نموذج ثقافة الانسجه السابق فيفو من أعاده عرض الغضروف في الركبة البقري الشرح

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف العزلة والذبح من الغضروف الشرح من الركبتين البقري. يوفر هذا الأسلوب أداه سهله ويمكن الوصول اليها لوصف التغيرات في الانسجه استجابه للمؤثرات البيولوجية أو العلاجات الجديدة التي تستهدف المفصل.

تغطي أنظمه الثقافة المجرية السابقة مجموعه واسعه من التجارب المخصصة لدراسة الانسجه والوظائف الخلوية في بيئة أصليه. الغضروف هو نسيج فريد من نوعه مهم للوظيفة المناسبة لمفصل الزليلي ويتكون من مصفوفة كثيفه خارج الخلية (ECM) ، غنيه في بروتيجليكان والكولاجين من النوع الثاني. غضروفي هي نوع الخلية الوحيدة الموجودة داخل الغضروف وواسعة الانتشار ومنخفضه نسبيا في العدد. المحفزات الخارجية المتغيرة والإشارات الخلوية يمكن ان تؤدي إلى تغييرات في تكوين ECM والتدهور ، والتي هي السمات المرضية الهامه في امراض مثل هشاشة العظام (الزراعة العضوية) والتهاب المفاصل الروماتويدي.

نماذج الغضروف الفيفو السابقة تسمح 1) التنميط من التعديلات غضروفي توسط من دوران الانسجه الغضروف, 2) تصور الغضروف تكوين ECM, و 3) غضروفي أعاده ترتيب مباشره في الانسجه. التنميط هذه التعديلات استجابه لمحفزات أو العلاجات ذات اهميه عاليه في جوانب مختلفه من البيولوجيا الغضروف ، وتكمله التجارب في المختبر في الغضروفي المعزولة ، أو نماذج أكثر تعقيدا في الكائنات الحية حيث الظروف التجريبية أكثر صعوبة للسيطرة عليها.

يقدم المفسرون الغضروف طريقه قابله للوصول بسهوله لتقييم أعاده عرض الانسجه في الغضروف ECM في الإعدادات التي يمكن التحكم فيها. هنا ، ونحن وصف بروتوكول لعزل والذبح الحية الغضروف البقري الشرح. يستخدم الأسلوب الانسجه من الركبة البقري ، والتي يمكن الوصول اليها بسهوله من المجزرة المحلية. ويمكن تحليل كل من الشرح والمتوسطة ثقافة مكيفه للتحقيق في دوران الانسجه ، وتكوين ECM ، ووظيفة غضروفي ، التالي التنميط ECM التحوير.

غضروفي إنتاج وصيانة مصفوفة الغضروف. من أجل دراسة بيولوجيا غضروفي وكيف يتفاعلون مع المحفزات الخارجية ، فمن الضروري استجوابهم في بيئتهم الاصليه^1،2. دراسة دوران الانسجه الغضروف مهم لزيادة فهم أليات الكامنة في الامراض المشتركة مثل الزراعة العضوية ، وهو المرض الذي لا يوجد حاليا اي مرض تعديل العلاج. التالي ، هناك حاجه كبيره لتحسين نماذج الترجمة².

وصف الجسم الحيوي السابق للآثار الخلوية والانسجه ضروري لتكمله النماذج السريرية الأخرى ، سواء في المختبر ، مثل ثقافات غضروفي أحاديه الطبقة ، وفي الجسم الآخر ، مثل نماذج الزراعة العضوية المستحثة بالجراحة أو نموذج التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين المناعي الذاتي (CIA ). وقد أبرزت العديد من الدراسات الاختلافات بين كيفيه تصرف الخلايا في الثقافات أحاديه الطبقة 2d وهياكل 3d أو في الانسجه الاصليه^3,4. تعتمد العديد من الخلايا في الطبقات ثنائيه الابعاد مورفولوجيس غير طبيعيه ، بما في ذلك الاختلافات في قطبيه الخلية ومرفق الانسجه ، مما يؤدي إلى اختلافات بصريه ووظيفية في الخلايا داخل الانسجه الاصليه⁵. الاختلافات واضحة أيضا في وظائف الخلايا ، والتي قد تحول التعبير البروتين ، مما يؤدي إلى تغيير جذري أنماط التمايز ، واليه التنظيمية ، ووظائف الخلية^{5،6،7 ،8}.

الغضروف ECM يتكون أساسا من النوع الثاني الكولاجين توفير اطار مصفوفة ، و aggrecan ، بروتيجليكان ان يساعد علي الاحتفاظ بالسوائل داخل الانسجه. جزيئات مصفوفة أخرى مثل الكولاجين من النوع الرابع ، السادس ، التاسع ، العاشر ، الحادي عشر ، الثاني عشر ، الفيبرونكتين ، الغضروف بروتين القلة (COMP) ، biglycan ، ديكور ، و perlecan هي أيضا الحاضر⁹.

في حين ان الحساسية من الزراعة العضوية لا تزال غير واضحة^10,11, ويعتقد ان ظهور المرض بسبب الاختلالات في دوران الانسجه وعمليات الإصلاح^12,13. تدهور الغضروف المفصلي هو السمة المميزة للزراعة العضوية. الغضروف المقيم غضروفي أو الخلايا في الانسجه المحيطة بها زيادة إطلاقها من السايتوكينات, تحفيز إنتاج مرتفعه من بروتينيه مثل مصفوفة ميتالبروتينيساسات (MMPs) و aggrecanases, التي تزيد من تدهور الغضروف ECM ¹⁴-ويؤدي هذا التدهور إلى الإفراج عن شظايا البروتين الصغيرة الفريدة التي يطلق عليها الجديدة ، والتي يمكن قياسها كميا في المصل أو البول أو الثقافة المتوسطة¹⁵. عند تشكيل ونضوج الكولاجين ، يتم أيضا الإفراج عن ما يسمي الشظايا. ويمكن قياس هذه الكمية كمقياس لإنتاج المصفوفة¹⁶.

والهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج الغضروف الفيفو السابقة للمقارنة بين تاثير التحفيز و/أو العلاج المخدرات علي دوران الانسجه ECM. يتم موجز دوران الغضروف عن طريق قياس المصفوفات المشتقة الجديدة العلامات الحيوية مباشره في الوسط ثقافة مكيفه باستخدام ELISA: AGNx1 (تعكس النشاط aggrecanase) ، C2M (تعكس النشاط التناسبية مصفوفة) ، و ProC2 (يعكس نوع الثاني الكولاجين تشكيل). يمكن التحقق من النتائج عن طريق تلطيخ النسيجية من ECM ، والتي تصور أيضا تنظيم غضروفي في الشرح الفردية. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف لاختبار تاثير العلاجات الجديدة علي وظيفة غضروفي ودوران الغضروف في المحتوي. وقد استخدم عدد من الدراسات النازعون الغضروف لوصف العمليات البيولوجية أو تاثير التدخل علي المفسرين التحدي السايسيسين باستخدام النسيجية الكمية أو النهج مناعي ، mRNA ، والتعبير عن البروتين ، أو بروتيميكس^{2 و17و18}. ومع ذلك ، فان هذه البروتوكولات تقع خارج نطاق المخطوطة الحالية.

1. عزل الانسجه

1. مصادر الانسجه
   1. أداء القسم بأكمله مصادر الانسجه خارج غطاء محرك التيار الصفحي في بيئة معقمه.
   2. من المسلخ المحلي ، احصل علي مفصل الركبة البقري الطازج بأكمله من العجول بين 1.5 و 2 سنه من العمر.
   3. تشريح الركبة برفق عن طريق أزاله اللحم الزائد أولا ، والكشف عن المفاصل ، والغضروف المفصلي ، والأوتار ، والغشاء الزليلي. قطع الأوتار والغشاء الزليلي ، مما يسمح لمفصل لdismember. أزاله الغضروف المفصلي للكشف عن الملتصقة الفخذ.
   4. عزل المفسرين من المنطقة الحاملة للمخروطيات الفخذية باستخدام الخزعة بحجم 3 مم وإطلاقها من السطح المفصلي بالقطع بالتوازي مع مشرط القرب من عظمه الغضروف الفقري قدر الإمكان. وينبغي ان الهيكل الصلب للعظام تحت الغضروف ضمان ان المفسرين لا تحتوي علي مصفوفة متكلسة. السعي لشرح مع ارتفاع موحد.
   5. علي الفور تخزين ومزج الشرح في DMEM/F12-جلوساماكس + 1 ٪ P/S الثقافة المتوسطة في أنبوب 50 mL أو طبق بيتري. لا تخلط الشرح من ركبتي البقرة المختلفتين ولكن تبقي منفصلة لكل دراسة.
2. خياطه الانسجه
   1. نقل التفسيرات إلى لوحه معقمه 96 جيدا في غطاء التيار الرقائقي.
   2. اغسل الشرح 3 مرات في الثقافة المتوسطة أو تلفزيوني والثقافة لهم في 200 μL من الثقافة المتوسطة في بئر حتى بداية التجربة. استخدم فتره غسيل لمده يوم واحد لمزامنة النشاط الخلوي لخزعة والإفراج الحيوي السلبي.
   3. ثقافة الشرح حتى 10 أسابيع في 37 درجه مئوية حاضنه مع 5 ٪ CO₂. وضع كل النسخ المتماثلة داخل كل مجموعه قطريا في لوحه الثقافة للتقليل من التباين الناجم عن التبخر. ان يزيد يتفادى تبخر من ال [سوبرننت], أضفت [ببس] إلى الآبار خارجيه من الثقافة لوحه.

2. علاج الغضروف البقري المفسر وتقييم النشاط الأيضي

1. ثقافة التغيير المتوسط والعلاج
   1. تغيير المتوسطة الثقافية كل 2-3 يوما في غطاء التيار الرقائقي.
   2. إذا كان تطبيق اي علاج ، واعداد هذه قبل تغيير المتوسطة. اعداد العلاجات للتركيز المطلوبين في الآبار المفسرة عن طريق التخفيف في الوسط الثقافي.
   3. برفق أزاله ماده طافي من كل بئر ونقله إلى لوحه جديده 96 جيدا. تخزين ماده طافي مع ختم الشريط في − 20 درجه مئوية لتحليل المؤشرات الحيوية لدوران الانسجه والتعبير عن البروتين.
   4. فورا أضافه 200 μL من الثقافة الطازجة المتوسطة أو العلاج في البئر. لا تدع الشرح يجف خلال التغيير المتوسط والتاكد من ان جميع المفسرين مغمورة تماما في الوسط الجديد.
2. تلطيخ اللازوردية
   1. قياس النشاط الأيضي مره واحده أسبوعيا كقياس غير مباشر لبقاء الخلية. يعد اختبار أعاده البيع طريقه سهله لتقييم ما إذا كان النشاط الأيضي لمفسري الشرح يتدهور لشرح فردي بسبب موت الخلايا أو التغيرات الخلوية. الشرح في الثقافة المتوسطة وحدها لديها مستقره نسبيا resلازوردي القراءة طوال فتره التجربة.
   2. اصنع محلولا من الثقافة المتوسطة مع 10% من أعاده البيع.
   3. حصاد ماده طافي كما هو موضح في الخطوة 2-1-3.
   4. تزج الشرح في 10 ٪ resلازوردي الحل ل 3 ح في 37 درجه مئوية أو حتى السوبر بدوره الأرجواني. وتشمل 4 الآبار دون الشرح كعناصر التحكم في الخلفية.
   5. نقل التحكم المشروط والخلفية resلازوردي الحل للوحه عيار مكروي السوداء وقياس مضان في 540 nm الاثاره/590 نانومتر الانبعاثات.
   6. يغسل جيدا 3 مرات في الثقافة المتوسطة أو التلفزيونية وتحت دمج المفسرين في غسل المتوسطة لمده 5-10 دقيقه للسماح لل resلازوردي لمنتشر تماما خارج. أضافه المتوسطة الثقافة الجديدة أو العلاجات إذا ما استخدمت.

