剂盒进行 RNA 提取,该试剂盒包括磁珠打纬步骤和基于柱的纯化,并进行了修饰。按照制造商的说明进行试剂制备。
3. 总 RNA 分离和质量评估
注意:RNA 提取是使用声称适用于生物膜的商业 RNA 提取试剂盒进行的。如果可能,各个组件都包含在 材料表中。如果可能,将解释每个纯化步骤背后的机制。
4. 核糖体 RNA 耗竭和高通量测序
5. 测序读长的质量评估
注意:使用免费提供的程序 FastQC26 检查测序读数的质量,该程序可通过免费的开源平台 Galaxy27 获得。
6. 测序读长的映射
注意:列出的是 RNA-seq 数据的接头修剪和读取映射的基本管道。使用 Trimmomatic28 从读数中修剪接头序列。修剪的读数映射到铜绿假单胞菌 PAO1 参考基因组 (NC_002516.2),使用 BWA30 和 Samtools31 从 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)29获得。为简单起见,一对读取称为 PA_1.fq 和 PA_2.fq;要修剪的适配器读取文件称为 adapter.fa;PAO1 参考序列称为 PAO1.fasta。所有工具都是开源的,并在 UNIX/LINUX 环境中运行。强烈建议您熟悉 UNIX/LINUX 的基础知识,以便执行这些命令。
该方法的一般概述如图 1 所示。我们之前使用 8 孔室载玻片来生长铜绿假单胞菌生物膜并将它们暴露于抗生素中,然后在不同时间点通过共聚焦显微镜检查它们12,13。该方法可用于直接从该系统中生长的生物膜中提取总 RNA,以研究处理后的基因表达变化。该方案已针对铜绿假单胞菌进行了优化,但可以很容易地适应其他细菌种类。
从少量生物膜中提取足够数量的优质 RNA 用于 rRNA 去除和高通量测序可能具有挑战性。使用该方案,从 17 种不同的铜绿假单胞菌生物膜分离物中成功提取总 RNA,一式三份,总共 51 个单独的样品。代表高产量和低产量的提取 RNA 的数量如表 1 所示。RNA 的浓度范围为 3.4 ng/μL(最低)至 49.6 ng/μL(最高),平均浓度为 14 ng/μL,中位数为 13.7 ng/μL。低于 10 ng/μL 的完整 RNA 浓度被认为是 rRNA 耗竭和下一代测序的低丰度样品,但与浓度更高的样品相比,来自生物膜的低丰度 RNA 样品会导致测序数据质量更差34, 35,36,37。RNA 的质量在表 1 中由 RIN 表示,在图 2 中由低浓度 (PA565-3) 和高浓度 (PA288-1) 样品的相应 RNA 电泳图表示;其余两个样品 (PA375-3 和 PA921-1) 代表了大多数样品。如图 2 所示,从这些数量的生物膜中提取的 RNA 总是包含一些降解的 RNA,这会影响它们的 RIN 值。因此,当未报告 RIN 时,16S 和 23S 原核 rRNA 峰的目视确认用于确定 RNA 质量。使用这些标准,选择所有 51 个 RNA 样品进行 rRNA 去除和测序,并预测质量最差的样品 PA565-3 可能会失败。在提交测序的 RNA 样本中,生成了 49 个样本的成功文库并进行了测序,正如预测的那样,PA565-3 失败。
表 2 列出了为具有良好 RIN 的高浓度样品 (PA288-1) 和没有 RIN 的低浓度样品 (PA375-3) 生成的测序读数数量。基本统计信息包括读取总数、读取长度和 GC 内容。两个样品的汇总统计数据显示大量生成的读数,并表明没有读数被标记为质量差,表明测序数据良好。每个样本的平均读取数约为 4800 万次,这被认为是一个不错的产量。用于评估原始测序数据质量的标准工具是 FastQC26。该程序用于对原始测序文件进行质量控制检查,以确定质量是否足以进行进一步分析,或者测序仪本身或输入 RNA 文库生成的数据是否存在问题或偏差。图 3 显示了 PA288-1 和 PA375-3 测序数据的质量控制指标,分别代表高质量 RNA 样品和典型的低质量 RNA 样品。FastQC 中信息量更大的图之一是每个碱基序列质量图。良好的测序数据将显示所有 reads 中每个位置的中位质量评分 (>30),并且平均质量评分在 reads 的长度内下降。质量分数 30 表示错误率为 1/1000,对应于 99.9% 的基本调用准确率。图 3 中的绝大多数碱基在两个样品的整个读长长度上的平均质量评分≥ 35,这表明测序数据的质量非常好。这提供了强有力的证据,证明此处介绍的 RNA 提取方案是成功的。
