الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة

هنا يمكننا وصف بروتوكول للتحقيق في برينيليشن وجانسين-5 '-ثلاثي الفوسفات (غتب)-تحميل"جتباسي رو". يتألف هذا البروتوكول من أسلوبي مفصلة، إلا وهي وجود الغشاء والممتز GTPase مرتبطة الاعتداء. البروتوكول يمكن استخدامها لقياس برينيليشن وأنشئ تحميل مختلفة أخرى جتباسيس الصغيرة.

تنتمي إلى فوق عائلة رأس الأسرة GTPase رو ويضم حوالي 20 عضوا في البشر. جتباسيس رو هامة في تنظيم الوظائف الخلوية المتنوعة، بما في ذلك ديناميكية cytoskeletal، حركية الخلية، الخلية القطبية، التوجيه محواري والاتجار حويصلية ومراقبة دورة الخلية. التغييرات في إشارة "جتباسي رو" دوراً جوهريا تنظيمية في العديد من الحالات المرضية، مثل السرطان، وأمراض الجهاز العصبي المركزي، وتعتمد على نظام المناعة من الأمراض. تعديل بوستترانسلاشونال "جتباسيس رو" (أي، برينيليشن بوسيطة مسار mevalonate) وأنشئ الملزمة هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على تنشيط هذا البروتين. في هذه الورقة، يتم توفير طريقتين أساسية وبسيطة للكشف نطاق واسع من "جتباسي رو" برينيليشن وأنشئ ربط الأنشطة. شرح تفاصيل للإجراءات التقنية التي تم استخدامها خطوة بخطوة في هذه المخطوطة.

جتباسيس رو هي مجموعة من البروتينات الصغيرة (21-25 كاتشين)، التي هي المصانة جيدا في جميع أنحاء تطور، وتشكل من فصيلة فريدة من نوعها في فوق رأس عائلة من جتباسيس الصغيرة. في كل فصيلة داخل هذا فوق عائلة، هناك مجال ز مشتركة أساسية التي تشارك في نشاط GTPase و تبادل النوكليوتيدات¹. الفرق بين الأسرة رو وسوبفاميليس رأس الأخرى هو وجود "مجال إدراج رو" داخل حبلا β^ال 5 وفي^ال 4 α الحلزون في المجال GTPase صغيرة².

استناداً إلى التصنيف الأخير، تعتبر "جتباسيس رو" عائلة من إشارات البروتينات التي تناسب فوق عائلة جتباسي رأس³. وقد الثدييات "رو جتباسيس" 22 عضوا على أساس وظيفة معينة والتوصيف العام⁴ الذي روا و Rac1، و Cdc42 من بين دراسة معظم أعضاء في هذه المجموعة. جتباسيس رو ترتبط بداخل الخلايا مما يشير إلى الممرات عبر إليه محكم تنظيم الذي يعتمد على رموز تبديل الجزيئية عن طريق البروتين التعديلات بوستترانسلاشونال⁵.

أنشئ تحميل والتحلل المائي الآليات الأساسية في دورة تنشيط/إلغاء تنشيط الصغيرة "رو جتباسيس" وهي تنظم عن طريق جتباسي-تفعيل البروتينات (الثغرات). هي المسؤولة عن التحلل المائي أنشئ الفجوات والعمل يدا واحدة مع جوانين النوكليوتيدات تبادل العوامل (جيفس) هي المسؤولة عن رد الفعل أنشئ في التحميل. الناتج المحلي الإجمالي رو تفارق مثبطات (جديس) تقديم المزيد من تنظيم "جتباسيس رو" الصغيرة عن طريق الربط إلى "جتباسيس رو" ربط الناتج المحلي الإجمالي. وهذا يحول دون الانفصال من الناتج المحلي الإجمالي، ويسهل عزل من "جتباسيس رو" الصغيرة بعيداً عن المواقع غشاء داخل الخلية النشطة. كما يوجد كذلك تنظيم البروتينات GTPase رو التي تنطوي برينيليشن جديس الذي ينظم كل من النوكليوتيدات التحلل المائي والصرف وعناصر الناتج المحلي الإجمالي/غتب ركوب الدراجات^1،6،،من⁷⁸.

أنشئ في التحميل وبرينيليشن "جتباسي رو" تشارك في حركة "جتباسي رو" بين سيتوسول وأغشية الخلايا عن طريق تغيير الخصائص الفيزيائية لهذه البروتينات^1،9. الجهات التنظيمية المذكورة أعلاه التفاعل مع فوسفوليبيدات غشاء الخلية والبروتينات الأخرى تحوير ل نشاط تبادل غتب/الناتج المحلي الإجمالي¹⁰. وعلاوة على ذلك، كتلة جديس، مثبطات الانفصال، أنشئ التحلل المائي وتبادل غتب/الناتج المحلي الإجمالي. جديس تحول دون تفكك البروتينات رو غير النشطة من الناتج المحلي الإجمالي، ومن ثم تفاعلها مع المستجيبة المتلقين للمعلومات. كما تنظم جديس ركوب الدراجات من جتباسيس بين سيتوسول وغشاء في الخلية. نشاط "جتباسيس رو" يعتمد إلى حد كبير على حركتهم لغشاء الخلية؛ وهكذا، تعتبر جديس المنظمين الحرجة التي يمكن عزل جتباسيس في السيتوبلازم عن طريق الاختباء بها^11،مسعور المنطقة/المجالات¹².

