Method Article
在这里,我们描述了一种从人类多能干细胞(hPSCs)生成肾类器官的方案。该方案在两周内产生肾脏类器官。所得的类肾类器官可以在大型旋转瓶或多孔磁力搅拌板中培养,以进行平行的药物测试方法。
由hPSCs产生的肾类器官提供了无限的肾组织来源。人肾类器官是研究肾脏疾病和损伤,开发基于细胞的疗法以及测试新疗法的宝贵工具。对于此类应用,需要大量均匀的类器官和高度可重复的测定。我们以之前发布的类肾类器官方案为基础,以改善类器官的整体健康状况。这种简单,强大的3D方案涉及在含有脂质,胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 - 乙醇胺补充剂和聚乙烯醇的最小组分培养基中形成均匀的胚体,使用GSK3抑制剂(CHIR99021)3天,然后在含有敲除血清置换(KOSR)的培养基中培养。此外,搅拌测定可以减少胚体的结块并保持均匀的大小,这对于减少类器官之间的变异性非常重要。总体而言,该协议为产生大量肾类器官提供了一种快速,高效且具有成本效益的方法。
近年来,已经开发了许多将人类多能干细胞分化为肾类器官的方案1,2,3,4,5。类肾类化合物为研究新的再生医学方法,模拟肾脏相关疾病,进行毒性研究和治疗药物开发提供了重要工具。尽管它们具有广泛的适用性,但肾脏类器官具有局限性,例如缺乏成熟,体外长期培养能力有限,以及缺乏在人肾中发现的几种细胞类型6,7,8。最近的工作重点是通过修改现有方案9,10,11,12来提高类器官成熟水平,延长培养期并扩大肾细胞群的复杂性。在我们已建立的方案5,13的当前迭代中,我们将方案第一阶段的培养基组分修改为补充胰岛素 - 转铁蛋白 - 硒 - 乙醇胺(ITSE),脂质,聚乙烯醇(E5-ILP)和CHIR99021的无血清基础培养基(图1)。这些变化提供了一种完全定义的、无血清的低蛋白培养基,其成分比我们以前的培养基组成5,13少,并且没有额外的生长因子。因此,与我们之前发布的版本相比,第一阶段培养基的制备劳动强度较低,并且可以减少批次之间的差异5。先前的研究表明,胰岛素和转铁蛋白在无血清培养14,15中都很重要,然而,高水平的胰岛素可以抑制中胚层分化16。我们保持了原始方案中规定的低胰岛素水平,并在测定的第二阶段进一步降低了KOSR(含胰岛素)的水平。根据肾类器官形成的其他方案,较低水平的KOSR有利于维持肾组织增殖和分化之间的平衡17。此外,我们还降低了II期培养基13中的葡萄糖浓度。
我们的方法描述了一种用于肾类器官悬浮测定的设置,从原始出版物5,13中所述的初始〜60%融合hPSC 100mm培养板中产生多达约1,000个类器官。该协议可以很容易地扩展到从多个100 mm或150 mm板开始,以进一步增加类器官的数量。
所有使用hPSC的实验均按照机构指南进行,并在II类生物安全罩中进行,并配有适当的个人防护装备。除非另有说明,否则所有试剂均为细胞培养级。将所有培养物在37°C,5%CO2 空气气氛中孵育。在测定的所有阶段,可以收集胚体或肾类器官,并固定或准备用于分析。用于生成此数据的hPSC线已经过完全表征并已发布18。
1. 制备培养板
注意:在分裂hPSCs之前约1小时,用干细胞合格的基底膜基质提取物(BME)涂覆2 x 100mm组织培养板。可以预先涂覆板,用石蜡膜密封它们,并根据制造商的说明储存在4°C。
2. 传代 hPSC
注意:对于常规hPSC培养,以70-80%汇合度传代细胞系。
3. 第0天 - 设置肾脏类器官测定
4. 第2天 - 半换介质喂养
注意:在48小时内,菌落簇将形成胚体。
5. 第3天 - 将胚胎体移植到II期培养基
6. 转移到旋转瓶和喂食
注意:从第3天开始,旋转瓶可用于需要大量类器官的实验。类器官的常规转移发生在我们的实验室6-8天之间。如果没有设备,请参阅 讨论 部分,了解替代方案。
