手术消融分析在研究涡虫再生眼

该协议示出如何一致切除涡眼（光杯），而不干扰周围的组织。使用胰岛素针和注射器，任一个或两个的眼睛可以被烧蚀以促进调查调节眼再生，再生视觉的演变，和光诱导行为的神经基础的机制。

在成体干细胞和再生机制的研究中，涡虫扁虫是在体内模型系统中的缝钉。这是因为在很大程度上他们丰富的多能干细胞群和伤害，这将是灾难性的大多数动物后再生的所有细胞和组织类型的能力。近日，涡已经得到普及，作为眼睛再生的典范。其再生整个眼睛能力（包括两种组织类型:色素细胞和光感受器）允许用于调节视觉系统再生机制的清扫。眼消融具有用于检查眼睛特定的途径和机制，其中最重要的是，再生在很大程度上仅仅局限于眼组织上的其他技术（如断头或打孔）几个优点。这个视频本文的目的是演示如何可靠地除去涡视杯，而不会干扰脑或周围组织。蠕虫和已建立的细胞集落的维护的处理也被描述。这种技术使用一个31克，5 / 16-英寸胰岛素针手术舀出固定化在冷板涡虫的视杯。此方法既包括单，双眼烧蚀，与眼睛在1-2周内再生，从而允许一个宽范围的应用。特别地，该消融技术可以很容易地与为了更好地理解的再生机制及其演进，眼干细胞和它们的维护，和phototaxic行为反应和它们的神经学基础的药理学和遗传学（RNA干扰）屏结合。

涡虫是研究成体干细胞介导再生一个功能强大的模式生物。这些非寄生的扁虫淡水拥有再生的任何及所有丢失的组织，包括他们的中枢神经系统和大脑¹的能力。研究早在1700年^2，技术在涡领域在过去10 - 15年的进展（如基因组测序， 原位杂交，免疫组织化学，RNA干扰（RNAi），和转录）已经更新了这个历史的模式生物。具体来说，涡虫最近获得了普及作为眼科研究³一个新兴的模式。

涡具有只有两种组织类型，在感光体的神经元和色素细胞原型眼睛;这使得它的眼干细胞群的鉴定和证明，许多相同的基因调节脊椎动物的眼睛去velopment是保守的涡虫^4,5。光学杯位于背侧和包括感光体神经元的白色，无颜料的树突和所述半月形黑色素细胞，眼睛经由视交叉支配脑。除了作为用于阐明再生过程⁶所述的模型，涡虫眼是非常适合于学习的视觉机构⁷的演变，行为反应的光（涡显示负趋光^）8，和行为⁹的神经学基础。

在涡眼再生大部分已经研究主要有两种情况:作为头再生的一部分以下断头^{4，图 10}和以下只是眼部组织¹¹的切除^，12 。眼睛上再生涡虫的大多数研究都使用了断头方法，因为它是简单明了。最常见的涡眼切除方法迄今通过打孔器是用细玻璃毛细管^13，14，但也有一些研究也已经进行截肢仅次于眼（局部断头^）15。然而，所有的这些方法涉及的不仅仅是眼睛许多其他组织（如脑，肠，肾管）的损失，潜在的复杂结果的解释。这里介绍的眼睛消融协议限制切除到更特定于眼内的眼组织（特别排除脑），导致数据。另外，称取7-14天，开始馈送断头蠕虫不同，眼烧蚀蠕虫将消融¹²的24小时内进料，允许RNAi实验（其中的RNAi经由食物递送）被performeð兼任。

虽然眼睛消融术在技术上是很难比斩首成功执行，涉及眼切除目前的研究尚未包括在他们的程序的详细说明。这个视频文章的目的是为了使研究人员能够一致地删除涡视杯，而不会干扰底层的脑组织和撤除其他一些组织成为可能。此方法可用于单和双眼消融，并适用于广泛的调查。像大多数再生试验中，眼消融非常适合结合两者的药理学和遗传学（RNAi）的屏幕，以及行为研究。这里，我们介绍的方法蠕虫的处理，保持了涡虫的殖民地，和眼睛消融技术本身。