ل GTPase رو أن يكون إشارات والدالة الأمثل في جميع مراحل دورة التنشيط، دورة الحيوي التحلل غتب-تحميل/غتب أمر حاسم. قد يؤدي إجراء تغييرات لاحقة في وظائف الخلية وينظم GTPase رو، مثل خلية قطبية، انتشار، morphogenesis، سيتوكينيسيس، والهجرة والالتصاق والبقاء على قيد الحياة^13،14أي نوع من التعديلات في هذه العملية.

وينص البروتوكول الحالي القراء بطريقة مفصلة لرصد صغيرة GTPase روا التنشيط عن طريق التحقيق في برينيليشن، والناتج المحلي الإجمالي/غتب تحميل. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للكشف عن برينيليشن وربط أنشئ مجموعة واسعة من جتباسيس الصغيرة. يمكن استخدام مقايسة الممتز مرتبطة جتباسي لقياس مستوى التنشيط لأنواع أخرى من جتباسيس، مثل Rac1، Rac2، Rac3، ح أو ك، أو رأس ن، والمنتدى الإقليمي للاسيان، ورو¹⁵. ويستخدم سيمفاستاتين وكيل الدوائية كمثال على ذلك، كما ذكر مؤخرا أن تشارك في تنظيم صغير "رو جتباسي" برينيليشن والنشاط^8،9،،من¹⁴¹⁶.