3-الإنهاء والتثبيت وتخزين العينات

1. إنهاء فتره الذبح
   1. قياس النشاط الأيضي كما هو موضح في الخطوة 2.2. أضافه 200 μL من تلفزيوني لكل بئر.
2. التثبيت والتخزين
   1. أزاله تلفزيوني ، أضافه 200 μL من الفورمالديهايد في بئر ، وترك ل 2 ح في درجه حرارة الغرفة.
   2. التخلص من الفورمالديهايد وأضافه 200 μL من تلفزيوني لكل بئر. تغطيه لوحه مع ختم الشريط ، وتخزين في 4 درجه مئوية للتحليل الكيميائي النسيجي. نوصي باجراء التحليل الكيميائي النسيجي في غضون 3 أشهر.

4. دوران الانسجه البيولوجية (اليسا)

1. التنافسية غير المباشرة ELISAs
   1. معطف الصفيحة العقديه مع المقايسة المحددة الهدف-الببتيد المخفف 1:100 في المخزن المؤقت المقايسة (100 μL لكل بئر) لمده 30 دقيقه في 20 درجه مئوية.
   2. يغسل 5 مرات مع المخزن المؤقت الغسيل القياسية وأضافه عينه-supernatant (20 μL لكل بئر) مع الأجسام المضادة الاحاديه الاوليه ضد الهدف المقايسة-الببتيد المخفف 1:93.3 ل ProC2 و 1:100 في المخزن المؤقت لمقايسة AGNx1 (100 μL لكل بئر) واحتضان ل 2 ح في 20 درجه مئوية مع اهتزاز ل ProC2 و 3 ح في 20 درجه مئوية ل AGNx1.
      ملاحظه: يتم أخذ وحده التخزين العينة مباشره من لوحات ماده طافي المخزنة. إذا كان التركيز المقاسه خارج نطاق قياس المقايسة ، تمييع ماده طافي في لوحه التخفيف القاع في الحاجز التلفزيوني أو الفحص العازلة.
   3. غسل 5 مرات مع العازلة القياسية الغسيل واحتضان مع الأجسام المضادة المسمي البيروكسيديز الثانوية المخفف 1:100 في المخزن المؤقت المقايسة (100 μL لكل بئر) ل 1 ح في 20 درجه مئوية.
   4. يغسل 5 مرات مع المخزن المؤقت الغسيل القياسية واحتضان مع الاهتزاز لمده 15 دقيقه في الظلام عند 20 درجه مئوية مع tetramايثيل البنزيدين (TMB) كركيزة البيروكسيديز (100 μL لكل بئر).
   5. إنهاء رد الفعل مع الحل وقف القياسية ، 0.1 M H₂SO₄ (100 μl لكل بئر).
   6. قراءه رد الفعل اللوني في الامتصاص 450 nm باستخدام الامتصاص المرجعي في 650 nm علي قارئ لوحه المختبر القياسية.
2. اليساس التنافسية المباشرة لقياس دوران الانسجه الغضروف في سوبرناتانت
   ملاحظه: هذا ثبت قيمه C2M.
   1. معطف العقديات-لوحه مع محدده الهدف المقايسة الحيوية-الببتيد المخفف 1:100 في المخزن المؤقت المقايسة (100 μL لكل بئر) لمده 30 دقيقه في 20 درجه مئوية.
   2. غسل 5 مرات مع المخزن المؤقت الغسيل وأضافه عينه-supernatant جنبا إلى جنب مع 100 μL من البيروكسيديز المسمي الأجسام المضادة الاحاديه ضد الهدف المقايسة-الببتيد المخفف 1:100 في المخزن المؤقت المقايسة (20 μL لكل بئر). احتضان لمده 20 ساعة في 2 – 8 درجه مئوية مع الاهتزاز.
      ملاحظه: يتم أخذ وحده التخزين العينة مباشره من لوحات ماده طافي المخزنة. إذا كان التركيز المقاسه خارج نطاق قياس المقايسة ، تمييع ماده طافي في لوحه التخفيف القاع في الحاجز التلفزيوني أو الفحص العازلة.
   3. يغسل 5 مرات مع المخزن المؤقت الغسيل القياسية واحتضان مع اهتزاز لمده 15 دقيقه في الظلام في 20 درجه مئوية مع TMB كركيزة البيروكسيديز (100 μL لكل بئر).
   4. إنهاء رد الفعل مع الحل وقف القياسية ، 0.1 M H₂SO₄ (100 μl لكل بئر).
   5. قراءه رد الفعل اللوني في الامتصاص 450 nm مع الامتصاص المرجعي في 650 nm علي قارئ لوحه المختبر القياسية.
3. AGNx1
   1. القياس الكمي للتدهور الناجم عن الAGNx1 الجديدة. وتستهدف هذه المقايسة غير المباشرة التنافسية ELISA الببتيد C-المحطة الطرفية (NITEGE³⁷³) التي تم إنشاؤها بواسطة ادامتس-4 و 5 الانقسام. الأجسام المضادة الاحاديه تعترف بكل الشظايا مع مرمه NITEGE المكشوفة. نشرت التفاصيل تجريبية من الفحص في مكان آخر¹⁹.
4. Proc2
   1. كميه تشكيل الكولاجين النوع الثاني عن طريق قياس الإفراج عن profragment من النوع الثاني من الكولاجين. هذه المقايسة غير المباشرة التنافسية ELISA تستهدف المرضبه من بروببتيد PIIBNP (QDVRQPG) المتولدة من N-بروبيبتياسيس اثناء تقليم الكولاجين من النوع الثاني التوليف حديثا. وقد نشرت التفاصيل التجريبية لمقايسة في مكان آخر¹⁶.
5. C2M
   1. قياس النوع الثاني من تحلل الكولاجين من خلال الإفراج عن الجزء الC2M الجديد. هذه اليسا التنافسية المباشرة تعترف التناسبية المشقوقة C-الطرفية الببتيد (KPPGRDGAAG¹⁰⁵³). هذا الفحص يختلف عن AGNx1 و ProC2 كما هو الأجسام المضادة الاساسيه التي هي البيروكسيديز-المسمي التالي ، وتستخدم ككاشف. نشرت التفاصيل تجريبية من الفحص في مكان آخر²⁰.