1.动物文化和处理

注:此协议使用Schmidtea地中海 ，二倍体涡物种，基因组测序^16，17是常用的再生研究。然而，该测定法是与其他物种，诸如Girardia虎纹和Girardia dorotocephala（它们是可商购）同样成功。

1. 保持"蠕虫水"为0.5g / L海盐超纯（或过滤的去离子）水制成蠕虫。使用无菌聚丙烯或玻璃容器来保存蠕虫水。见补充文件1对蠕虫水制备的细节。
   注意:不要使用肥皂清洗容器（或其它电源）如肥皂是有毒的蠕虫;代替用70％乙醇擦拭，并允许风干。
   1. 戴上手套，用涡虫的工作，以保护他们免受污染的同时。
      注:蠕虫是环境毒素和化学品，包括肥皂，漂白剂，洗发水，护发素，和洗手液非常敏感。
2. 房子菌落在聚丙烯食品容器，与盖子部分打开在约20℃（室温）下的空气交换。在任一培养皿商店实验蠕虫（每100mm培养皿20个蠕虫）或未经处理的组织培养板（每孔1个蠕虫，对于12孔板）。为了减轻压力，保持双方的殖民地和实验在黑暗中。
   注:殖民地应该有每升水虫不超过500-1000蠕虫。对于实验，让完全到位盖子，由于气流是专为这些菜。
3. 通过从移液管滴加果泥，放置食物的液滴在整个容器订阅与泥有机牛肉或鸡肉肝脏非实验蠕虫每周一次。允许蠕虫2个小时以消耗食物在清理容器在天黑前（参见步骤1.4）。在使用之前，储存在-20℃下短期（周）原浆或-80℃长期（数月）;不重新冻结泥再利用（如细菌可以开花损害蠕虫）。
   注意事项:肝应该不含激素或抗生素，最好不预先冻结。冷冻前（前馈或）离心机原浆以除去空气并防止食物浮动。饮食宜沉到容器的底部。原浆的1毫升足以用于500-1,000蠕虫。
4. 兑水每周一次用新鲜水虫两个殖民地和实验。菌落的容器也应与未漂白纸巾擦拭（以除去粘液残基陷阱废物）每周一次（供给和再次2天后后2小时）饥饿蠕虫，或每周两次用于馈送蠕虫。为了留住生物膜，不抹容器的80％以上。
5. 移动容器（或手术SETU之间蠕虫p）的使用移液管。到附着于容器表面自由蠕虫，喷出的水过/蜗杆以从表面释放它的后面。然后吸取蜗杆到移液管，而试图保持在移液管的底部英寸（较薄）部分内的蜗杆。
   1. 后送吸管吮吸起来之前，有少量虫水。
   2. 尝试移动水绕的蠕虫病毒，而不是病毒本身，以帮助防止用吸管触及他们撕裂软体蠕虫。
   3. 保持覆盖，除非转让蠕虫或更换水实验菜肴。