1-تحديد التعريب روا باستخدام تجزئة غشاء/سيتوسول

1. خلية العلاج الثقافة وسيمفاستاتين
   1. بذور 50,000 U251 الخلايا في 100 مم طبق والثقافة لهم في دولبيكو لتعديل المتوسطة النسر (دميم) (ارتفاع الجلوكوز، 10% مصل بقرى الجنين [FBS]).
   2. عندما روافد 30 ٪، علاج الخلايا عن طريق إزالة المتوسطة وإضافة المحتوية على سيمفاستاتين المتوسطة لأنها (10 ميكرون من سيمفاستاتين حله في ثنائي ميثيل سلفوكسيد [[دمس]])، واحتضان ح 36 في⁸من 37 درجة مئوية. استخدام [دمس] وحدها كعنصر تحكم سيارة.
      ملاحظة: تحتاج الخلايا 10 مليون لتجزئة سيتوسول وغشاء الخلايا.
2. مجموعة من الخلايا
   1. إزالة الخلايا من حاضنة 37 درجة مئوية. انظروا إلى الخلايا تحت مجهر للتأكد من كونفلوينسي.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا روافد 70% إلى 80%.
   2. نضح المتوسطة، وتغسل الخلايا 1 x مع المياه المالحة الباردة مخزنة الفوسفات (PBS). إضافة 5 مل من المخزن المؤقت لحمض (يدتا) الإيثيلين (بوكل: 400 مغ/لتر، كلوريد الصوديوم: 6800 مغ/لتر، NaHCO3: 2200 مغ/لتر، نة₂ص₄. H₂o: 140 مغ/لتر، د-الجلوكوز: ملغ 1,000، يدتا ثنائي: 373 مغ/لتر) كل لوحة ومكان الخلايا مرة أخرى إلى حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   3. وبعد 5 دقائق من الحضانة، جمع يدتا مع الخلايا في أنبوب 15 مل يحتوي على نفس الكمية من المتوسط يدتا.
      ملاحظة: وجود متوسطة في الأنبوب يحيد يدتا ويمنع أي هضم المزيد من أغشية الخلايا.
   4. ضع الأنبوبة في مربع جليد والمضي قدما الطرد المركزي.
   5. قم بإعداد أجهزة الطرد المركزي إلى س 1,500 ز في 4 درجات مئوية وتدور الخلايا لمدة 5 دقائق.
   6. إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. مزيج الخلايا أيضا.
   7. نقل الخليط خلية (الحل) إلى أنبوب 1.5 مل جديدة، أجهزة الطرد المركزي في س 1,500 ز في 4 درجات مئوية، وتدور الخلايا لمدة 5 دقائق.
   8. تحقق من حجم بيليه (لتقدير حجم المخزن المؤقت للخطوة التالية). وضع العينات في الثلج. تجاهل المادة طافية تماما دون إزعاج بيليه.
   9. إضافة المخزن المؤقت المثلج الأول (10 ملم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5] ومم 0.1 يدتا، 0.1 مم عطا، ديثيوثريتول 1 مم ومثبط البروتياز كوكتيل)، تخلط العينات جيدا من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وثم، انتقل إلى سونيكيشن.
3. سونيكيشن
   1. تعيين سونيكاتور لخمس دورات، 5 s كل، وتكرار x 3.
   2. تنفيذ في سونيكيشن على الجليد. الشروع أولتراسينتريفوجي.
      ملاحظة: الجليد والبرد شرط الحفاظ على البروتينات وجعل النتائج أكثر موثوقية.
4. تنبيذ فائق
   1. استخدام ultracentrifuge لفصل هوموجيناتيس الخلية إلى هيولى والغشاء الكسور. تعيين أجهزة الطرد المركزي إلى x 100,000 ز لمدة 35 دقيقة في 4 درجات مئوية. كما هو مبين في الشكل 1، تحقق من حجم بيليه.
      ملاحظة: كسر الغشاء الذي في الجزء السفلي من الأنبوب وبقية المكونات الأخرى هيولى.
   2. جمع المادة طافية تماما مع الحرص على عدم تعكير بيليه. المادة طافية هي جزء سيتوسوليك. ضع المادة طافية في أنبوب مسمى حديثا.
   3. إضافة 300 ميليلتر من تفكك المخزن المؤقت (المخزن المؤقت الثاني) (50 مم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5] 0.15 م كلوريد الصوديوم، ديثيوثريتول 1 مم، والحزب الديمقراطي الصربي 1%، 1 مم يدتا، 1 مم اجتا ومثبط البروتياز كوكتيل) لبيليه (يحتوي على كسر الغشاء). مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
   4. أن نشرع البروتين تصميم وإعداد نموذج لطخة غربية (تحليل immunoblot).
5. إيمونوبلوتينج
   1. إعداد البروتين خلية مقتطفات من الكسور المنفصلين عن ذويهم في تحلل المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5]، 0.5 مم بمسف، المنظفات غير الأيونية 0.5%-40، 100 ميكرومتر β-الجلسرين 3-الفوسفات، و 0.5% حوزتي المانع كوكتيل).
   2. قياس تركيز البروتين باستخدام أسلوب لوري⁸ وحساب حجم المخزن المؤقت تحلل (20 مم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5] 0.5 مم بمسف، والمنظفات نونديناتورينج 0.5%، أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول، 100 ميكرومتر β-الجلسرين 3-الفوسفات و 0.5% كوكتيل مثبط البروتياز) لتطبيع تركيز البروتين بين العينات.
   3. حرارة العينات عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتحميل 15-20 ميليلتر من العينات في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 15% لفصل البروتينات.
      ملاحظة: تحميل 1 ميكروغرام من البروتين لكل عينة. حساب وحدة التخزين التي تحتاج إلى تشغيل تبعاً لذلك.
   4. نقل البروتينات المنفصلين إلى أغشية النايلون تحت الحد من شروط (500 جليكاين شمال البحر الأبيض المتوسط و 50 مم تريس-HCl و 20% ميثانول) ح 2، في درجة حرارة الغرفة (RT) في 100 V.
      ملاحظة: للتأكد من نقل البروتين ناجحة، استخدم بونسو وصمة عار أو تصور علامة البروتين على الغشاء.
   5. كتلة الأغشية مع الحليب المجفف الخالي 5% و 1 x تريس مخزنة المالحة التي تحتوي على مواد التنظيف (TBS/0.01% المنظفات النطاق؛ تبسة) لمنع ربط جسم غير محدد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في الرايت لح 1.
   6. إضافة الأجسام المضادة الأولية لتحليل إيمونوبلوتينج واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: في هذه التجربة، Rac1/2/3، cdc42، روا، جابده، وعموم-كادهيرين قد استخدمت في إضعاف 1:1,000 في الحليب 1% في 1 x TBST. واستخدمت Pan-كادهيرين وجابده للتأكد من الغشاء ونقاء كسر سيتوسوليك، على التوالي.
   7. غسل الأغشية 3 x مع مخزن مؤقت غسيل مع 1 x TBST لمدة 20 دقيقة.
   8. احتضان الأغشية مع أرنب المضادة الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق جسم الثانوية للأجسام المضادة الأولية منها (من أجل 1 ح في RT).
   9. أغسل البقع 3 x لمدة 20 دقيقة وتطويرها مع الكشف عن تشيميلومينيسسينسي المحسنة (القامة).