7. 设置6孔磁力搅拌板(6MSP)
注意:如果需要测试多种条件,可以使用6MSP格式代替微调瓶。使用6MSP进行复合或肾毒素治疗。这节省了第二阶段使用的培养基量,同时通过扩散保持养分的可用性。
在我们方案的最新版本中,肾脏类器官分化是在定义的低蛋白培养基中启动的。该测定完全在悬浮液中进行,并依赖于hPSCs分化和组织启动微管生成的先天能力。来自100mm〜60%融合hPSC培养板的单次测定通常产生500-1,000个肾脏类器官,如我们之前的出版物5所示。由于产生如此大量的类器官,该方案非常适合化合物测试。我们通常使用6孔格式进行化合物测试,但是,该协议可以在第二阶段(第3天以后)轻松扩展到其他多孔格式,以实现更高通量的化合物测试。石蜡切片的免疫荧光显示类器官中存在肾单位节段,即表达肝细胞核因子-1β(HNF1B)和莲花四蕈洛布斯凝集素(LTL)的肾小管(图3A - HNF1B,LTL),以及表达V-maf肌肉腱神经性纤维肉瘤癌原同源物B(MAFB)和肾素(NPHS1)的足细胞簇(图3A - MAFB, 图3B - NPHS1)。此外,该方案中的修饰可以支持内皮细胞的扩增,如图 3B 所示,显示血小板和内皮细胞粘附分子1(PECAM1)在培养的第26天染色。
试剂 | 股票结算 | 工作顾问 | 每 250 mL 用量 |
TeSR-E5 | 不适用 | 不适用 | 238.48 毫升 |
断续器 | 10% | 0.25% | 6.25 毫升 |
笔链 | 100 倍 | 1 倍 | 2.5 毫升 |
ITSE | 100 倍 | 0.1 倍 | 250微升 |
化学定义的脂质 | 100 倍 | 1 倍 | 2.5 毫升 |
纤溶酶 | 25毫克/毫升 | 2.5 微克/毫升 | 25 微升 |
表1:E5-ILP介质组成。 将除化学定义的脂质和抗支原体试剂外的所有试剂直接移液到0.22μm Stericup过滤单元的上腔室中。过滤后,加入脂质和抗支原体试剂。在4°C下储存长达两周。
试剂 | 股票结算 | 工作顾问 | 每 500 mL 用量 |
DMEM(低血糖) | 不适用 | 不适用 | 417.5 毫升 |
科斯雷 | 不适用 | 10% | 50 毫升 |
断续器 | 10% | 0.25% | 12.5 毫升 |
笔链 | 100 倍 | 1 倍 | 5 毫升 |
MEM-NEAA | 100 倍 | 1 倍 | 5 毫升 |
谷氨酸 | 100 倍 | 1 倍 | 5 毫升 |
赫皮斯 | 100 倍 | 1 倍 | 5 毫升 |
纤溶酶 | 25毫克/毫升 | 2.5 微克/毫升 | 50 微升 |
表2:第二阶段培养基组成。 将除抗支原体试剂以外的所有试剂直接移液到0.22μm Stericup过滤单元的上腔室中。过滤后,加入抗支原体试剂。在4°C下储存长达两周。
图 1:协议概述。 该协议的示意图概述了两个阶段的时间以及微调瓶和6MSP的使用。 请点击此处查看此图的大图。
图2:方案的各个阶段。 (A)用GCDR处理的hPSC集落的明场图像。(B)最佳汇合度和集落大小以开始肾脏类器官测定。(C)用分散酶处理hPSCs 6分钟。红色箭头指向蜷缩起来的殖民地的边缘。(D)在轨道振荡器上进行类器官测定。(E)使用200μm细胞过滤器筛出大的胚体。(F)在转移到II期培养基之前的第3天(D3)的胚体。(G)可以在第8天(D8)和(H)第14天(D14)的类器官收获和治疗的最佳时间点观察到小管形成的出现。(I)用于在多位置磁板上进行散装培养的微调瓶。(J)在多孔磁力搅拌板上测定。比例尺,200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
