JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا طريقة تجريبية لاختبار دور البلازميدات multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية.

Abstract

والبلازميدات multicopy وفيرة جداً في بدائيات النوى ولكن دورها في تطور البكتيريا ما زالت غير مفهومة. ونحن مؤخرا أظهرت أن الزيادة في عدد نسخ الجينات كل خلية يقدمها والبلازميدات multicopy يمكن أن تسرع تطور الجينات المرمزة بلازميد. في هذا العمل، نحن نقدم نظام تجريبي لاختبار قدرة والبلازميدات multicopy لتعزيز التطور الجيني. باستخدام أساليب بسيطة في مجال البيولوجيا الجزيئية، نحن تشييد نظام نموذج حيث يمكن إدراجها جينات مقاومة للمضادات الحيوية في MG1655 الإشريكيّة القولونية ، في الكروموسوم أو في بلازميد multicopy. نحن نستخدم نهج تجريبي تطور لتنتشر سلالات مختلفة تحت التركيزات المتزايدة للمضادات الحيوية ونقيس بقاء السكان البكتيرية على مر الزمن. يتم اختيار الجزيء المضادات الحيوية والجينات المقاومة حيث أن الجينات يمكن أن يمنح فقط المقاومة من خلال الحصول على الطفرات. ويوفر هذا النهج "الإنقاذ تطورية" طريقة بسيطة لاختبار إمكانات والبلازميدات multicopy لتعزيز اكتساب المقاومة للمضادات الحيوية. في الخطوة التالية للنظام التجريبي، تتسم الأسس الجزيئية للمقاومة للمضادات الحيوية. تحديد الطفرات مسؤولة عن الحصول على مقاومة المضادات الحيوية نستخدم العميق تسلسل الحمض النووي للعينات التي تم الحصول عليها من شعوب بأكملها والحيوانات المستنسخة. أخيرا، لتأكيد دور الطفرات في الجينات قيد الدراسة، إعادة بناء عليها في الخلفية الأبوية واختبار النمط الظاهري مقاومة للضغوط الناجمة عن ذلك.

Introduction

المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا هي مشكلة صحية رئيسية1. على مستوى أساسي، انتشار المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا المسببة للأمراض مثال بسيط للتطور بالانتقاء الطبيعي2،3. ببساطة، استخدام المضادات الحيوية يولد التحديد لسلالات مقاومة. ولذلك، هو مشكلة رئيسية في علم الأحياء التطوري، لفهم العوامل التي تؤثر على قدرة سكان الجرثومي تتطور المقاومة للمضادات الحيوية. انتقاء التجارب قد برزت بوصفها أداة قوية جداً للتحقيق في علم الأحياء التطوري من البكتيريا، وقد أنتج هذا الحقل رؤى لا يصدق في طائفة واسعة من المشاكل التطورية4،،من56. في تطور تجريبية، باساجيد البكتيرية السكان بدأ من سلالة واحدة أبوية هي متسلسل تحت ظروف محددة وأحكام الرقابة. بعض الطفرات التي تحدث خلال نمو هذه الثقافات زيادة اللياقة البدنية البكتيرية، وهذه تنتشر عبر الثقافات بالانتقاء الطبيعي. أثناء التجربة، تصان دورياً جثمان عينات السكان لإنشاء سجل الأحفوري مجمدة غير المتطورة. يمكن استخدام عدد كبير من النهج لتميز تطور السكان البكتيرية، ولكن هاتين الطريقتين الأكثر شيوعاً هي فحوصات اللياقة البدنية، التي تقيس قدرة البكتيريا تطورت للتنافس ضد أسلاف بعيدة، وتسلسل الجينوم الكامل، الذي يستخدم لتحديد التغييرات الوراثية أن التكيف مع محرك الأقراص. في أعقاب العمل الرائد ريتشارد لينسكي والزملاء7،8، كان النهج الموحدة في تطور تجريبية للطعن في عدد قليل نسبيا من السكان نسخ متماثل (عادة < 10) مع تكييف جديد التحدي البيئي، مثل مصادر الكربون الجديدة، ودرجة الحرارة، أو بالعاثية المفترسة.