2-قياس الحمولة غتب روا مقايسة صغير البروتين ز تنشيط باستخدام

1. 10,000 عدد خلايا/مل وثقافة الخلايا U251 في 100 مم، طبق.
2. عندما تكون روافد 30 ٪، علاج الخلايا مع سيمفاستاتين كما هو موضح في الخطوة 1.1.2.
3. إحضار لوحات الثقافة خارج الحاضنة. انظروا إلى الخلايا تحت المجهر للتأكد من كونفلوينسي. التأكد من أن الخلايا روافد 70% إلى 80%. وضع طبق بتري على الجليد، ونضح وسائط الإعلام، وتغسل الخلايا 3 x مع برنامج تلفزيوني المثلج (الرقم الهيدروجيني 7.2).
4. نضح في برنامج تلفزيوني. إمالة، طبق بيتري على الجليد لدقيقة إضافية لإزالة جميع مخلفات من برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: برنامج تلفزيوني المتبقية يؤثر سلبا على هذا التحليل.
5. الخلايا الموجودة في وحدة تخزين ميليلتر 700 تحلل المثلج المخزن المؤقت الذي يحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتيز.
   ملاحظة: ميليلتر 700 عادة ما يكفي ل 100 مم طبق بيتري. انظر الجدول 1 العثور على وحدة التخزين السليم لكل سفينة الثقافة.
6. حصاد الخلية ليستي مع مكشطة الخلية. انحدر لوحة الثقافة لهذا الأسلوب.
7. نقل إلى كريوتوبي المثلج مسمى وإبقائه على الجليد.
8. مزيج دقيق باستخدام دوامة. يبقى 10 ميليلتر من مقايسة البروتين، لقياس تركيز البروتين في العينة.
9. الأداة الإضافية-تجميد الخلية المتبقية في نيتروجين سائل.
   ملاحظة: تحضير مختبرين متعددة الخلية قبل تجميد المفاجئة لهم، لتجنب دورات متكررة تجميد/ذوبان الجليد الذي يمكن أن يؤدي إلى الخسائر في نشاط GTPase روا.
10. نقل كريوتوبيس مجمدة في الأداة الإضافية لثلاجة-80 درجة مئوية وتخزين العينات مقايسة الممتز مرتبطة جتباسي.
    ملاحظة: لا تقم بتخزين العينات لمدة تزيد على 14 يوما. العمل بسرعة، ولا تترك العينات في الثلج لمدة أطول من 10 دقائق. ابدأ بمعالجة جميع بيتري الأطباق في وقت واحد.
11. قياس تركيز البروتين باستخدام أسلوب لوري⁸ وحساب حجم المخزن المؤقت تحلل لتطبيع تركيز البروتين بين العينات.
    ملاحظة: أن تركيز أفضل عادة 1 ملغ/مل؛ ومع ذلك، 0.3-2 مغ/مل يمكن أن تكون قابلة للكشف.
12. إعداد عنصر تحكم فارغ بإضافة 60 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل و 60 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم microtube.
    ملاحظة: عنصر تحكم فارغ الكواشف كافة باستثناء antigen ويستخدم للطرح للخلفية.
13. إعداد عنصر تحكم إيجابية بإضافة 12 ميليلتر من البروتين التحكم رو وميليلتر 48 من المخزن المؤقت لتحلل 60 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم.
    ملاحظة: قد مراقبة إيجابية جميع الكواشف بالإضافة إلى مستضد مؤكدة رو-A-أنشئ.
14. إخراج لوحة تقارب رو في الحقيبة ووضعه على الجليد.
15. يحل المسحوق في الآبار مع 100 ميليلتر من الماء المقطر المثلج. تبقى لوحة على الجليد.
16. ذوبان الجليد ليساتيس خلية مجمدة في الأداة الإضافية في حمام مائي بتعيين إلى 25 درجة مئوية.
17. إضافة حجم المخزن المؤقت تحلل المثلج (من الخطوة 2.11) لكل عينة لتطبيع تركيز البروتين المحسوبة.
    ملاحظة: إزالة برنامج تلفزيوني بعد غسل الخلايا (باستخدام المضخة فراغ أنبوب) تجنب أحداث تغييرات في تكوين المخزن المؤقت تحلل. معادلة البروتين عينة إلى تركيز بين 0.8 و 2 ملغ/مل لإجراء مقارنة دقيقة بين العينات في فحوصات التنشيط جتباسي. ويقدم الجدول 2 تفاصيل حول المخزن المؤقت لاستخدامها لهذا التحليل.
18. نقل 60 ميليلتر من عينات الجليد تطبيع إلى microtubes وإضافة 60 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت؛ تخلط العينات جيدا وإبقائها على الجليد.
19. تماما إزالة المياه/الحلول من الميكروسكوبية التي يسددها قوية، تليها خمسة إلى سبعة صنابير الثابت على حصيرة مختبر.
20. إضافة 50 ميليلتر من العينات التي تم تسويتها وعنصر تحكم فارغ، وعنصر إيجابي للآبار في التكرارات.
21. وضع اللوحة على شاكر مدارية لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية 300 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: الخطوة تهز مهم جداً، ومن المستحسن استخدام شاكر لوحة مدارية 300 لفة في الدقيقة.
22. مسح العينات المأخوذة من اللوحة بالتحريك وغسلها x 2 مع 200 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت في "الرايت قوة" إزالة المخزن المؤقت الغسيل من الآبار بعد كل غسل بالتحريك، متبوعاً بالتنصت، والاحتفاظ اللوحة على مقاعد البدلاء في الرايت
23. إضافة 200 ميليلتر RT مستضد-عرض المخزن المؤقت لكل بئر واحتضان في RT لمدة 2 دقيقة.
24. نفض الغبار على الحل من الآبار وغسل الآبار 3 x مع 200 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت في الرايت
25. إضافة 50 ميليلتر من طازجة 1/250 روا مكافحة جسم الأولية لكل بئر.
26. وضع اللوحة على شاكر مدارية لمدة 45 دقيقة 300 لفة في الدقيقة بتعيين إلى 25 درجة مئوية. نفض الغبار على الحل من البئر.
27. كرر الخطوات الغسيل 2 x (الخطوة 2، 24).
28. إضافة 50 ميليلتر من طازجة 1/250 روا مكافحة الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر.
29. وضع اللوحة على رأس شاكر مدارية لمدة 45 دقيقة 300 لفة في الدقيقة بتعيين إلى 25 درجة مئوية.
30. تحضير الكاشف الكشف عن برنامج الصحة الإنجابية عن طريق خلط كميات متساوية من كاشف أ وكاشف باء
31. نفض الغبار حل من كل بئر وغسل الآبار 3 x مع 200 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت في الرايت
32. إضافة 50 ميليلتر من الطازجة كاشف الكشف عن برنامج الصحة الإنجابية لكل بئر.
33. قراءة إشارة الإنارة داخل 3-5 دقائق الحصول على إشارة الحد الأقصى، وتحليل النتائج باستخدام حزمة برامج مناسبة.
    ملاحظة: يجب اتخاذ القراءات خلال 3-5 دقائق للحصول على إشارة الحد الأقصى. تشغيل "لوحة اختبار" للتأكد من تحلل السليم حجم المخزن المؤقت يستخدم ليساتيس الخلية حيث يكون تركيز البروتين مرتفعة بما يكفي للكشف عن نشاط GTPase روا. (لوحة اختبار صفيحة خلايا المستخدمة لتحديد إذا كان تركيز البروتين يقع ضمن النطاق المقبول، وأيضا تحديد ما إذا كان حجم المخزن المؤقت تحلل المستخدمة ملائمة). مراقبة إيجابية ينبغي قراءة 4 إلى 10 إضعاف أعلى من الآبار فارغة إذا كان ذلك في نطاق خطي. إذا لم يكن كذلك، ثم ضبط لومينوميتير باستشارة الشركة المصنعة. إعدادات لومينوميتير ترد في الجدول 3.
34. قم بإدخال البيانات الخام في أعمدة حيث قراءة العناوين عينة، يعني، الانحراف المعياري، rep1، rep2، rep3و rep4، لإظهار عدد replicates يجري القيام به في كل عينة.
35. تحت يعني، أدخل الصيغة =average(Xn:Yn) حيث X = مصمم العمود ل rep1، ص = مصمم العمود ل rep4، و n = مصمم الصف صف يجري العمل على.
36. تحت الانحراف المعياري، أدخل الصيغة = stdev (Xn:Yn) حيث X = مصمم العمود ل rep1، ص = مصمم العمود ل rep4، و n = مصمم الصف صف يجري العمل على.
37. إدخال البيانات نسخ متماثل في rep1، rep2، و ما إلى ذلك
38. بعد إدخال البيانات، استخدم الأسلوب انقر واسحب لتحديد العينة، يعني، و الانحراف المعياري.
39. ثم، في برامج تحليل البيانات، حدد الدالة لصنع الذي يبدو وكأنه ساحة مع مخطط شريطي صغير داخل المخطط.
    ملاحظة: هذا إحضار مخطط عملية صنع القرار حيث أنه من الممكن لتصميم الرسوم البيانية استناداً إلى البيانات التي تم إدخالها.
40. اختر تخطيط العمود ، وقيم الإدخال، تعيين أرقام يعني .
    ملاحظة: يتم التخطيط لأرقام يعني للمرة الأولى ومن ثم، يتم تعيين العمود الانحراف المعياري لأشرطة الخطأ المحور ص. للقيام بهذا، انقر نقراً مزدوجاً فوق الرسم البياني الحانات وحدد علامة التبويب المحور الصادي الخطأ ، انقر فوق الخيار مخصص وتحديد المنطقة في ورقة العمل لإدخال موقع البيانات الانحراف المعياري . ويمكن رؤية الفرق بين المجموعات التي تحتاج إلى أن تكون المقارنة بعد إنشاء المخططات المطلوبة.