(A)第14天肾类器官的免疫荧光标记石蜡切片的代表性共聚焦图像,显示肾小管上皮(HNF1B和LTL)和足细胞簇(MAFB)染色阳性。(B)第26天肾脏类器官切片,标记为足细胞簇(NPHS1)和内皮细胞(PECAM1)。比例尺,100 μm (A);200微米(B)。请点击此处查看此图的大图。
先前的研究表明,初始方案步骤对于中间中胚层分化5,19,20 至关重要,因此,在此阶段实施严格的培养基组成至关重要。从方案的第一阶段去除未定义的组分,例如血清,白蛋白,无蛋白杂交瘤培养基II,可能有助于提高测定21之间的一致分化效率。
肾细胞的代谢状态对其功能至关重要,葡萄糖的变化可导致代谢状态的改变22。以前的研究已经描述,高水平的葡萄糖(高达25mM)可以诱导内皮细胞功能障碍并改变肾细胞的生长和氧化能力22,23,24。高水平的葡萄糖也被描述改变线粒体功能24,这在研究肾脏疾病和肾毒性或使用肾脏类器官进行药物发现时可能是不利的。因此,我们降低了方案中的葡萄糖水平,以促进类器官肾细胞的 体内更像的代谢状态。因此,对肾脏类器官测定的修改提供了一致,强大的方案,同时保持其简单性。
肾脏类器官不成熟,延长培养(>20天)可能导致前述的促纤维化和非肾细胞类型的发生,如前面所述5,25,使类器官在健康人体肾脏组织中的代表性降低。根据我们的经验,肾脏类器官最健康的最佳治疗窗口是在第14-18天之间。如上所述使用旋转烧瓶和多孔磁力搅拌器将增强均匀的养分可用性,而不是静态培养物21,26。如果没有用于悬浮培养的设备,例如振动筛或磁力搅拌器,则该方案仍然可以完全在静态培养的超低附着板中进行。然而,胚胎样体/类器官合并的发生率可能会增加,导致大量标本因缺氧而出现坏死核心。任何大于500μm的类器官都可以通过使用所描述的细胞过滤器去除。为了减少在这些情况下类器官合并的机会,我们建议每6孔不要接种超过100个类器官。此外,在进料后,类器官应通过与板进行八字形运动来均匀分布。
可观察到类器官形成的低效率(<50%)。这通常发生在 hPSC 培养物在标准传代期间达到高汇合度 (>80%) 时。至关重要的是,hPSC维持是一致的,并且细胞不会过度融合。高汇合度和不一致的传代技术也可能导致自发分化和细胞死亡增加。如果hPSC培养物中存在分化,我们建议在开始测定之前,如果分化面积不超过细胞群的5%,则用细移液器吸头抽吸来去除分化区域。如果分化区域超过5%,我们建议在开始新测定之前至少解冻并分裂一次新批hPSC。
我们观察到,一些hPSC细胞系更容易形成非肾细胞类型,如心脏或神经组织。如果发生这种情况,使用细胞过滤器进行尺寸过滤可能有助于去除那些含有非肾脏生长的类器官。或者,改变hPSC培养基和/或基质可能有助于减少非肾脏的生长。根据我们的经验,含有最少组分的替代hPSC培养基和BME(如玻连蛋白)提供了更严格的多能生态位,从而有助于产生更均匀的hPSC培养物。
作者没有什么可披露的。
这项研究由美国国立卫生研究院R01 DK069403,UC2 DK126122和P30-DK079307以及ASN肾脏研究基金会Ben J. Lipps研究奖学金计划资助。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
Fisherbrand Cell Lifters - Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
KnockOut Serum Replacement - Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
Sterile Disposable Serological Pipets - 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
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