الالتهابات التي تسببها البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية يصبح مشكلة كبيرة عندما تكون المقاومة عالية بما يكفي أن من غير الممكن لزيادة تركيزات المضادات الحيوية إلى مستويات قاتلة في أنسجة المريض. الأطباء لذلك مهتمون بما يسمح للبكتيريا تتطور المقاومة لجرعات عالية من المضادات الحيوية التي فوق هذا تركيز المضادات الحيوية العتبة، توقف السريرية. كيفية دراسة هذا تجريبيا؟ إذا كان عدد صغير من السكان البكتيرية وتحدي مع جرعة عالية من المضادات الحيوية، كما هو الحال في نمط لينسكي التجربة، ثم النتيجة الأكثر ترجيحاً أن المضادات الحيوية سوف تدفع جميع السكان لخطر الانقراض. في الوقت نفسه، إذا كانت الجرعة من المضادات الحيوية المستخدمة منخفضة، دون تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) السلالة الأبوية، ثم أنها من غير المرجح أن سكان الجرثومي ستتطور المستويات ذات الصلة سريرياً للمقاومة، خاصة إذا كان وتقوم المقاومة بتكلفة كبيرة. واحد وسط بين هذين السيناريوهين استخدام "إنقاذ تطورية" تجربة9،10،11. وفي هذا النهج، عدد كبير جداً من الثقافات (عادة > 40) هو تحدي مع جرعة من المضادات الحيوية التي تزيد مع مرور الوقت، عادة بمضاعفة تركيز المضادات الحيوية كل يوم12. السمة المميزة لهذه التجربة هو أن أي مجموعة من السكان التي لا تتطور المقاومة المتزايدة سوف تكون مدفوعة إلى الانقراض. معظم السكان وتحدي بهذه الطريقة سوف تكون مدفوعة منقرضة، ولكن سوف تستمر أقلية صغيرة من تطور مستويات عالية من المقاومة. في هذه الورقة، ونظهر كيف يمكن استخدام هذا التصميم التجريبي للتحقيق بلازميد multicopy مساهمة التطور المقاومة.

اكتساب البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من خلال اثنين من الطرق الرئيسية، والطفرات الصبغية، والحصول على عناصر وراثية متحركة، معظمها والبلازميدات13. والبلازميدات دوراً رئيسيا في تطور المقاومة للمضادات الحيوية لأنها قادرة على نقل الجينات المقاومة بين البكتيريا بتصريف14،15. والبلازميدات يمكن تقسيمها إلى مجموعتين وفقا لحجمها وعلم الأحياء: "الصغيرة"، مع عدد نسخ عالية في الخلايا البكتيرية و '' الكبيرة ''، مع انخفاض نسخ رقم16،17. وتم توثيق دور البلازميدات كبيرة في تطور المقاومة للمضادات الحيوية على نطاق واسع لأنها تشمل والبلازميدات كونجوجاتيفي، وهي العوامل الرئيسية الدافعة لنشر المقاومة والمقاومة متعددة بين البكتيريا15. والبلازميدات multicopy الصغيرة أيضا شائعة جداً في البكتيريا،من1718، وأنهم كثيرا ما رمز ل جينات مقاومة المضادات الحيوية19. ومع ذلك، درست دور البلازميدات multicopy الصغيرة في تطور المقاومة للمضادات الحيوية بدرجة أقل.

في عمل مؤخرا، اقترحنا أن والبلازميدات multicopy يمكن أن تسرع تطور الجينات يقومون بزيادة معدلات تحور الجينات بسبب ارتفاع عدد نسخ المورثات كل خلية12. باستخدام نموذج تجريبي مع سلالة كولاي MG1655 وجين β-lactamase بلوختيم-1 فإنه يظهر أن والبلازميدات multicopy تسارع معدل ظهور الطفرات تيم-1 تمنح المقاومة للجيل الثالث سيفالوسبورين ceftazidime. وأشارت هذه النتائج إلى أن البلازميدات multicopy قد تلعب دوراً مهما في تطور المقاومة للمضادات الحيوية.

هنا، فإننا نقدم وصفاً مفصلاً للأسلوب الذي قمنا بتطوير التحقيق في تطور بلازميد بوساطة multicopy مقاومة المضادات الحيوية. هذا الأسلوب له ثلاث خطوات مختلفة: الأولى، الإدراج من الجينات قيد الدراسة في بلازميد multicopy أو كروموسوم البكتيريا المضيفة. ثانيا، استخدام التطور التجريبي (التطوري الإنقاذ) لتقييم إمكانيات سلالات مختلفة للتكيف مع الضغط الانتقائي. والثالثة، وتحديد أسس الجزيئية الكامنة وراء تطور بلازميد بوساطة استخدام الحمض النووي تسلسلها وتعمير الطفرات المشتبه فيهم على حدة في النمط الوراثي الأبوية.

وأخيراً، على الرغم من أن تم تصميم البروتوكول هو موضح هنا للتحقيق في تطور المقاومة للمضادات الحيوية، يمكن القول أن هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة بصورة عامة لتحليل تطور الابتكارات التي اكتسبها الطفرات في أي multicopy ترميز بلازميد الجينات.

Protocol

1-تشييد النظام التجريبي ترميز الجينات المقاومة للمضادات الحيوية

ملاحظة: هنا استخدمت MG1655 كولاي السلالة المستفيدة من بلازميد أو كروموسوم ترميز الجينات المقاومة للمضادات الحيوية. يتم ترميز الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في الكروموسوم أو بلازميد multicopy في عبئا اسوي خلاف ذلك (الشكل 1).