غشاء تجزئة:

واستخدمت لتجزئة مكونات الغشاء وسيتوسول تنبيذ فائق. كما هو مبين في الشكل 1، المادة طافية على الكسر سيتوسوليك وبيليه تحتوي على غشاء الكسر. تم بحث وفرة روا في الكسور أندميمبراني سيتوسوليك التي تم الحصول عليها من الخلايا U251 بعد العلاج مع سيمفاستاتين باستخدام إيمونوبلوتينج. النقاء وتحميل عنصر تحكم كسر الغشاء وسيتوسول تأكدت بعموم-كادهيرين وجابده على التوالي. علاج سيمفاستاتين كما هو مبين في الشكل 2، خفضت مبلغ GTPase روا غشاء زمنياً، في حين أنها زادت محتواها سيتوسوليك. وهذا يتسق مع آثار المعروفة statins على نقل جسد جتباسيس استناداً إلى تثبيط برينيليشن روا. سيمفاستاتين يمنع برينيليشن من جتباسي روا، وبالتالي، أونبرينيلاتيد روا غير قادر على الربط في أغشية الخلايا البلازما، مما يسفر عن تركيزات أعلى سيتوسوليك.

أنشئ روا منضم:

ونحن قياس البروتين روا غتب زمنياً باستخدام مقايسة الممتز GTPase مرتبطة وأظهرت أن سيمفاستاتين إلى حد كبير (ف < 0.05) زادت روا غتب زمنياً في الخلايا U251 (الشكل 3). ولذلك، بينما أعاقت سيمفاستاتين GTPase روا البروتين برينيليشن (الشكل 2)، كما زادت أنشئ لها تحميل بالمقارنة مع الخلايا التحكم. وهذا يشير إلى حقيقة أن برينيليشن وأنشئ ملزمة سواء تلعب دوراً في النشاط وتنظيم GTPase روا. للحصول على تفاصيل إضافية بشأن هذه الظاهرة، يرجى الرجوع إلى المنشور الأصلي باستخدام هذا البروتوكول⁸.

الشكل 1 : عرض التخطيطي للكسور سيتوسوليك والغشاء بعد تنبيذ فائق. بيليه على الكسر الغشاء وتحتوي المادة طافية على الكسر سيتوسوليك.

الشكل 2 : سيمفاستاتين التغييرات إضفاء الطابع المحلي على روا. U251 الخلايا تعامل مع سيمفاستاتين (10 ميكرومتر؛ 12 و 24 و 36 ح) وتحدده وفرة روا في الغشاء والكسور سيتوسوليك إيمونوبلوتينج. وقيمت وفرة جابده وعموم-كادهيرين أيضا إلى مراقبة للتحميل في الكسور سيتوسوليك والغشاء و للتأكد من عدم وجود تلوث سيتوسوليك في الكسور الغشاء. عادة ما تكون البيانات من ثلاث تجارب مستقلة باستخدام مختلف الثقافات الأولية. وقد تم تعديل هذا الرقم من زاده et al. ⁸- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : سيمفاستاتين ينظم نشاط GTPase روا. مقايسة الممتز مرتبطة جتباسي استخدمت لقياس البروتين رو غتب زمنياً في الخلايا U251. تم اختبار ظروف مختلفة عن ح 36، بما في ذلك الجوع وسيمفاستاتين (10 ميكرون). لكل تجربة، استخدمت بروتين روا active مؤثرا في عدة كعنصر إيجابي. يتم التعبير عن النتائج ك ± يعني SD من replicates اثنين في التجارب المستقلة (* ف < 0.001). وقد تم تعديل هذا الرقم من زاده et al. ⁸. 

الجدول 1: وأوصى حجم المخزن المؤقت لتحلل للخلايا U251- الحجم قابل للتعديل لأنواع مختلفة من الخلايا.

الجدول 2: مرتبطة بقائمة GTPase الممتز الاعتداء تحلل المخازن المؤقتة، وأوصى بتكوين تحلل جتباسيس الصغيرة-

الجدول 3: وصف تفصيلي لإعدادات luminometer.

هنا يصف لنا طريقة دقيقة لقياس صغيرة جتباسي برينيليشن وأنشئ ملزمة كما هو موضح الصغيرة جتباسي سوبسيلولار التعريب (غشاء مقابل سيتوسول) و "أنشئ رو" تحميل. جتباسيس الصغيرة التي أعرب عنها في الخلايا حقيقية النواة، وتلعب دوراً أساسيا في انتشار الهاتف الخلوي، وحركية، وهيكل. برينيليشن وربط غتب تشارك في تنظيم نشاط GTPase؛ ولذلك، فحوصات لتقييم برينيليشن وأنشئ ملزمة لهذه البروتينات أدوات هامة للخلية علماء الأحياء^1،8.

استناداً إلى نتائج دراسة أجريت مؤخرا، أنشئ البروتين رو تحميل خلية من نوع معين⁸، وذلك، يختلف بين أنواع مختلفة من الخلايا. أيضا، يتم الترجمة سوبسيلولار وجيرانيلجيرانيليشن (GGT) من البروتينات رو الخطوات المحددة في التنظيم لوظيفتها. وينظم هذا أيضا زيادة تفاعل البروتينات المستجيب مرفق البيئة العالمية، والفجوة، و GDI جتباسيس الرئيسية.

ومن المعروف سيمفاستاتين لزيادة تحميل "غتب راك" في وحيدات THP-1 وإنقاص برينيليشن راك حضور التحفيز بيتا اميلويد، وتقليل الردود الملتهبة من هذه الخلايا¹⁷. ونعلم أيضا أن لا يتأثر الدالة T-cell "غتب رو" تحميل، لكن بدلاً من ذلك، يحدد GGT رو الدالة^18،19. ولذلك، نوصي بأن، بغية الكشف عن نشاط GTPase رو، برينيليشن وتحميل غتب يجب في نفس الوقت يقاس في الخلايا.

الملاحظة، لتحقيق عالية النقاء سيتوسوليك والكسور الغشاء، هي أهم الخطوات للبروتوكول سونيكيشن وتنبيذ فائق. للمقايسة "غتب رو"-ملزمة، أن الخطوة الأكثر أهمية هو الأداة الإضافية-تجميد ليساتيس الخلية قبل معالجة متسلسلة. بعد هذه الخطوات الهامة سوف ينتج نتائج متسقة واستنساخه في دراسة جتباسيس في نظم المعيشة.

خطوة أساسية لدراسة بروتين داخل الخلايا هيكل أو غشاء خاص هو الفصل بين المكونات الخلوية من بعضها البعض. تجزئة يستفيد من الخصائص لكل حجرة الخلوية، مثل الحجم والشكل والسطح مقابل كثافة وكثافة الطفو²⁰. يستند أساسا إلى استخدام الطرد المركزي التفاضلية في وسائل الإعلام للزوجة عالية في 4 درجات مئوية. طريقة تجزئة الأغشية التي استخدمت هنا يستند أساسا على حجم كل حجرة وعالية السرعة الجاذبية فيها، بعد تنبيذ فائق، بروتينات الغشاء انتقل إلى الجزء السفلي من الأنبوب والبروتينات سيتوسوليك البقاء في المادة طافية.