5. التحليل النسيجي

1. التسلل والتضمين والقطع
   1. ضع الشرح المثبت (انظر الخطوة 3.2) في أشرطه الكاسيت المسمية بشكل فردي. تضمين كل من التسمية داخل الكاسيت وأشرطه التسمية لضمان التعريف.
   2. انقل الشرائط التي تحتوي علي الشرح إلى اله معالجه الانسجه. ثم التسلل الشرح مع البارافين في سلسله من الجفاف والخطوات تسرب البارافين.
      1. ديهيدرات مع 96 ٪ الايثانول لمده 90 دقيقه مع عدم وجود تعديل في درجه الحرارة. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
      2. مسح الايثانول مع تولوين لمده 90 دقيقه مع عدم وجود تعديل في درجه الحرارة. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
      3. مسح الايثانول مع تولوين ل 90 دقيقه في 60 درجه مئوية.
      4. التسلل مع شمع البارافين لمده 30 دقيقه في 60 درجه مئوية.
      5. التسلل مع شمع البارافين لمده 60 دقيقه في 60 درجه مئوية.
      6. التسلل مع شمع البارافين لمده 90 دقيقه في 60 درجه مئوية.
      7. لكل خطوه ، أضافه الحلول إلى غرفه العينة مع بطء ضخ التدريجي وضخ في التدفقات تحت 33-34 كيلو باسكال. تشغيل عمليه التسلل في دوره الضغط/فراغ مع الفراغ الأقصى من − 65 إلى − 70 kPa.
   3. بعد التسلل ، ضع الكاسيت علي كتله تسخين للسماح بازاله الشرح بعناية من الكاسيت. أدمج برفق المفسرين المخترقين في كتل البارافين الفردية. مع ملقط ساخن ، ضع الشرح مع الغضروف المفصلي السطحي والجوانب العظام تحت الغضروف عمودي علي سطح القطع ، وضمان التصور من طبقات الغضروف مختلفه داخل كل قسم العينة.
   4. قطع 5 μm أقسام من البارافين المبردة كتل مع الشرح جزءا لا يتجزا من ميكروتومي. نقل أقسام قطع إلى حمام المياه الباردة. إذا لزم الأمر ، يمكن فصل الأقسام باستخدام اما مشرط أو غطاء زجاجي.
   5. باستخدام شريحة زجاجيه غير مغلفه بعناية ، نقل الأقسام إلى حمام الماء الدافئ (50 درجه مئوية) ، حيث تتكشف الأقسام. رفع كل مقطع علي شريحة غطاء المسمي ووضع علي صفيحه ساخنه لمده 30 دقيقه.
   6. وضع الشرائح في سله واحتضان في 60 درجه مئوية لمده 1 ساعة ومن ثم الاحتفاظ بها بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية. الاخره ، تخزين الشرائح في حاويات مغلقه في 4 درجه مئوية حتى تلطيخ.
2. سافانين O/الأخضر السريع تلطيخ والتصور
   1. ضع الشرائح لتكون ملطخه في سله واحتضان الشرائح في 60 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
   2. اعداد وتصفيه جميع الكواشف مع فلتر 0.45 mm.
   3. في التحضير لتلطيخ ، صب الكواشف المصفاة في أكواب إلى وحده تخزين تسمح للحلول لتغطيه تماما الشرائح عند دمج السلة. الأكواب المستخدمة المطلوبة حجم 250 mL لتغطيه الشرائح.
   4. المغادرين الشرائح ذاب من خلال دمج سله في تولوين لمده 10 دقيقه مرتين ، 99 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين ، 96 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين ، و 70 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين. ثم ، هيدرات الشرائح في الماء لمده 2 دقيقه.
   5. وصمه عار المنزلقات والشرائح المائية من خلال دمج السلة في Weigert في محلول الحديد الهيلوكسيلين (pH 1.5) لمده 10 دقيقه ، وتراجع في 1 ٪ HCl مره واحده ، وشطف مع تشغيل مياه الصنبور لمده 5 دقائق تقريبا أو حتى اللون الزائد قد جرفت.
   6. المقبل ، وصمه عار في 0.05 ٪ الحل الأخضر السريع (pH: 5.75) لمده 5 دقائق ، وتراجع في 1 ٪ CH₃cooh مره واحده ، ووصمه عار في 0.1 ٪ سافانين O (ph: 6.5) لمده 20 دقيقه.
   7. ديهيدرات ومسح الشرائح عن طريق غمس مرتين في 70 ٪ الايثانول ، 96 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين ، 99 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين ، والتولوين 2 دقيقه مرتين.
   8. جبل الشرائح الزجاجية غير المصقولة مع متوسطه راتنجيه تغطي الشرائح الانسجه.