  1. إدراج الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في λ بالعاثية التكامل الموقع (أتتب)20 من الكروموسوم MG1655.
    1. تضخيم المناطق bp طوله 500 في كلا الجانبين من الموقع الصبغية attB PCR. استخدام النوكليوتيد و يبهك (5 '-ككتجتاككجتاكاجاجتات-3') وأتتب-R (5 '-جكككجككاكككتككججككجتاتاااااجكاجكتكا-3') للمنطقة اليسرى التماثل وأتتب-و (-أجكجكككتاجكجكككجكتككتاتاكتاكتجاجكجاا 5 '-3') ويبهب/R (5 '- TGGCGATAATATTTCACCGC-3 ') للحق واحد. تضخيم الجينات المقاومةتيم-1 بلوخاستخدام كبسولة تفجير Tem1-بباد-F (-تجاجككتجكتتتتتاتاككجكككجاججتجكججك 5 '-3') و Tem1-بباد-R (5 '-تتكجكتكاجتاجتاتاجاجكججكجكتاججكجكت-3'). تصميم كبسولة تفجير مع ما يقرب من 20 شركة بريتيش بتروليوم (في 5 ' end) لتسلسل عرض التكامل إلى الجزء الذي هو على وشك أن تنصهر فيها.
    2. الصمامات في مناطق التماثل إلى منتج PCR الجينات المقاومة للمضادات الحيوية (بما في ذلك في منطقة المروج) استخدام الجمعية متحاور21، عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. MG1655 اليكتروبوراتي الخلايا التي تحتوي على بلازميد بكوبيج.
      ملاحظة: بكوبيج هو ناقل ثيرموسينسيتيفي يحتوي λ الآلات الحمراء، تعزيز التبادلات الاليلي المستندة إلى التماثل بين كروموسوم و منتجات PCR22.
      1. استخدم 1 ميليلتر من الناتج من الخطوة 1.1.223 إلى 40 ميليلتر من الخلايا اليكتروكومبيتينت في الترعة 2 مم في 4 درجات مئوية و 2.5 كيلو فولت. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من مرق LB + أرابينوز 0.2% للحفاظ على التعبير عن λ الآلات الحمراء.
      2. نقل الحجم الإجمالي لأنبوب [ميكروفوج] واحتضان ح 2 عند 30 درجة مئوية (درجة حرارة المتساهلة بكوبيج) مع الهز مكثفة (200 دورة في الدقيقة في شاكر مداري) للسماح للتعبير المظهرية من علامات المقاومة إدراجها في الكروموسوم.
      3. لوحة الخلايا على أجار رطل المحتوية على المضادات الحيوية المناسبة لتحديد الجينات المقاومة للمضادات الحيوية (الأمبيسلّين أو كاربينيسيلين في 100 مغ/لتر بالنسبة بلوختيم-1).
    4. لوحة 100 ميليلتر في طبق بتري واحد، وتدور أسفل بقية وحدة التخزين، ريسوسبيند أنه في 100 ميليلتر من جديد رطل مرق ولوحة أنه في آخر طبق بيتري. تبني بين عشية وضحاها في 42 درجة مئوية.
      ملاحظة: درجة حرارة هذا غير المتساهلة للنسخ متماثل بكوبيج. المستعمرات قادرة على النمو في ظل هذه الظروف سيكون لديك فقدت بكوبيج وسيقدم الجينات المقاومة المتكاملة في الموقع أتتب (للتبسيط سوف يطلق على هذه السلالة MG1655::ريزا من الآن فصاعدا).
    5. اختبار لفقدان بكوبيج بتكرار مستعمرات الفائدة في لوحات مع الكلورامفينيكول (المضادات الحيوية ضد بكوبيج الذي يحتوي على علامة مقاومة).
      ملاحظة: يدل على عدم وجود بلازميد نقص النمو في لوحات الكلورامفينيكول في درجة حرارة متساهلة من 30 درجة مئوية.
    6. بغية التحقق من صحة الحيوانات المستنسخة، تضخيم PCR في البناء باستخدام كبسولة تفجير الخارجية Extern يبهك (5 '-تتجتجاككاجاجاككجكا-3') و Extern يبهب (5 '-كتكاتكاجتاكجاتكتجكج-3')، التحقق عن طريق التفريد جل الحجم الصحيح أمبليكون والتسلسل تنقية المنتج التأكد من صحة تسلسل الجين المدرج.