2.准备工作

1. 停止至少一周之前的实验喂养蚯蚓。
   1. 选择已没喂食了≥1周并且至少5-7毫米长度蠕虫。转移蠕虫至培养皿2/3满蠕虫水的，并通过滑动盘下方的标尺确认虫长度。测量w ^奥姆斯同时充分延伸和移动。
      注:虽然小（5-7毫米）蠕虫执行后续免疫荧光原位杂交分析，更大的蠕虫（8-10毫米）时，更容易与工作更好地工作-尤其是当学习消融。
   2. 确保蠕虫是整体，无破损或最近再生。
      注意:作为相对于正常蠕虫蠕虫再生将在头部和/或尾部区轻得多（或没有）颜料。
   3. 如果蠕虫进行RNAi或药物治疗，在这一点上做到这一点。如果蠕虫被馈送作为处理（作为RNA干扰）的一部分，等待最后喂食后至少7天继续到步骤2.2之前。
2. 清洁用70％乙醇的工作空间和解剖显微镜基，并允许它完全干燥。选择蠕虫的盘放置到所述范围的左边。到的范围的权利，放置一对＃5钳子的，一个31克5 / 16-英寸胰岛素针用1毫升的注射器，和一个干净的移液管。
   1. 确保器械接触到工作台（其可以引入污染物）保持。使用硬质物品（如筷子休息），以保持镊子，针和吸管干净。可替换地，在新鲜棕色（未漂白的）纸巾的顶部位置的仪器。
      注:因为它们与右手这些个人和随后的指令写入。左手个人应该扭转左/右方向。
3. 旁边的工作空间，将无绒织物擦巾的盒子，新鲜水虫的来源，以及一些额外的移液管（从台式保护）。地方虫水的塑料洗瓶便于分配的。还放置一个标记的12孔板（或100毫米培养皿）的范围的权利，用于收集被消融的动物。
4. 如果使用定制的珀耳帖板来固定蠕虫，珀耳帖板定位到在叔凹陷他解剖显微镜的基部和直到珀耳帖板的工作表面是充分地冷却调整直流电源上的输出（通常为〜5 V）。可选地，通过填充100毫米培养皿使冷板½充分用水和冷冻至少24小时。丢弃该盖板，将解剖范围的基础上的100mm培养皿的底部，然后将60毫米的培养皿的盖颠倒直接在冰（图1A）的表面上。
   1. 水在100mm培养皿已经冻结后，冰的"火山"可以出现在板的中心。如果发生这种情况，用一个刀片刮冰平，以从表面除去任何不规则性。
      注:在手术的冰会融化，使得消融困难得多。预先准备几个冰盘，并更换冻结的用于尽快60毫米培养皿的盖开始浮动在测定过程中熔化的。
5. 准备手术的表面。切5厘米×10厘米的塑料片石蜡膜（4cm ²的如使用培养皿冷板）并将其放置在固定装置的中心。折叠无绒布纸巾擦拭成方形大致2 cm ²并且将其放置在膜的顶部。切下一块的白色滤纸1.5-2厘米^2，将其上的擦拭顶部。参见图1B-1E。
   1. 按住折叠处用戴手套的手指擦拭，并用虫水轻轻挫伤擦拭，以确保它保持折叠。使用移液管的一侧滚动抹平。
      注意:冷的温度有助于保持蠕虫移动。工作"干"也有助于固定。组织擦拭行为通过滤纸芯吸水，手术过程中保持蜗杆湿润而不使蠕虫完全风干（这是致命的）。

3.手术消融

1. 用移液管上放置È蠕虫背侧上到滤纸上。在关闭光源和引导鹅颈，使光线集中在蠕虫。调整解剖范围聚焦和放大倍率使眼睛清晰可见（整个蠕虫并不需要在图）。放大5倍是一个很好的起点。通过使得头部指向朝向研究员（朝向显微镜的前面）倾斜30-40度的石蜡膜旋转，向右定向蠕虫。
   1. 避免使用明亮的光线，以防止多余的蠕虫运动。涡虫显示负趋光性，并会尝试逃避耀眼的光芒。
   2. 如果蠕虫被定位朝上（含咽口可见）腹侧，使用产钳无光泽的一面轻轻地重新定位蠕虫背侧了（眼睛可见）。避免接近动物用钳子的尖端，以尽量减少重新定位动物时通过软组织撕裂的可能性。
   3. 调整显微镜焦点使眼睛显然聚焦。此外，还要确保两个眼睛和周围的乳头组织在视野中。
2. 保持新鲜针/注射器在右手就好像它是一个笔（拇指和食指之间）。做好防珀尔帖板（或培养皿冷板）的左拇指，并使用左拇指为支点在其上的注射器的底部将休息（图2A）。通过显微镜观察，并确保针的斜面是可见的。
   注:针是非常尖锐的。操作时他们一定要小心。戴乳胶或丁腈手套可以提供一些保护。
   1. 使用左手拇指，以帮助保持针/注射器在整个手术过程平稳，避免握手。
   2. 成大约40°用左手拇指和左手食指（与手术表面上的食指）的角度，以帮助保持手术的表面稳定。
3. 同朝上（如调羹）所述针的斜面，定位在垂直于眼（图2B）的针。使用针的尖端轻轻穿透组织覆盖在眼睛的视杯（白色，未着色区域）的薄层，由右至左舀。非常温和地去除位于视杯内的任何色素斑组织，小心不要刺破底部或破坏视杯边界。
   1. 如果蠕虫一直为> 1-2分钟的滤纸在该过程期间的任何时刻，添加蠕虫水一滴再水合蜗杆。
      注:脱水会增加病毒的易感性翻录受伤。
4. 重复步骤3.3，直到所有的黑色颜料的组织细胞（色素细胞）的，以及所有的视杯（感光细胞的树突）的白色组织的，被除去。用纸巾擦拭小心的擦拭取出切除组织粘在针的末端。如果双眼睛阿夫拉和灰是期望的，在这一点上烧蚀第二只眼睛。
   注:为避免受伤，针可抓住用干净的纸巾针擦拭举行的拇指和食指，然后用另一只手通过擦去拇指和食指拉针进行清洗。可替代地，针可以被擦拭到一个湿纸巾擦拭的表面并检测清洁度。
5. 当完成后，可使用移液管到蜗杆移动到含有新鲜水虫标记的菜。如果分析组数据，放置最多20个蠕虫在一个100毫米的培养皿。如果随着时间的推移在同一个人的跟踪再生，放置1个蜗杆成12孔板的每个孔中。一旦所有蠕虫被转移，通过去除从餐具/孔所有蠕虫水中，并用更多的新鲜水蠕虫更换冲洗蠕虫。
   1. 从过滤器除去蠕虫，后送与蜗杆水少量移液管并释放水到所述蠕虫。这应该解除ŧ他蠕虫关闭滤纸，立即被吸进吸管转移。
6. 孵育约20℃（室温）下避光实验并按照再生过程。
   注:蠕虫可被存储在一个温度控制的恒温箱中保持恒定的温度，但是这不是严格必需的。大部分房间的温度只有+ 5°C，这将不会影响该蠕虫的再生能力有所不同。
7. 如果需要的话，固定用于免疫组织化学蠕虫（参见图3-4）和/或基因表达的原位杂交分析。不同的固定方法为免疫组织化学涡虫^18，19，20和原位杂交^{21，22，23个}协议存在。
8. 当实验结束后，sacrifiCE由从培养皿中除去蠕虫水中，并用70％的乙醇代替活蠕虫。蠕虫孵育3-5分钟，检查蠕虫病毒裂解和转灰。
9. 发生一次牺牲了正常的废物流中未经处理的蠕虫。避免将活虫体进入环境，特别是非本地物种。

对于第1-2小时手术后，动物可能比完整的蠕虫（但是他们仍然会移动）表现出下降的运动。如果需要的话，蠕虫将在外科手术后24个小时内吃（例如，RNAi的馈送）。在之后一段时间内同一个人的眼睛再生时，确保每次取虫的照片既手术（完好）之前，在1个小时后消融（HPA）。 4天后消融（DPA）再生色素细胞应该是可见的，并且通过14 DPA整个眼睛将有完全再生（ 图3A-B）。这包括在感光体神经元及其神经支配的脑（ 图3C），以及作为视觉系统（ 图4A-C）的功能恢复。成功消融不会干扰脑（ 图4D-E）的下面的组织，也没有介绍其他受伤动物（ 图5A）。不成功消融包括与动物:连接两个眼睛（ 图5B），眼泪给动物（ 图5C）的侧缘，穿过腹部表皮（ 图5D）戳和/或伤口部位的过大的切除。此外，不成功的消融包括不完全去除整个视杯，包括白色无颜料组织和黑色素细胞（ 图5E-F）两者。

图1:手术准备。冷板结构的（A）图，使用100毫米的培养皿的底部（装满冰）和60毫米陪替氏培养皿（颠倒放置冰表面上）的盖。 （B）在手术表面的图，从（从上到下）白色滤纸，潮湿折叠的薄纸擦拭，堆叠和一块石蜡膜制成。（C）手术成立（为右手）。答:解剖范围，B:鹅颈照明，C:手术表面，D:珀耳帖板，E:盘5-7毫米蠕虫准备消融，F:洗涤瓶蠕虫水的，G:筷子休息保持干净的移液管， H:筷子休息保持针/注射器，I:筷子休息保持镊子，J:额外移液管的容器。 （D）的自定义珀尔帖板配置。 （E）培养皿冷板配置。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:在消融期间手和针/注射器的位置。手的（A）的展示位置（右手）。请注意，左手拇指被用于支持注射器（举行在右手），以尽量减少运动。有关该蠕虫的眼睛针（B）安置。需要注意的是针的斜面朝上。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:涡虫烧蚀眼睛再生。 Schmidtea地中海的形态 涡眼再生长下述（A）的双眼消融和（B）单只眼烧蚀。 （C）免疫组织化学显示以下单眼消融感光神经元（抗抑制蛋白）的再生。完整蠕虫手术前被示出，并重新生成在天4和消融后14中所示。对于单眼消融，左眼是一个blated和右眼用作内部（未受伤）控制。红色箭头:消融眼睛。比例尺=100μm左右。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4:视觉系统的消融后功能恢复。 （A - C）功能测定法来测试涡虫畏光。 （A）完整蠕虫避免通过光的区域，例如从绿色激光指针的光点行进。 （B）在24小时后消融"盲"双眼烧蚀蠕虫行进通过光点。 （C）在第7天后烧蚀，双眼烧蚀蠕虫再生他们的视觉系统充分地恢复光回避。黄色箭头:异常行为人的响应。 （D - E）眼消融被限制为视杯的组织，并且不干扰下面的脑组织。 （D）示出大脑架构（抗突触蛋白）免疫组织化学是从消融到1个小时后消融前不变。在横向截面示出损伤（E）苏木精和伊红（H＆E）染色1个小时后消融主要局限于烧蚀视杯的部位。右眼（用黑色色素细胞）用作内部对照。红色箭头:消融眼睛。比例尺= 1mm的（AC）1mm时，在100微米（DE）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5:成功和失败的消融的标志。 >（A）成功单，双眼的消融（在5分钟后烧蚀）具有在尺寸上与原始视杯大致相似的伤口。 （B - E）不成功消融:（B）过多组织被去除或伤口连接两个眼睛，（C）创伤部位眼泪并延伸到余量，（D）的伤口太深并从戳通背侧（D）向腹侧（D"）侧，和（E - F）不是所有的视杯组织被去除，可视化两个形态（E）和由所述感光神经元（F）的抗抑制蛋白染色。黄色箭头:异常消融。黄色圆圈:消融部位。比例尺=100μm左右。 请点击此处查看该图的放大版本。

此眼消融技术提高了对当前方法（如打孔）通过排除脑组织和主要限制切除到眼组织中。通过实践，这项技术可以被大多数人来执行，技术人员在显微外科经验不足，但认真的本科生经历。因此建议该技术使用在实验的消融，包括通过免疫组织化学或在眼睛标志物^4，5，13 原位杂交（如果可能）完全去除所有眼部组织的确认之前，实行多次。在这个协议中最关键的步骤是舀出组织。它不删除过多或过少的组织是非常重要的。这可以通过不与针舀得太深，以避免通过对蠕虫的腹侧穿透避免。的娘家姓的尖端DLE应该只插入深约0.4毫米，针的斜面部分不应该去，一路过关斩将的眼睛。特别应注意不要损坏两眼之间的脆弱组织（每只眼睛的黑色有色区的内侧边缘代表每只眼睛的边界）。也应避免眼睛和蠕虫的远边之间的伤害。小蠕虫更容易撕裂或无意地伤害，所以建议使用更大的蠕虫病毒（特别是对实践）的。该技术的主要限制是，它是比较耗费时间（和不适合高通量筛选），它需要在练习，以保证结果的准确性的初始投资。然而，随着实践10眼，可以在约15分钟消融。

排除故障的一个主要领域是在手术过程中保持涡动。的原因主要有两个蠕虫没有充分固定进行消融冷温度的（a）中太多的水和（b）的损失。 （A）的过量水涡该手术表面上池而转移蠕虫将允许蠕虫移动和手术复杂化。手术表面（无绒毛的纸巾擦拭和滤纸）应该只保持湿润。如果在擦拭变得与蜗杆水饱和的过程中的任何一点上，应当要么被替换或移液管可以用来温和地去除从组织过量流体擦拭（总是从擦拭而不是滤纸绘制）。织物擦巾还可以用于手术去除表面上多余的积水。这个过程可能需要重复很多次，具体取决于正在消融的蠕虫的数量。 （B）如果在使用培养皿冷板设置，记住作为冰开始融化和60毫米的培养皿盖子开始浮起尽快更换冷板。这将保证双方稳定的手术表面和适当的冷表面。或者，如果使用珀耳帖板设置，要知道，45分钟至1小时的使用后，在外圈的热量将克服冷板在中心和所有冷却将会丢失。如果发生这种情况，关闭珀耳帖板5-10分钟，以使其恢复消融前恢复至室温。

故障排除的另一个领域是菜和手术表面，然后再返回之间蠕虫传输过程中。如果消融蠕虫是很难从滤纸取出，放置蠕虫水对蠕虫下降，直到在滤纸上的顶部液体池。然后蠕虫可被吸入到移液管如常。如果问题仍然存在，尝试先翻转蠕虫到其腹侧（使用镊子沉闷侧）。如果蠕虫卡在移液管内得到，这通常是水分过多已采取了（蠕虫应该被吸入移液管距离不超过一英寸）的标志。以除去卡在移液管的蜗杆，制定1-2毫升蠕虫笏的呃移液管，使蠕虫被水覆盖。牢固地轻弹移液管的一侧，直到蜗杆从移液管的壁分离，并且是浮动的。

如果针头变钝，请更换新的针头/注射器。考虑使用它来消融≥30眼睛后更换针头。通过用纸巾擦拭去除过多切除组织的擦拭也可以平淡的针，使得消融更加困难。如果切除组织留针的斜面部分在整个范围内（甚至可以跨多个动物）的过程这是好的。的不同条件蠕虫之间变化时（ 例如，野生型与 RNAi的蠕虫）总是使用新鲜的针头/注射器，以及开始新的消融会议（ 即在不同天）时。

此手术眼消融技术是一种强大的手段，调查涡光诱导的行为（以及其遗传和神经学基础），特别是当与药物治疗或RNA干扰组合。眼消融也是一个很大的手段来阐明调节体内的内源性涡眼再生（和眼干细胞的维持和分化）的机制。由于大多数脊椎动物都有非常有限的能力再生眼部组织，了解如何真涡虫能够再生他们的目光都将在确定翻译的可能机制为今后的治疗很重要。

作者什么都没有透露。

笔者想感谢米歇尔·德奇为完善这一眼消融技术，泰勒·伯克霍尔茨与功能测试援助，迈克尔·勒文的抗抑制蛋白抗体，而顺治Morokuma为珀尔帖板信息。这项工作是由西密歇根大学WSB的SFSA资助。