الأبقار الكاملة العمق الشرح كانت معزولة ، مثقف ، ومعالجتها لمده 3 أسابيع (الشكل 1). تم تغيير الوسط الثقافي مع أضافه العلاج 3 مرات في الأسبوع. مره واحده أسبوعيا ، تم قياس النشاط الأيضي من قبل الفحص resلازوردي. وقد قيست المؤشرات الحيوية لدوران المحتوي في القائمة البيولوجية التي تم حصادها من لوحه الثقافة 3 مرات في الأسبوع. تم تقسيم الشرح إلى 4 مجموعات للعلاج: 1) Oncostatin M و TNFα (O + T) ؛ 2) O + T + GM6001 (GM6001) ؛ 3) الانسولين مثل عامل النمو-1 (IGF-1); و 4) السيطرة دون علاج (ث/س).

النشاط الأيضي.

النسبة لجميع المجموعات الأربع ، كان النشاط الأيضي مستقرا نسبيا طوال الأسابيع الثلاثة (الشكل 2ا). كان هناك ميل للمنتدى-1 لزيادة النشاط الأيضي قليلا فوق المجموعة ث/س وللمجموعات O + T لإنقاصه. وقد استخدمت المقايسة اللازوردية لتقييم نشاط الغضروفي بسهوله في كل تفسير ولتقييم مدي صلاحيه الخلية بشكل غير مباشر دون استخراج الشرح من التجربة. إذا اظهر الشرح انخفاضا كبيرا في النشاط الأيضي اثناء التجربة ، يمكن استبعاد الشرح من المزيد من التحليل.

العلاج تقويضي.

تم تطبيق o + T 3 مرات أسبوعيا إلى الآبار الثقافة للتحقيق O + T-بوساطة تدهور الغضروف (الشكل 3، الشكل 4). تم تقييم تحلل الكولاجين من النوع الثاني الذي تم التوسط فيه بشكل تناسبي والتحلل الذي تم بوساطة aggrecanase بواسطة C2M و AGNx1 ELISAs. O + T زيادة تدهور الكولاجين من النوع الثاني من أيام 7-21 (الشكل 3ا) وتدهور aggrecan من أيام 3-14 (الشكل 4ا) بالمقارنة مع المجموعة ث/س. عند أضافه GM6001 (المثبط التناسبي المختلط واسع الطيف) في تركيبه مع O + T العلاج ، تم حظر الإصدار O + T بوساطة C2M (الشكل 3ا ، ب). ولوحظ الإفراج عن AGNx1 انخفضت عند أضافه GM6001 في الأيام 3-7 ، ولكن قمم الإفراج عن AGNx1 في اليوم 10 علي مستويات مماثله لمجموعه O + T (الشكل 4ا) ، مما يدل علي GM6001 فقط يقلل من تدهور aggrecan إلى حد محدود. هذا النمط في AGNx1 و C2M الإفراج هو الصورة العامة التي لوحظت في نموذج الغضروف البقري حفز مع O + T. أولا ، يتم الإفراج عن AGNx1 من اليوم تقريبا 3 وقمم في أيام 10-14 ، مما يمثل تدهورا في وقت مبكر من aggrecan. المقبل ، بعد أسبوعين من الخياطة مع O + T ، لوحظ النوع الثاني من تحلل الكولاجين مقيسا بالمؤشر الإحيائي C2M.

العلاج الابتنائيه.

للتحقيق في كيفيه تحفيز الابتنائيه ينظم دوران الغضروف ECM, الانسولين مثل عامل النمو-1 (IGF-1) تم تطبيق 3 مرات أسبوعيا إلى الأبقار كامل العمق الشرح. ولوحظ تاثير IGF-1 علي التفسيرات الغضروف أساسا علي قياسات من النوع الثاني تشكيل الكولاجين, تقييمها من قبل ProC2, كما هو متوقع للمؤثرات الابتنائيه (الشكل 5). اليوم 0 في هذا النموذج يظهر دائما قياسات ProC2 عاليه ، وربما كرد فعل لاستخراج العينات. هذه المستويات العالية تنخفض بشكل كبير والمستوي من 7-21 أيام. عند علاج مع IGF-1, انخفاض مستويات ProC2 اقل من تلك التي لوحظت في المجموعة ث/س, مشيرا إلى ان IGF-1 يحفز تشكيل الكولاجين النوع الثاني من اليوم 7 (الشكل 5ب). تظهر الرسوم البيانية ProC2 أيضا التنوع البيولوجي لأبقار. واستخدمت في هذه التجارب الشرح من الأبقار اثنين مع 6 الشرح لكل بقره لكل مجموعه. كانت البقرة الاولي أكثر سمكا الغضروف وولدت الشرح أكبر ، مما ادي إلى ارتفاع مستويات ProC2 في خط الأساس ، في حين كانت البقرة الثانية أصغر مع الغضروف ارق ، مما ادي إلى انخفاض مستويات ProC2 في خط الأساس. بالنسبة للمجموعات w/o ، IGF-1 ، و O + T ، تمثل مستويات ProC2 المصورة متوسط الشرح من كلا البقرتين ، ولكن تم قياس GM6001 فقط في البقرة الثانية مع الشرح ارق. وهكذا ، بدات مجموعه GM6001 مع مستويات ProC2 اقل في اليوم 0 ، وهو أمر واضح في منطقه ProC2 تحت المنحني (اوك) (الشكل 5ج). تطبيع قيم ProC2 إلى اليوم 0 المستويات ياخذ التباين البيولوجي في الاعتبار ، التالي تبين فعاليه العلاج (الشكل 5ب ، د).