  2. إدراج الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في بلازميد multicopy.
    ملاحظة: والبلازميدات مع عدد نسخ عالية جداً تميل إلى فرض إجراء تخفيض كبير في لياقة المضيف البكتيرية، نوصي باستخدام البلازميدات multicopy مع مصدر طبيعي للنسخ المتماثل، مثل p3655 (pSU18T-ببادgfp2، ColE1-نوع الأصل من 24من النسخ المتماثل). هذه البلازميدات عادة تقديم عدد نسخة معتدلة من حوالي 15-20 نسخة لكل خلية.
    1. بكر تضخيم الجينات المقاومة للمضادات الحيوية للاختيار (بما في ذلك منطقة المروج)، فوسفوريلاتي المنتج بكر واضطر هو إلى العمود الفقري بلازميد تضخيم PCR:
      1. [بكر] تضخيم الجينات المقاومة للمضادات الحيوية؛ بلوختيم-1 استخدام كبسولة تفجير Tem1-بباد-F (-تجاجككتجكتتتتتاتاككجكككجاججتجكججك 5 '-3') و Tem1-بباد-R (5 '-تتكجكتكاجتاجتاتاجاجكججكجكتاججكجكت-3').
      2. فوسفوريلاتي المنتج المنقي باستخدام كيناز بولينوكليوتيدي T4، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
      3. [بكر] تضخيم العمود الفقري بلازميد استخدام عالية دقة بوليميريز والنوكليوتيد بباد-F (-كجتجاتكجكاكجتاجاج 5 '-3') وبباد-R (5 '-آآكجاكجككاجتجككاج-3').
      4. سد كل الأجزاء PCR استخدام T4-ليجاسى اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    2. اليكتروبوراتي، كما هو موضح سابقا، ميليلتر 40 من الخلايا اليكتروكومبيتينت كولاي DH5-α بحد أقصى 1 ميليلتر من ربط المنتج وحدد على المضادات الحيوية المناسبة للجينات المقاومة للمضادات الحيوية (الأمبيسلّين أو كاربينيسيلين في 100 مغ/لتر بلوختيم-1) والعمود الفقري بلازميد.
      ملاحظة: المكمل رطل مع أرابينوز هنا لا لزوم لها.
    3. استخراج بلازميد استخدام طقم التجارية الإعدادية المصغر لاختيار القارئ:
      1. حصاد 5 مل ثقافة بين عشية وضحاها من سينتريفوجينج في 12,000 س ز في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند الخلايا في 250 ميليلتر لاستثارة الحل ومزيج جيد. إضافة 250 ميليلتر من حل تحلل ومزيج جيد. إضافة 350 ميليلتر لتحييد ومزيج جيد.
      2. نقل المادة طافية على العمود ربط الحمض النووي المقدمة مع عدة، جهاز الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة وتجاهل التدفق من خلال. تغسل مرتين العمود مع 500 ميليلتر من الحل الغسيل، سينتريفوجينج لمدة دقيقة واحدة وتجاهل فلووثروغ في كل غسل. الطرد المركزي العمود الفارغ ل 1 دقيقة إضافية لإزالة المخزن المؤقت لغسيل المتبقية.
      3. وضع العمود في أنبوب نظيف وإضافة 50 ميليلتر من الماء النقي فائقة للغشاء الوتي الحمض النووي المنقي. 1-2 دقيقة وجمع التدفق من خلال الذي يحتوي على بلازميد المنقي للطرد المركزي. سانجر تسلسل جين الفائدة في بلازميد استخدام كبسولة تفجير من خارج التسلسل المدرج لتأكيد أن التسلسل الصحيح وأن لا الطفرات موجودة في الجينات المقاومة قبل التجارب تطور.
    4. حالما يتم التحقق من التسلسل، اليكتروبوراتي بلازميد في سلالة MG1655 كولاي ، كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: هذا تؤدي سلالة MG1655/pRESA-