من المهم أن نلاحظ أن العينات التي تحتوي على تركيزات عالية من البروتين، وربما، يحتمل أن تكون على مستويات عالية من ثغرات يمكن إلغاء تنشيط الهدف جتباسي. يمكن أن يحدث حتى في المخزن المؤقت لتحلل هذه المسألة وقد تؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة. إحدى المعلمات الرئيسية التي تحدد نجاح وإمكانية تكرار نتائج نشاط GTPase مقايسة النتائج هو الصحة واستجابة الخلايا المستخدمة في التجربة⁸. من المستحسن بشدة أن المحققين تحديد ظروف النمو المثلى/المناسبة والوقت مضاعفة للخلايا قيد الدراسة لتحديد التنشيط/تثبيط جتباسي. بالإضافة إلى ذلك، أحكام تنظم نشاط GTPase جميع جتباسيس الصغيرة وهي لذلك، عرضه لسرعة النقصان عن طريق التحلل من جزيء غتب منضمة إلى الإنزيم عن طريق عمل الثغرات (أثناء وبعد الإجراء تحلل الخلية ). نتائج هذا العمل في المنظمة السريع من جتباسي للفائدة. ولذلك، فمن المستحسن أن تحلل الخلية تتم سريعاً عند 4 درجة مئوية، لتحقيق نتائج دقيقة واستنساخه.

وهناك عوامل عدة تبعاً للظروف التجريبية التي تحدد الخلية النهائية ليستي. أولاً، المبلغ الإجمالي ل GTPase روا في خط الخلية أو أنسجة محددة: مقدار الذاتية روا GTPase هو المتغير في أنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة؛ ولذلك، يمكن أن ينتج استجابة أقوى للمنشط أو ديكتيفاتور. الثانية، وكمية التنشيط/التعطيل تحقيقه في الظروف التجريبية: من المهم أن تنظر في أن حوالي 2% إلى 10% جتباسي الصغيرة الخلوية مجموع ربما يتم تنشيط استجابة ل حافز معين⁸. كمية التعطيل أيضا إلا يعتمد على نوع المحفزات ومتغير في مختلف الخلايا والأنسجة. ولذلك، لكل نوع من المقايسة نشاط GTPase رو الصغيرة، تكوين حجرة المخزن المؤقت والخلوية تحلل أمر حاسم. ويبين الجدول 3 التكوين الموصى به تحلل المخزن المؤقت لكل بروتين GTPase صغيرة محددة.

تركيز البروتين ليستي خلية طبيعية شرط رئيسي لأنها تمكن المحققون مقارنة نشاط GTPase عينات مختلفة. ولذلك، غسل الخلايا من جميع العينات في جميع الأحوال مع برنامج تلفزيوني الباردة إلزامي لإزالة البروتين من وسائط زراعة الأنسجة. من الضروري أيضا أن تستخدم جميع الكواشف والمخازن المؤقتة في درجات حرارة باردة (4 درجة مئوية) في جميع مراحل التجربة. سيتم تصغير هذا درجة الحرارة الباردة أن التحلل جتباسيس، بما في ذلك "جتباسي رو"، أثناء إعداد عينة. من الأهمية بمكان أن تتم هذه المعالجة من ليساتيس خلية سريعاً (في 10-15 دقيقة في المجموع) تفاديا لفقدان نشاط GTPase روا. وعلاوة على ذلك، أهم خطوة لإعداد ليستي الخلية الإضافية-تجميد مختبرين لفي النتروجين السائل للحفاظ على النشاط الأنزيمي روا جتباسي الصغيرة. وهذا مهم بشكل خاص إذا كان هناك تيميبوينتس مختلفة أو عينات متعددة في التجربة. بعد إعداد ليساتيس مجمدة في الأداة الإضافية، يمكن الاحتفاظ بالعينات في-80 درجة مئوية دون أن تفقد نشاطها GTPase رو.

البروتوكول المتوفرة لتحليل رسو غشاء من جتباسي روا يمثل فقط أداة غير مباشرة لقياس برينيليشن جتباسيس الصغيرة، وليس قادراً على الكشف عن مباشرة أو التحديد الكمي لربط بقايا isoprenoid للبروتين الهدف. هذا واحد من قيود قليلة جداً من هذا التحليل. ولذلك، أنه يعطي تقديراً برينيليشن البروتينات. وقد حددت بعض النهج التي تكون قادرة على مباشرة قياس متر (فارنيسيليشن) و/أو الكبد ترانسفيراز farnesyl و/أو جيرانيلجيرانيل ترانسفيراز، على التوالي، على حد سواء في الخلايا المستزرعة والحيوانات وأورام المستمدة من الإنسان. فحوصات استخدام التحول التنقل الغرواني الكهربي diphosphate farnesyl [ح 3] و [ح 3] geranylgeranyl diphosphate وحامض mevalonic [ح 3] وضع العلامات، وتليها إيمونوبريسيبيتيشن والحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة²¹.

قمنا باستخدام مقايسة الممتز GTPase روا مرتبطة للكشف عن أي غشاء وترسيخ نشاط GTPase روا. وهو يتألف من البروتين رو-غتب-الربط الذي يرتبط بابار صفيحة 96-جيدا. لذا، رو غتب زمنياً النشطة في ليساتيس الخلايا أو الأنسجة يربط الآبار، بينما الناتج المحلي الإجمالي زمنياً غير نشط رو جرفت خلال خطوات الغسيل. ثم، سيتم اكتشاف روا المنضم، ونشط في الآبار استخدام جسم روا على حدة وتشيميلومينيسسينسي. فمن الممكن لتحديد درجة التنشيط روا بمقارنة قراءات من الخلية المنشط إلى نوناكتيفاتيد ليساتيس. عادة ما تستخدم التجويع المصل (استخدام المتوسط خالية من المصل في الخلايا المستزرعة) لإلغاء تنشيط روا في زراعة الأنسجة. كما تجدر الإشارة إلى أن نطاق مقايسة الممتز مرتبطة جتباسي للتنشيط يتطلب 10-50 ميكروغرام من البروتين للكشف عن نشاط GTPase روا.

من المستحسن بشدة أن العينات غير المعالجة قد تدني مستويات الخلوية القاعدية لنشاط GTPase (حالة عنصر التحكم). كمثال على ذلك، شروط نشاط GTPase downregulate يمكن تجويع الخلية الصحيحة وتوفر ظروفا مثالية لإظهار من التفعيل تحت ظروف تجريبية. أيضا، يتم تنفيذ فحوصات تنشيط وتثبيط في طريقة استجابة وقت وجرعة للحصول على استجابات تنشيط/تثبيط GTPase أفضل. الأهم من ذلك، أثناء إعداد الهاتف الخلوي، من المهم جداً استخدام الخلايا التي لا أوفيركونفلوينت (> 70%)، وتجنب أي نونريسبونسيفينيس من الخلايا لتنشيط/تثبيط المحفزات.

لومينوميتيرس تختلف اختلافاً كبيرا من حيث الحساسية والقراءات المطلقة. ولذلك، من أجل تحديد أنها في النطاق الخطي، نقترح تشغيل مقايسة الممتز GTPase مرتبطة مع فارغة وعنصر إيجابي. إذا كان الفحص الخروج من النطاق الخطي (يجب أن يكون عنصر التحكم الإيجابي 4 x-x 10 أعلى من قراءة المخزن المؤقت فقط) أو في القراءة فارغة أعلى من 9 مليون، ثم ينصح باستخدام المزيد من تخفيف جسم. وعلاوة على ذلك، نوصي بشدة معايرة luminometer قراءة داخل نطاق الفحص قبل البدء التحليل الخطي.

وهناك أيضا مزايا مقايسة الممتز مرتبط جتباسي التي تستحق الذكر. تحسين التصميم التجريبي الحالي فحوصات مرتبطة GTPase الممتز وتمكين التكنولوجيا تيسيرا للتجارب التي لم تكن ممكنة مع تقنيات سحب هبوطاً القديمة²². توفير فحوصات الممتز GTPase مرتبطة أيضا الكشف عن دقة وحساسية التي تسمح تحليلات نشاط GTPase في الأعمال التحضيرية سابقا ممنوعة على فحوصات المنسدلة²³. اثنين من الدراسات الحديثة مقارنة فحوصات التنشيط الممتز GTPase مرتبطة مع سحب هبوطاً وخلصت إلى أن مقايسة الممتز GTPase مرتبطة ببعض مزايا واضحة، هما أن فحوصات مرتبطة GTPase الممتز أعلى نظراً لما القدرة على استخدام كميات صغيرة من البروتين^22،24، حساسية أكبر²⁴، وهذه القياسات الكمية²³. طقم مقايسة الممتز مرتبطة جتباسي متوفر في لومينوميتريك أو الإصدارات الكشف اللونية، حيث فحوصات لومينوميتريك أكثر حساسية. هذا الإنزيم المرتبط ارتباطاً GTPase يستند إلى بروتوكول بدلاً من ذلك بسيطة وسريعة ويتطلب كميات صغيرة فقط من عينة وتعطي نتائج دقيقة والكمية. ولذلك، قد يكون فكرة جيدة لمواصلة تطوير هذا الفحص للكشف عن أنواع أخرى من البروتينات على أساس جتباسي في خطوط مختلفة من الخلايا والخلايا زراعة الأنسجة بأعلى بكثير من التحديد والدقة.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وأيد غافامي سعيد "الصحة العلوم مركز التشغيل منحة"، كريم العاملة بمنحه و "البحوث مانيتوبا المحقق الجديد يعمل بمنحه". وأيد على زاده جواد سنهم مانيتوبا البحوث. شجاعي شهلا تدعمها منحة "تعمل مؤسسة العلوم الصحية" و "تسريع ميتكس" زمالة ما بعد الدكتوراه. وأيد عادل رضائي موغادام الأموال العاملة المنح التي عقدت قبل جوزيف جورج غوردون. وأيد أمير أ زكي على جائزة K08 المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI (1K08HL114882-01A1). ماريك جيه لوس يرجى تعترف بالدعم من منحة نكن #2016/21/ب/NZ1/02812، تدعمها LE ستوديوم معهد الدراسات المتقدمة (منطقة المركز-فال دو لوار، فرنسا) من خلال "برنامج العام وادي اللوار الذكية" ويشترك في تمويله ماري إجراءات سكلودوفسكا كوري، منح #665790. وأيد أومجف سنهم سيموني دا روسا سيلفا.