وأجريت البطانات النسيجية "سافانين" و "الأخضر السريع" لتصور محتوي البروتيوغليكان وبنيه الغضروف للشرح طوال التجربة (الشكل 6). في أيام 0 ، 7 ، 14 ، و 21 ، الشرح من ث/س ، IGF-1 ، و O + T المجموعة كانت مثبته لتلطيخ النسيجية (الشكل 6). ظهرت المجموعة ث/س ومنتدى أداره البريد الكتروني-1 ان يكون لها مماثله سافانين O تلطيخ كثافة إلى اليوم 0 شرح طوال التجربة, الذي يرتبط مع النتائج البيولوجية تبين ان أيا من المجموعتين زيادة الإفراج AGNx1 (الشكل 4). العلاج مع O + T ادي إلى فقدان المحتوي بروتينيه كبيره في اليوم 7 والخسارة الكاملة في اليوم 21. وعلاوة علي ذلك ، تنخفض كثافة تلطيخ الأخضر السريع من أيام 14-21 ، مما يشير إلى فقدان الكولاجين في المحاذاة مع نتائج C2M.

الشكل 1: نظره عامه تخطيطيه لطريقه الغضروف البقري.
في اليوم − 1 ، تم عزل الأبقار الفخذية البقرية من المفصل الخلفي. تم الإفراج عن الغضروف كامل العمق الشرح من الملامسات مع مشرط والخزعة. تم غسلها ونقلها الشرح المستخرجة إلى لوحه الثقافة المعقمة 96 جيدا. في اليوم 0 ، 3 ، 5 ، 7 ، 10 ، 12 ، 14 ، 17 ، 19 ، و 21 ، تم حصاد ماده طافي من لوحه الثقافة ، ونقلها إلى لوحه تخزين ، وابقي في − 20 درجه مئوية ، كما هو موضح في التغيير المتوسط الخطوة 1. وفي وقت لاحق تم أذابه سوبرناتانت المخزنة لقياس دوران الانسجه الحيوية من قبل اختبارات ELISA محدده. في الخطوة المتوسطة التغيير 2 ، بعد أزاله supernatant ، تم تطبيق الثقافة الجديدة المتوسطة التي تحتوي علي العلاجات المختلفة أو لا علاج لشرح التحكم. في اليوم 0 و 7 و 14 و 21 ، تم احتضان المفسرين بمحلول 10% من ريازرين لمده 3 ساعات بعد حصاد العملاق. تم نقل 10 ٪ من الصوديوم الفائق إلى صفيحه سوداء 96ه اللون حيث تم قياس التفاعل اللوني. تم غسل الآبار الثقافية 3 مرات قبل ان يتم أضافه المتوسطة الثقافة الجديدة مع أو بدون علاج إلى الشرح كما هو موضح في الخطوة المتوسطة التغيير 2. في يوم 21 ، بعد الحصاد من ماده طافي والقياس resلازوردي ، تم تثبيت الشرح من قبل الحضانة مع الفورمالديهايد ل 2 ح. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: النشاط الأيضي الذي يقاس بواسطة resلازوردي.
وكانت الأبقار الكاملة العمق الشرح الغضروف معزولة ومثقف لمده 3 أسابيع. تغيرت الثقافة المتوسطة مع أضافه علاج جديد 3 مرات في الأسبوع (ن = 12 الشرح من 2 الأبقار). وتالف العلاج من IGF-1 [100 ng/mL], الوسم + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], و O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. تم تضمين مجموعه تحكم بدون معالجه (w/o). لل ث/س, IGF-1, و O + T المجموعة, يتم عرض الخطا المتوسط والقياسي لمتوسط (SEM) من 12 نسخ متماثلة من 2 الأبقار (6 نسخ متماثلة لكل بقره). ل ال GM6001 مجموعه, المتوسط و [سم] من 6 نسخ متماثلة من 1 بقره أبديت. (ا) النشاط الأيضي الذي يقاس بواسطة أعاده اللازوردية. (ب) المنطقة تحت المنحني (اوك) للأيام 0-21 للرسوم البيانية للنشاط الأيضي المبينة في (ا). p > 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحلل الكولاجين من النوع الثاني مقيسا بC2M.
وكانت الأبقار الكاملة العمق الشرح الغضروف معزولة ومثقف لمده 3 أسابيع. تغيرت الثقافة المتوسطة مع أضافه علاج جديد 3 مرات في الأسبوع. وتالف العلاج من IGF-1 [100 ng/mL], الوسم + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], و O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. تم تضمين مجموعه تحكم بدون معالجه (w/o). لل ث/س, IGF-1, و O + T المجموعات, ويظهر متوسط وSEM من 12 نسخا متماثلة من 2 الأبقار (6 نسخ متماثلة لكل بقره). ل ال GM6001 مجموعه, المتوسط و [سم] من 6 نسخ متماثلة من 1 بقره أبديت. (ا) قياسات C2M. تم حساب مستوي الاهميه الاحصائيه من w/o بواسطة التدابير المتكررة (RM) ANOVA ثنائيه الاتجاه مع اختبار المقارنة المتعددة Sidak. (ب) المفوضية الجامعة للأيام 0-21 لC2M الرسوم البيانية المبينة في (ا). وقد تم حساب الاهميه الاحصائيه من قبل اختبار كروكال واليس مع اختبار المقارنة المتعددة دن. p > 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التحلل الذي يقاس بواسطة AGNx1.