2-نهج الإنقاذ التطوري تجريبيا تتطور المقاومة للمضادات الحيوية (الشكل 1)

  1. متواصلة من سلالات قيد الدراسة على ألواح رطل: MG1655::ريزا و MG1655/pRESA بالإضافة إلى السلالة الأبوية عرضه، MG1655.
    ملاحظة: pRESA بلازميد ينبغي أن يكون مستقرا في MG1655، حتى لا يكون هناك لا حاجة لإضافة المضادات الحيوية إلى لوحات رطل. معدلات الطفرة في كولاي منخفضة بما يكفي حتى مجرد البناء يتم التحقق من أنها ليست ضرورية للتحقق من تسلسل بلازميد في كل خطوة.
  2. إعداد لوحات 96-جيدا مع 200 ميليلتر من رطل في كل بئر وتطعيم 48 المستعمرات المعزولة من كل سلالة في آبار مستقلة (لوح واحد كل سلالة). احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة. الاحتفاظ بمخزون مجمدة من هؤلاء السكان مؤسس.
    ملاحظة: لمنع ومراقبة التلوث عبر الثقافة في لوحات 96، حسنا، استخدم تصميم لوحة شطرنج قبل إينتيركالاتينج الآبار الملقحين مع خالية من البكتيريا المتوسطة في جميع أنحاء اللوحة 96-جيدا. استخدم هذا التصميم لوحة أثناء تطور تجريبية كاملة.
  3. بدء تجربة الإنقاذ التطوري بتطعيم ميليلتر 2 من كل بئر من اللوحات مع السكان مؤسس في لوحات 96-بئر جديدة مع ميليلتر 198 من رطل في كل بئر بتركيز سوبينهيبيتوري من المضادات الحيوية قيد الدراسة. للنهج التطوري الإنقاذ البدء مع ¼ أو 1/8 من تركيز الحد الأدنى المثبطة (هيئة التصنيع العسكري، تحدد مسبقاً25) من المضادات الحيوية في رطل لكل من ثلاث سلالات وضعف تركيز المضادات الحيوية اليومية. استخدام هذا النهج لتحقيق أقصى قدر من فرص السكان في الحصول على الطفرات المقاومة26. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة ح 20.
    ملاحظة: قياس التطوير التنظيمي بين عشية وضحاها من السكان مؤسس. إذا كانت هناك اختلافات هامة في التطوير التنظيمي بين سلالات تصحيح العدوى الأولية لبدء التجربة مع نفس العدد من الخلايا كل بئر.
  4. قياس القطر الخارجي لكل السكان بعد الثقافة بين عشية وضحاها كل يوم، وإجراء عملية نقل الثقافات، كما هو موضح في 2-3، إلى لوحات 96-بئر جديدة مع ضعف تركيز المضادات الحيوية من قبل يوم. احتضان لوحات ح 20 عند 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: عامل تخفيف 1: 100 وتنتج حوالي 6-7 أجيال في اليوم الواحد.
  5. في موازاة ذلك، نشر السكان تحكم كل سلالة في نفس الظروف كما هو موضح في 2.3 و 2.4، ولكن في غياب المضادات الحيوية.
    ملاحظة: سوف تساعد السكان تحكم تميز بين الطفرات التي تنشأ بسبب وجود المضادات الحيوية والطفرات عامة مساعدة البكتيريا تتكيف مع الظروف التجريبية. موازية الطفرات الناشئة في غياب المضادات الحيوية المحتمل أن يكون مساعدة البكتيريا تتكيف مع الظروف التجريبية ولا تتصل بالمقاومة للمضادات الحيوية.
  6. تتبع عدد السكان الباقين على قيد الحياة كل يوم عن طريق قياس امتصاص في موجه 600 نانومتر (OD) الثقافات تستخدم قارئ لوحة.
    ملاحظة: قيم الكثافة البصرية أقل من 0.1 تشير إلى انقراض السكان. انظر الشكل 2 على سبيل مثال من منحنيات البقاء على قيد الحياة.
  7. الاحتفاظ بالأوراق المالية مجمدة لجميع السكان بصورة دورية (كل 3-5 أيام).
  8. استخدام اختبارات رتبة سجل [حزمة "البقاء" في رستوديو (الإصدار 0.99.486)] لتحديد الفروق الإحصائية في بقاء سكان سلالات مختلفة على مر الزمن تحت زيادة تركيز المضادات الحيوية12.
    ملاحظة: هذه التجربة سوف تحدد إذا والبلازميدات multicopy تحفيز تطور المضادات الحيوية المقاومة للمضادات الحيوية خاصة والجينات قيد الدراسة.

3-الجزيئية أساس تطور المقاومة للمضادات الحيوية (الشكل 1)