为了证明我们的方法可以恢复铜绿假单胞菌转录本,将 PA288-1 和 PA375-3 的高质量测序读数映射到铜绿假单胞菌 PAO1 参考基因组 (NCBI NC_002516.2)。仅针对测序接头修剪读数,而不针对质量进行修剪,在定位32 之前保留所有碱基。映射统计数据如表 3 所示。映射读数的百分比是测序准确性的重要指标。简而言之,与参考序列对齐的 reads 越多越好。对于 PA288-1 和 PA375-3,分别 84% 和 91% 的读数映射到参考基因组。标测标准 RNA-seq 读数的预期范围在 70 - 90% 之间,因此这些值非常好,尤其是在未去除质量差的碱基时38。平均读深是参考序列中每个碱基位置对齐的平均读长数的良好指标。每个 base 位置的深度越高,每个位置的 base call 就越准确。计算方法是将参考基因组中每个位置的映射读取深度之和除以参考基因组中的碱基总数。PA288-1 和 PA375-3 的平均读取深度为 400 或更高,这有利于下游基因表达分析39,40。覆盖面的广度表示测序41 覆盖的参考基因组长度的百分比。来自 PA288-1 和 PA375-3 的比对读数覆盖了铜绿假单胞菌 PAO1 参考基因组的 96%。这表明大部分铜绿假单胞菌基因组都在测序数据中表示,而不仅仅是短片段。PA288-1 和 PA375-3 的定位统计表明,这种方法可以恢复与铜绿假单胞菌基因组的良好覆盖和分布一致的转录本,进一步支持成功的提取方案。
图 1.协议概述。一个。 实验工作流程示意图。浮游生物培养物在37°C下生长过夜,第二天用新鲜培养基1:100稀释,再生长3小时。将培养物调整至 OD600 为 0.1,并将 300 μL 接种到 8 室载玻片的 4 个孔中以产生生物膜。24 小时后,洗涤生物膜以去除浮游细胞;加入 RNA 保护试剂,从孔中刮下细胞。提取总 RNA,去除核糖体 RNA 并测序。 湾。 生物膜在 8 腔载玻片中生长和去除的详细工作流程。每张玻片沿左图所示的方向生长两个菌株。显示了载玻片四个孔中每个样品的排列。对于每个独立样品,首先处理孔 1 和 3,最后在每个孔中用 RNA 保护试剂刮取 300 μL 细胞。中间的幻灯片描绘了一个示例。接下来,洗涤 2 和 4 孔并去除液体。将来自孔 1 和 3 的重悬细胞分别转移到孔 2 和 4 中,如右幻灯片所示。刮擦后,将孔 2 和 4 中重悬的细胞合并成单个微量离心管。这个数字是用 BioRender.com 创建的。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2.从高质量到低质量提取的 RNA 样品的 RNA 电泳图示例。 16S 和 23S 核糖体峰标记在其峰的底部。降解的 RNA 由小峰表示,由箭头和高于零的凹凸基线表示。可接受质量的 RNA 样品如图 A、B 和 D 所示。图 C 显示质量较差的 RNA 样品,其中核糖体峰缺失,浓度丰度非常低,由 Y 轴上的刻度表示。FU,荧光单位;nt,核苷酸。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 3.PA288-1 和 PA375-3 序列数据的 FastQC 每个碱基序列质量图。一个。 高质量样品 PA288-1 的质量图。 湾。 典型样品 PA375-3 的质量图。这些图显示了文件中所有 reads 的每个碱基位置的聚合质量分数。蓝线表示每个基本位置的平均质量得分。黄色框内的红线表示每个位置的质量得分中位数,黄色框显示第 25个 到第 75个 百分位数的四分位数范围。 请单击此处查看此图的较大版本。
隔离 | 量子比特 | 凛 | 测 序 |
PA288-1 | 26 纳克/微升 | 7.5 | 是的 |
PA375-3 | 4.07 纳克/微升 | 那 | 是的 |
PA565-3 | 3.4 纳克/微升 | 那 | 不 |
PA921-1 | 9.11 纳克/微升 | 6.6 | 是的 |
表 1. 从代表性样品中提取的 RNA 的质量指标。
PA288-1 | PA375-3 | |
总读取数 | 8,59,57,720 | 3,18,49,575 |
读取标记为质量差 | 0 | 0 |
读取长度 | 100 | 100 |
%气相色谱 | 61 | 60 |
表 2. PA288-1 和 PA375-3 FastQC 汇总统计
隔离 | 映射到参考的 % reads | 平均读取深度 | 覆盖范围广 |
PA288-1 | 83.93% | 404 | 96.68% |
PA375-3 | 91.2% | 578 | 96.97% |
表 3. PA288-1 和 PA375-3 映射统计
从 17 种不同的细菌生物膜样品中成功提取总 RNA,一式三份,总共得到 51 个样品。将 49 个 RNA 文库合并并成功测序。总体而言,这验证了我们的质量标准,成功率为 96%,尽管超过一半的样品被认为丰度较低且质量欠佳 34,35,36,37。
意义
该 RNA 提取方案的独特之处在于其详细解释从腔室载玻片中生长的有限量生物膜中提取 RNA。生物膜在 8 孔室载玻片中的生长是一种有用的系统,可通过共聚焦显微镜研究外源性添加因子对生物膜的影响或微生物相互作用对生物膜形成的影响 12,13,42。为了检查该系统中参与生物膜形成的基因的表达,我们提出了一种详细的方法来提取足够质量和数量的完整 RNA 用于 RNA 测序。其他研究报道了从有限量的生物膜中成功提取 RNA,但大多数生物膜在更大的表面积上生长,并且通常持续 48 小时而不是 24 小时。它们也缺乏足够的细节来确保成功 4,15,16,43,44,46。
此外,该协议避免使用危险化学品(如苯酚)或专用设备(如超声仪)。经典的硫氰酸胍苯酚-氯仿提取方案47 不用于该系统,因为尽管与商业试剂盒相比,它产生的 RNA 大约多 2 倍,但在我们手中,它始终会导致 RNA 完全降解,如在自动电泳系统上评估的那样。此外,使用市售提取试剂盒可产生用户友好的方案,可产生一致的结果15,16,45。
关键步骤
该方案中有许多关键步骤可以增加提取可成功测序的 RNA 的可能性。首先,重要的是用相同的菌株接种腔室载玻片的至少 4 个孔,以获得足够数量的 RNA 进行测序。将 4 个孔中的生物膜合并进行单次提取,这具有减少下游基因表达分析变异性的额外优势17。从少于 4 个孔中提取 RNA 通常会导致产量太低,无法在高灵敏度荧光系统上检测。从8个孔或整个玻片中提取RNA将产生比使用4个孔时获得的更大量质量相似的RNA,但必须考虑提取的额外时间、精力和成本是否值得增加的产量。将 300 μL OD600 = 0.1 稀释的培养物移液到每个孔中接种,而不是标准的 200 μL,可以提高从每个孔中刮下的生物膜材料的回收率。在使用 RNA 保护试剂之前,用不含核酸酶的水轻轻洗涤生物膜两次,这对于去除尽可能多的死亡和/或浮游细胞至关重要。由于 RNA 处理每个孔需要时间,因此使用 RNA 保护试剂对于防止 RNA 降解非常重要。此外,与其使用移液器吸头刮擦,我们更喜欢使用金属称量刮刀,其扁平端比移液器吸头接触的表面积更大,并且足够小,可以放入孔中。使用 1000 μL 移液器吸头进行刮擦可以,但与金属刮刀相比,刮擦整个生物膜的效率较低且需要更长的时间。根据我们的经验,使用金属刮刀可以节省时间和精力。刮擦时,确保将腔室载玻片放在玻璃板顶部,以防止孔底部开裂。超声处理效果不佳,因为样品量太少和产生的热量过多,它始终会导致 RNA 高度降解。收集生物膜材料后,将样品输入到商业试剂盒中,以实现更可靠和可重现的 RNA 提取。最后,由于这种方法存在潜在的变异来源,除了样本混合之外,还包括实验复制非常重要17,48。该协议描述了每个样品的一式三份生物复制。
局限性
有多种技术可用于生长用于研究的生物膜,其中最常见的是在微量滴定板中形成4。这些板具有不同的尺寸和孔数。腔室滑轨属于这一类。提取完整、纯 RNA 的能力对所有生物膜系统都很重要,但该系统受到 RNA 产量低的限制。浓度足够低,因此应使用高灵敏度 RNA 试剂盒通过 Qubit 和生物分析仪仪器评估其质量和数量。也可以使用 nanodrop,但与 Qubit 相比,它的灵敏度更有限,并且无法区分污染的 DNA和 RNA 49。如果可能,应使用 nanodrop 来获得 A260/A280 和 A260/A230 的纯度比例。这些比率很有用,特别是因为该生物膜系统的 RNA 质量不如大量起始材料的 RNA 质量。这很可能是由于 RNA 产量低以及生物膜和/或 RNase 中存在可能降解 RNA 的死细胞。这种方法的另一个局限性是它不能分离异质生物膜内的不同细胞类型,而只能提取整个细胞群中的细胞,这可能会掩盖任何代表性不足的亚群中的基因表达。
潜在应用
此处介绍的方案已针对来自腔室载玻片中生长的临床分离株的 铜绿假单 胞菌生物膜进行了优化。该方法可用于研究在共聚焦显微镜观察到的不同生长条件下生物膜形成过程中基因表达的变化。该方案还可以针对其他产生生物膜的细菌物种进行优化。使用这种方法,由于可以使用双重提取试剂盒,因此也可以提取基因组 DNA。通过这种方式,可以更准确地研究导致患者感染的临床分离株中的细菌生物膜基因表达,从而得出可能指导未来治疗策略的结果。
作者没有需要声明的披露。
作者贡献:P.W.、Y.Y. 和 V.W 参与了这项研究的概念化。K.G.、L.J.、A.M. 和 P.W. 优化了实验室方案。K.G. 的资金得到了 BioTalent Canada 的学生工作安置计划补贴的支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Automated electrophoresis of biomolecules |
Agilent RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | High sensitivity RNA electrophoresis chip to generate a RIN |
DNA/RNA Lysis Buffer | Zymo Research | D7001-1-50 | A guanidinium thiocyanate and N-Lauroylsarcosine-based lysis buffer sold as part of a nucleic acid purification kit |
DNA/RNA Prep Buffer | Zymo Research | D7010-2-10 | A guanidine HCl and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA |
DNA/RNA Shield | Zymo Research | R1100-50 | DNA and RNA preservation/protection reagent |
DNA/RNA Wash Buffer | Zymo Research | D7010-3-6 | A salt and ethanol buffer used for purification of DNA and RNA |
DNBSEQ G-400RS | MGI | G-400RS | High throughput sequencer |
MGIEasy RNA Directional Library Prep Set | MGI | 1000006386 | Generate libraries for MGI high-throughput sequencing platforms from total RNA. |
Mini-Beadbeater-96 | BioSpec | 1001 | A high energy, high throughput cell disrupter |
NEBNext rRNA Depletion Kit (bacteria) | New England Biolabs | E7850X | Efficient and specific depletion of bacterial rRNA (5S, 16S, 23S) |
Nunc Lab-Tek II chamber slide system | Thermo Fisher Scientific | 154534 | 8-well chamber slide with removable wells |
Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33238 | Fluorometer for DNA, RNA and proteins |
Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32852 | High sensitivity fluorometric assay to measure RNA concentration |
Spin-Away Filters | Zymo Research | C1006-50-F | Silica-based spin column primarily used to bind or remove genomic DNA |
Sterile inoculation loops, 1 uL | Sarstedt | 86.1567.050 | Sterile, disposable inoculation loops for manipulation of microorganisms |
ZR BashingBead Lysis tubes | Zymo Research | S6003-50 | 2 mL tubes containing 0.1 and 0.5 mm bead lysis matrix for homogenizing biological samples |
Zymo Spin IIICG Columns | Zymo Research | C1006-50-G | Silica-based spin column for purification of DNA and RNA |
Zymo-Spin III-HRC Filters | Zymo Research | C1058-50 | Remove inhibitors such as polyphenolic compounds, humic/fulvic acids, tannins, melanin, etc. |
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2002 | DNA and RNA dual extraction kit |
Zymobiomics HRC Prep solution | Zymo Research | D4300-7-30 | To be used with Zymo-Spin III-HRC Filters to remove PCR inhibitors |
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