وكانت الأبقار الكاملة العمق الشرح الغضروف معزولة ومثقف لمده 3 أسابيع. تغيرت الثقافة المتوسطة مع أضافه علاج جديد 3 مرات في الأسبوع. وتالف العلاج من IGF-1 [100 ng/mL], الوسم + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], و O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. تم تضمين مجموعه تحكم بدون معالجه (w/o). لل ث/س ، IGF-1 ، و O + T المجموعة ، ويعني وSEM من 12 نسخا متماثلة من 2 الأبقار (6 نسخ متماثلة لكل بقره) وتظهر. ل ال GM6001 مجموعه, المتوسط و [سم] من 6 نسخ متماثلة من 1 بقره أبديت. (ا) قياسات AGNx1. تم حساب مستوي الاهميه الاحصائيه ل w/o بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار Sidak للمقارنة المتعددة. (ب) المفوضية الجامعة للأيام 0-21 لAGNx1 الرسوم البيانية المبينة في (ا). وقد تم حساب الاهميه الاحصائيه من قبل اختبار كروكال واليس مع اختبار المقارنة المتعددة دن. * *p > 0.01 ، * * *p > 0.001 ، * * * *p > 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تشكيل كولاجين من النوع الثاني يقاس بواسطة ProC2.
وكانت الأبقار الكاملة العمق الشرح الغضروف معزولة ومثقف لمده 3 أسابيع. تغيرت الثقافة المتوسطة مع أضافه علاج جديد 3 مرات في الأسبوع. وتالف العلاج من IGF-1 [100 ng/mL], الوسم + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL], و O + T [10/20 ng/mL] + GM6001 (GM6001) [10 μM]. تم تضمين مجموعه تحكم بدون معالجه (w/o). لل ث/س ، IGF-1 ، و O + T المجموعة ، ويعني وSEM من 12 نسخا متماثلة من 2 الأبقار (6 نسخ متماثلة لكل بقره) وتظهر. ل ال GM6001 مجموعه, اليعني و [سم] من 6 نسخ متماثلة من 1 بقره [ر] يبدي. (ا) قياسات ProC2 من 0-21 يوما. (ب) القيم ProC2 التي تم تطبيعها لقياسات اليوم 0 لكل شرح فردي. النتائج ProC2 غالبا ما تستفيد من تطبيع اليوم 0 للكشف عن تاثير العلاج التي قد تكون متنكرة من قبل مستويات المؤشرات الحيوية العالية في اليوم 0. في A و B، تم حساب مستوي الاهميه الاحصائيه بواسطة ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار sidak للمقارنة المتعددة. (ج) المفوضية الجامعة للأيام 0-21 لProC2 الرسوم البيانية المبينة في (ا). (د) اوك للأيام 0-21 ليوم 0 الرسوم البيانية ProC2 تطبيع المبينة في (ب). في C و D، تم حساب الاهميه الاحصائيه من قبل اختبار كروكال واليس مع اختبار المقارنة المتعددة دن. * *p > 0.01 ، * * *p > 0.001 ، * * * *p > 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: التصور النسيجي لمحتوي البروتيوغليكان بواسطة سافانين O/اللون الأخضر السريع.
وكانت الأبقار الكاملة العمق الشرح الغضروف معزولة ومثقف لمده 3 أسابيع. تغيرت الثقافة المتوسطة مع أضافه علاج جديد 3 مرات في الأسبوع. وتالف العلاج من IGF-1 [100 ng/mL] والوسم + TNFα (O + T) [10/20 ng/mL]. تم تضمين مجموعه تحكم بدون معالجه (w/o). في اليوم 0 ، 7 ، 14 ، و 21 ، تم تثبيت الشرح ، تسللت مع البارافين ، جزءا لا يتجزا من البارافين ، شرائح ، وضعت علي غلاف الشرائح ، وملطخه بالدم ، سافانين O ، والأخضر السريع. لكل مجموعه العلاج وكل نقطه زمنيه ، يتم عرض شرح ممثل. يمثل سكليبر الموضح في نموذج الأساس (اليوم 0) 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

البروتوكول المعروض هنا لتحديد ملامح دوران الانسجه الغضروف في التفسيرات الغضروف البقري يمكن استخدامها لتوصيف اثار العلاج من أنواع كثيره من المخدرات, بما في ذلك مثبطات المسارات التهابيه داخل الخلايا, مثبطات الانزيمات البروتينية ، أو عوامل النمو الابتنائيه.

تم وصف اثنين من الاجهزه المختلفة في هذا البروتوكول: اعداد الابتنائيه حيث تم تحفيز الشرح مع عامل النمو مثل الانسولين 1 (IGF-1) ، والاعداد تقويضي يضم التحفيز مع TNF الفا و Oncostatin M ، والتي يمكن ان يكون دوران الانسجه تثبيط استخدام مثبطات التناسبي المختلط واسعه الطيف. والناتج الرئيسي في هذه الطريقة هو القياس الكمي للآل# بيولوجية الجديدة التي يتم حصادها مباشره في الوسط المكيف ، والتي تحصد طوال فتره الثقافة. يمكن قياس العديد من المؤشرات الحيوية في supernatant ، مما يسمح لتنميط في وقت واحد من عمليات تقويضي والابتنائيه مختلفه في نفس العينة. وقد استخدمت تلطيخ النسيجية مع سافانين O/الأخضر السريع للتحقق من صحة النتائج من تحليل المؤشرات الحيوية. وقد استخدمت oncostatin M, TNF الفا, و IGF-1-1 لوصف البروتوكول; ومع ذلك ، فان الأسلوب لا يقتصر علي محفزات خلوية محدده ويمكن بسهوله تبادل هذه للآخرين اعتمادا علي فرضيه أو اختبار العلاج.