  1. أداء مجموع استخراج الحمض النووي من عدد تمثيلي من السكان والحيوانات المستنسخة عبر السلالات والعلاجات. وتشمل السلالات الأبوية (MG1655، MG1655::ريزا و MG1655/pRESA) لتكون قادرة على الكشف عن الطفرات تتراكم خلال التجربة.
    ملاحظة: للحصول على أمثلة لمجموعات استخراج الحمض النووي انظر الجدول للمواد. كل مجموعة لديها بروتوكولات مختلفة؛ اتبع تعليمات الشركات المصنعة.
  2. قياس نوعية الحمض النووي والتركيز. وهناك أساليب مختلفة لتحديد نوعية الحمض النووي والتركيز. تحديد نوعية قياس نسب امتصاص 260 نيوتن متر/280 نانومتر و 260 nm nm/230. استخدام صبغة الحمض النووي ملزم فلورسنت، لقياس تركيز الحمض النووي اتباع إرشادات الشركة المصنعة، وهو [اغروس] هلام التفريد للتأكد من أن هناك لا تدهور الحمض النووي أو التلوث بالجيش الملكي النيبالي.
  3. استخدام تسلسل الحمض النووي العميق من عينات من شعوب بأكملها والفردية استنساخ للتحقيق في الأساس الوراثي لمقاومة المضادات الحيوية.
    ملاحظة: قد أجرينا التسلسل كل محور ويلكوم ترست "علم الوراثة البشرية"، أكسفورد، المملكة المتحدة. لمزيد من التفاصيل انظر "سان ميلان" et al. 12بحلول عام 2016.
  4. استخدام خط أنابيب برسيق 0.26.127،28 للكشف عن الطفرات، استخدام وضع تعدد الأشكال لتقدير تواتر حدوث طفرات في السكان. مقارنة الجينوم تطور مختلف للجينوم الأبوية للكشف عن الطفرات التي تراكمت خلال التجربة.
  5. قارن الطفرات المتراكمة في نفس الوقت في مراقبة السكان مع أولئك السكان تطورت تحت زيادة تركيز المضادات الحيوية للتفريق بين الطفرات مساعدة البكتيريا على التكيف مع (الشروط التجريبية العامة تلك الموجودة في السكان التحكم) والجهات المعنية بمقاومة المضادات الحيوية (تلك الموجودة حصرا في السكان يتعرضون لضغوط المضادات الحيوية).
    ملاحظة: عدد الطفرات مواز عادة ما تكون منخفضة، حيث يمكن بسهولة تقدير الطفرات متوازية مختلفة بين العلاجات. وبصرف النظر عن الطفرات في الجينات المقاومة للمضادات الحيوية قيد الدراسة فمن المحتمل جداً تجد المرتبطة الأخرى الطفرات المقاومة للمضادات الحيوية في الكروموسوم، وهذه الطفرات في نظم porins أو افلوكس12.
  6. إعادة بناء الطفرات في الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في السلالة الأبوية باستخدام النهج نفسه كما هو الحال في المادة 1 من هذا البروتوكول. اتبع النقاط 1-1 و 1-2 من البروتوكول إدخال طفرات جديدة في الخلفية الأبوية (باستخدام الجينات تطورت كقالب PCR). تحليل تعمل المقاومة للمضادات الحيوية لهذه الإنشاءات الجديدة لتأكيد دور الطفرات.

النتائج

في أعمالنا السابقة، وكان التحقيق في تطور β-lactamase الجينات بلوختيم-1 نحو منح المقاومة ceftazidime سيفالوسبورين الجيل الثالث12 . تم تحديد هذه الجينات لأنه، على الرغم من أن لا يمنح تيم-1 مقاومة سيفتازيديمي، الطفرات في بلوختيم-1 يمكن توسيع نطاق النشاط تيم-1 يتحلل السيفالوسبورينات مثل ceftazidime29. الطفرات في الإنزيمات المقاومة للمضادات الحيوية مثل β-lactamases أو امينوغليكوزيد تعديل الإنزيمات مما يؤدي إلى تغييرات في نطاق النشاط هي المشتركة29،30. هذا النظام التجريبي يعتبر مثاليا لاستكشاف تطور هذا النوع من الإنزيمات. لإعداد تقرير مفصل عن تجربة ناجحة بعد هذا البروتوكول الرجاء راجع "سان ميلان" وآخرون. 12بحلول عام 2016.

هنا، يقدم مثالاً على النتائج المحتملة لهذا النظام التجريبي لتوضيح البروتوكول (لاحظ أن البيانات المستخدمة في هذا المثال ليست حقيقية). للتحقيق في الدور المحتمل ل multicopy البلازميدات في تطور الجينات المقاومة للمضادات الحيوية قيد الدراسة في هذا المثال (دعنا نسميها ريزا)، ونطور النظام التجريبي بعد المادة 1 من البروتوكول، المذكورة أعلاه. التجارب التي تنتج ثلاث سلالات: MG1655، MG1655::ريزا و MG1655/pRESA. تم اختبار تطور المقاومة للمضادات الحيوية المختلفة ß-لاكتام اثنين (ceftazidime والميروبينيم) اتباع الخطوات الموضحة في القسم 2 من البروتوكول. ويبين الشكل 2 منحنيات البقاء على قيد الحياة للسكان تحت الدراسة. في هذا المثال، هناك زيادة كبيرة في بقاء السكان المنتمين إلى MG1655/pRESA المتطورة في سيفتازيديمي مقارنة مع تلك من MG1655 أو MG1655::ريزا (رتبة سجل الاختبار، ف< 0.05). من ناحية أخرى، هناك في حالة الميروبينيم، لا توجد اختلافات كبيرة في بقاء السكان الذين ينتمون إلى سلالات مختلفة (رتبة سجل الاختبار، ف> 0.05). ولذلك، توحي هذه النتائج أن يقوي وجود الجينات ريزا في بلازميد multicopy التي تعالج تطور المقاومة إلى سيفتازيديمي ولكن ليس إلى الميروبينيم.