تفسير الإنتاج الحيوي هو ممارسه الزمنيه بسبب التغيرات الديناميكية في غضروفي وظيفة والتعبير الجانبية مع التحفيز الابتنائيه أو تقويضي مع مرور الوقت. في الشرح غير المعالجة ، والنوع الثاني تشكيل الكولاجين يقاس بواسطة المؤشرات الحيوية ProC2 ينخفض بسرعة في غضون أيام 7-10 الاولي. التحفيز مع منتدى أداره الاتصالات-1 أو عوامل النمو المماثلة يحافظ علي الإفراج ProC2 في المتوسطة المكيفة في مستوي مماثل لخط الأساس; التالي ، فان الانخفاض هو أكثر تدريجيا ، ويتم زيادة الإفراج بالنسبة إلى الشرح غير المعالجة. في الاعداد تقويضي, الموالية للالتهابات الخلوية الحث علي زيادة التعبير عن بروتينيه من قبل غضروفي في أيام 0-14; ويتكون هذا أساسا من aggrecanases. وهذا يؤدي إلى زيادة أوليه كبيره في شظايا البروتين المشتقة من aggrecanase ، بما في ذلك AGNx1. في المراحل اللاحقة من الثقافة ، غضروفي التعبير عن المزيد من MMPs ، والذي يقود إطلاق العلامات التي تم إنشاؤها بالصيغة التناسبية المختلطة ، مثل C2M ، في اليوم 14 فصاعدا. التالي ، من أجل التعريف تاثير العلاج ، من المهم قياس المؤشرات الحيوية في الفترة الزمنيه الصحيحة.

كما هو موضح ، فان العلاج مع السايتوكينات التهابيه مثل كوكتيل O + T يسبب تدهور انسجه الغضروف مع مرور الوقت. المجمع الكلي لECM محدود بحجم الشرح وينبغي مراعاته عند تحليل الملف الحيوي. التالي ، بعد الزيادة الاوليه في إطلاق المؤشرات الحيوية ، قد تنخفض المستويات مع الوقت ببساطه بسبب انخفاض في الكمية المتبقية من المحتوي التوضيحي.

في السابق ، كان يعتبر الزراعة العضوية في المقام الأول مرضا من الغضروف المفصلي. ومع ذلك ، تشير الدراسات الاخيره إلى ان الزراعة العضوية ينبغي ان ينظر اليها علي انها مرض المفصل بأكمله ، حيث تحدث التغيرات المبكرة المتعلقة بالامراض في المقصورات المشتركة الفردية ، والعظم ، والغضروف ، بالتوازي ، وبمرور الوقت يؤدي إلى فشل المفاصل^{12 ،21}. ولذلك من المهم الاعتراف بان في هذا النظام النموذجي ، يتم عزل الغضروف من بقية المشترك (والكائن الحي) ، والحد من تاثير تاثيرات التفاعل الانسجه والعوامل الجهازية التي قد تنظم التوازن في الانسجه. بدلا من ذلك ، فمن ثقافة الانسجه واحده مبسطه حيث الظروف التي تسيطر عليها بالتجربة يمكن التضمين للكشف عن التغيرات المرضية أو التداخلية إلى الانسجه باستخدام التقنيات البيوكيميائية ، المؤشرات الحيوية ، أو التصور النسيجي. بسبب الهندسة المعمارية للغضروف ، ومن المتوقع الاختلاف في عدد الخلايا ، وتكوين المصفوفة ، والاختلاف في الكمية علي حد سواء بين الشرح وبين مصادر الانسجه. لان الحجم النسبي للإخراج الحيوية قد تكون مختلفه بين التجارب ، فمن المستحسن لتطبيع مجموعات البيانات للمقارنة أفضل.

لضمان اقل الاختلافات الممكنة وأفضل النتائج ، من المهم استخدام الغضروف من الركبتين التي هي طازجه قدر الإمكان ، ويفضل بين 1 و 24 ساعة بعد ذبح. وينبغي ان يتم عزل الانسجه الغضروف بطريقه متجانسة مع الشرح يجري تقريبا نفس سمك. وينبغي عزل المفسرين من مناطق الغضروف السميك ، وتجنب المناطق الأقرب إلى الوسط. يجب ان يكون النسيج دائما رطبه لتجنب موت الخلايا وتحلل المصفوفة. ويمكن تعديل طول التجربة³، والوقت بين التغيرات المتوسطة ، وتوقيت التحفيز السايسيسين ، وفواصل العلاج لتناسب وضع الافتراض للعمل من المركب أو اليه الفردية.

لجنه العلم والتكنولوجيا ، ACBJ و MK هم موظفو العلوم الحيوية الشمالية. ACBJ و MK يحمل أسهم في العلوم الحيوية الشمال. والمؤلفون الباقيون ليس لديهم ما يفصحون عنه.

ويشكر المؤلفون الموظفين الفنيين في العلوم البيولوجية الاسكندنافيه علي الدعم المختبري ، فضلا عن مؤسسه البحوث الدانمركية للدعم العام لأبحاثنا.