في الخطوة الأخيرة من التجربة، هو التحقيق في الأساس الجزيئي للمقاومة للمضادات الحيوية، كما هو موضح في القسم 3 من البروتوكول. أولاً، سوف تكشف عن تسلسل الحمض النووي الطفرات في ريزا التي يمكن أن تكون مسؤولة عن النمط الظاهري المقاومة. وثانيا، سوف تأكيد التعمير الطفرات ريزا في MG1655 الوالدين (سواء في كروموسوم وبلازميد) أو تجاهل دورها في النمط الظاهري مقاومة المضادات الحيوية.

figure-results-2572
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي للمراحل المختلفة للبروتوكول. من اليسار إلى اليمين: (ط) بناء النظام التجريبي: MG1655، MG1655::ريزا و MG1655/pRESA. يتم تمثيل الكروموسوم البكتيري في براون، بلازميد باللون الأزرق والجينات ريزا باللون الأحمر. (ثانيا) نهج الإنقاذ التطورية تجريبيا تتطور المقاومة للمضادات الحيوية: يتم نشر السكان العديد من سلالات مختلفة تحت زيادة تركيز المضادات الحيوية. (ثالثا) التحليل الأساس الجزيئي للمقاومة للمضادات الحيوية: تسلسل الحمض النووي من عينات من تطور السكان والحيوانات المستنسخة، والكشف عن الطفرات المقاومة للمضادات الحيوية وإعادة إعمار هذه الطفرات في السلالة الأبوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-3490
الرقم 2. منحنيات البقاء على قيد الحياة مع التركيزات المتزايدة للمضادات الحيوية- تمثيل عدد من صالحة السكان الذين ينتمون إلى سلالات MG1655، MG1655::ريزا، و MG1655/pRESA على مر الزمن. تم نشر السكان 48 من كل سلالة تحت التركيزات المتزايدة للمضادات الحيوية ceftazidime والميروبينيم، بدءاً من 1/8 لهيئة التصنيع العسكري في اليوم 1، ومضاعفة تركيز المضادات الحيوية كل يوم. خط عمودي متقطع أحمر يمثل هيئة التصنيع العسكري للمضادات الحيوية قيد الدراسة. لاحظ أنه في حالة سيفتازيديمي هناك اختلافات كبيرة في بقاء السكان الذين ينتمون إلى سلالات مختلفة على مر الزمن (رتبة سجل الاختبار، ف< 0.05). من الأهمية بمكان إلا السكان تحمل بلازميد قادرة على البقاء على قيد الحياة حتى تركيزات عالية المستوى من المضادات الحيوية. من ناحية أخرى، هناك في حالة الميروبينيم، لا توجد اختلافات كبيرة في بقاء السكان مختلفة على مر الزمن (رتبة سجل الاختبار، ف> 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

نقدم بروتوكول جديد يجمع بين البيولوجيا الجزيئية وتطور تجريبية وعميق تسلسل الحمض النووي تهدف إلى التحقيق في دور البلازميدات multicopy في تطور المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو يجمع بين التقنيات من مختلف المجالات، جميع الوسائل اللازمة لتطوير ذلك بسيطة، ويمكن أن يؤديها في مختبر الميكروبيولوجيا عادية. الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي على الأرجح بناء سلالات النظام النموذجي وتعمير الطفرات لوحظ بعد تطور التجريبية (التي يتم تنفيذها باستخدام نفس الأسلوب الدقيق). ومع ذلك، نظام الجمعية متحاور21، يبسط إلى حد كبير هذا البروتوكول حتى يمكن تنفيذه من قبل أي مستخدم بمستوى متوسط من الخبرة في مجال البيولوجيا الجزيئية.

خطوة حاسمة أخرى من البروتوكول هو تطور تجريبية تحت التركيزات المتزايدة للمضادات الحيوية. على سبيل مثال، يبدأ هذا البروتوكول التجربة مع ¼-1/8 من هيئة التصنيع العسكري للسلالات وثم تضاعف تركيز المضادات الحيوية كل يوم. ومع ذلك، يمكن زيادة معدل أقل لتغيير المضادات الحيوية فرصة للإنقاذ التطوري من الانقراض26. ولذلك، معدل التغير من تركيزات المضادات الحيوية هي واحدة من المعلمات التي يمكن تعديلها لتشجيع تطور المقاومة للمضادات الحيوية.

تسلسل الحمض النووي والتحليل هي أيضا الجوانب الرئيسية للتصميم التجريبي. النتائج أكثر وضوحاً عندما يتم إجراء تسلسل على عينات من الحمض النووي من شعوب بأكملها ومن الحيوانات المستنسخة الفردية، في نقاط زمنية مختلفة في التجربة. تسلسل النتائج من السكان سوف تكشف عن الاختلافات العامة في ملامح الطفرة بين العلاجات، فضلا عن الاحتلالات انتقائية من الطفرات المفيدة مع مرور الوقت والأحداث المحتملة للتدخل الاستنساخ. عند تحليل تسلسل من السكان، فمن الأفضل لتصفية الطفرات التي تجاوزت ابدأ التردد 10% في أي مجموعة من السكان. تسلسل من استنساخ الفردية المساعدة في تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من السكان، والأهم من ذلك، تكشف عن تركيبات محددة بين الطفرات المختلفة التي لوحظ على مستوى السكان. قد تساعد هذه الجمعيات محددة كشف epistatic التفاعلات بين الطفرات، التي تلعب دوراً حاسما في التكيف البكتيرية31.

باستخدام هذا الأسلوب، ونحن قد أظهرت مؤخرا أن والبلازميدات multicopy تسريع تطور المقاومة للمضادات الحيوية، أولاً عن طريق زيادة معدل ظهور طفرات جديدة ومن ثم بتضخيم تأثير الطفرات بسبب الجينات زيادة جرعة12 . ولذلك، قمنا بتطوير الأسلوب كأداة للتحقيق في تطور المقاومة للمضادات الحيوية، ولكن يجوز لها مجموعة أوسع من التطبيقات. تحديداً، يمكن استخدام هذا النظام للتحقيق في قدرة أي الجينات البكتيرية على التطور نحو وظيفة جديدة أو محسنة بشكل عام أكثر. يمكن استخدام هذا النظام، على سبيل المثال، لاختبار قدرة إنزيم/مسار الأيض على استخدام الكربون الجديدة ركائز32. أيضا، يمكن أن يستخدم بدلاً من هايبرموتاتورس (البكتيريا مع وجود خلل في الأنظمة الخلوية المشاركة في إصلاح عدم تطابق الحمض النووي) للتحقيق في تطور التكيف الجيني في البكتيريا، وتجنب التحيز حيث عرضته هايبرموتاتورس.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل وأيده دي معهد الصحة كارلوس الثالث (دي "خطة الحكومي" أنا + د + أنا 2013-2016): منح CP15 00012، PI16-00860، وسيبير (CB06/02/0053)، شاركت في تمويله "الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية" '' طريقة لتحقيق أوروبا '' (سيطلب). جاي معتمد من قبل البرنامج Atracción de talento حكومة منطقة مدريد (2016-T1/بيو-1105) وأنا + "اكسسيلينسيا د" للاسباني دي وزارة الاقتصاد، اندستريا y كومبيتيتيفيداد (BIO2017-85056-P). ASM معتمد من قبل على "ميغيل سيرفيت زمالة" من معهد دي السعود كارلوس الثالث (MS15/00012) شاركت في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي "الاستثمار في المستقبل" (كلية العلوم التربوية) وسيطلب.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ThermocyclerBioRadC1000
ElectroporatorBiorRad1652660
Electroporation cuvettesSigma-AldrichZ706078
NanoDrop 2000/2000cThermo Fisher ScientificND-2000Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
IncubatorMemmertUF1060
Incubator (shaker)Cole-Parmer LtdSI500
Electrophoresis power supplyBioRad1645070Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamberBioRad1704405Agarose gel electrophoresis
PippettesBiohit725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetesBiohit728220, 728230,
728240
Plate reader Synergy HTXBioTekBTS1LF
Inoculating loopsSigma-AldrichI8388
96-well platesFalcon351172
LBBD DifcoDF0446-17-3
LB agarFisher scientificBP1425-500
Phusion PolymeraseThermo Fisher ScientificF533S
Gibson AssemblyNew England BiolabsE2611S
Resctriction enzymesFermentas FastDigest
AntibioticsSigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1120gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue KitsQiagen69506gDNA extraction kit
Electroporation cuvettesSigma-AldrichZ706078
Petri dishesSigma-AldrichD9054
CryotubesClearLine390701
96-well plates (-80ºC storage)Thermo Fisher Scientific249945
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2670Quantification of DNA concentartion
AgaroseBioRad1613100Agarose gel electrophoresis
50x TAE bufferBioRad1610743Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide KinaseThermo Fisher ScientificEK0031
T4 DNA LigaseThermo Fisher ScientificEL0014

References

  1. Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
  2. Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
  3. MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
  4. Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
  7. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  8. Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
  9. Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
  10. Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
  11. Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
  12. San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
  13. Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
  14. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  15. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  16. Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  17. San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
  18. Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
  19. San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
  20. Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
  21. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  22. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  23. Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
  24. Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
  25. . . Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , (2009).
  26. Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
  27. Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
  28. Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
  29. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  30. Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
  31. Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
  32. Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135 multicopy

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved