التحليل المنهجي لل

تستخدم هذه الدراسة نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا، وزيادة الإنتاجية بشكل كبير من الدراسات خلية المتداول تحت تدفق القص ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. نظرا لأهمية الخلية المتداول في الخلية متعددة الخطوات صاروخ موجه تتالي وأهمية صاروخ موجه الخلية بعد تسليم النظامية من السكان خارجية من الخلايا في المرضى، وهذا النظام يوفر إمكانية كمنبر الفحص لتحسين العلاج القائم على الخلية.

ويتمثل التحدي الرئيسي للعلاج القائم على الخلية هو عدم القدرة على استهداف بشكل منتظم كمية كبيرة من خلايا قابلة للحياة ذات كفاءة عالية لأنسجة الفائدة التالية التسريب في الوريد أو الشرياني. وبالتالي، زيادة صاروخ موجه الخلية تدرس حاليا كاستراتيجية لتحسين العلاج بالخلايا. الخلية المتداول على بطانة الأوعية الدموية هي خطوة هامة في عملية صاروخ موجه الخلية ويمكن بحثها في المختبر باستخدام تدفق موازية لوحة غرفة (PPFC). ومع ذلك، وهذا هو مملة للغاية، والإنتاجية المنخفضة الفحص، مع ظروف تدفق تسيطر بشكل سيئ. بدلا من ذلك، استخدمنا نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا أن تمكن دراسة الخصائص الخلوية المتداول في إنتاجية أعلى تحت تسيطر على وجه التحديد، ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية تدفق القص ^1،2. في هذه الورقة، وتبين لنا كيف أن خصائص المتداول من HL-60 (اللوكيميا الإنسان) الخلايا على الأسطح المطلية E-selectin-P وكذلك على الخلايا المغلفة السطوح يمكن أن يكون أحادي الطبقة readilدرست ذ. لمحاكاة أفضل الحالات الالتهابية، والمغلفة سطح قناة ميكروفلويديك مع الخلايا البطانية (ECS)، ثم جرى تفعيلها مع عامل نخر الورم-α (TNF-α)، زيادة كبيرة في التفاعل مع HL-60 الخلايا تحت الظروف الديناميكية. الإنتاجية المعززة والمتكاملة متعددة المعلمة منصة تحليل البرامج، التي تسمح التحليل السريع من المعلمات مثل المتداول السرعات والمتداول المسار، ومزايا هامة لتقييم الخلية المتداول خصائص في المختبر. يسمح تحليل سريع ودقيق الأساليب الهندسية المصممة للتأثير المتداول الخلية وصاروخ موجه، هذا المنبر قد يساعد العلاج القائم على الخلية الخارجية مسبقا.

واحدة من التحديات الرئيسية في الترجمة السريرية نجاح العلاج القائم على الخلية هو تسليم غير فعال أو استهداف الخلايا التي غرست بشكل منتظم لمواقع المطلوب ^3،4. وبالتالي، هناك بحث دائم عن النهج لتحسين صاروخ موجه الخلية، والخلية تحديدا المتداول، كاستراتيجية لتحسين العلاج بالخلايا. الخلية المتداول على الأوعية الدموية هي خطوة رئيسية في سلسلة الخلية صاروخ موجه، تعريف كلاسيكي للالكريات البيض التي يتم تجنيدهم للمواقع المرض ^5. ويخضع هذا خطوة محددة التفاعلات بين selectins البطانية، أي ف وE-selectin (P-E-وقانون حالة الطوارئ)، وبروابط المرتدة على سطح الكريات البيض ^5،6. فهم أفضل وتحسين كفاءة الخلية صاروخ موجه، وعلى وجه التحديد الخطوة المتداول، هي ذات أهمية كبيرة في السعي لمنصات جديدة لتحسين العلاج القائم على الخلية. حتى الآن هذا تم تحقيقه عن طريق استخدام لوحة موازية غرف تدفق (PPFCs)، التي تضم اثنين من بلات شقةوفاق مع طوقا بينهما، مع منفذ تدفق وتدفق تقع على لوحة العلوي، والتي من خلالها يتم perfused تعليق خلية وباستخدام حقنة لضخ ^{7،8، 9.} سطح اللوحة السفلي يمكن أن تكون مغلفة مع أحادي الطبقة خلية / ركائز ذات الصلة والتفاعل بين الخلايا perfused والسطح تحت تدفق القص ثم يتم استكشافها ^7. ومع ذلك، PPFC هو الإنتاجية منخفضة، كاشف المستهلكة، وطريقة مملة إلى حد ما، مع تشكيل فقاعة، والتسرب، وتدفق سيئة تسيطر تقديم العوائق الرئيسية.

تقنية بديلة للPPFC التقليدية هو لوحة النظام ميكروفلويديك متعددة جيدا، والسماح أداء أعلى من الإنتاجية المقايسات الخلوية (أعلى ما يصل إلى 10 مرة من PPFCs) تحت دقيقة، الكمبيوتر التي تسيطر عليها تدفق القص، مع انخفاض استهلاك كاشف ^1،10. وتجرى التجارب المتداول خلية داخل قنوات ميكروفلويديك، والتي يمكن أن تكون مغلفة مع الطبقات الوحيدة الخلية أو ركائز هندسيا وتصويرها باليودنانوغرام المجهر، مع خصائص المتداول تحليلها بسهولة باستخدام البرمجيات المناسبة. في هذه الدراسة، ونحن لشرح قدرات هذا النظام لوحة ميكروفلويديك متعددة جيدا من خلال دراسة خصائص المتداول من اللوكيميا الإنسان (HL-60) الخلايا على الأسطح المختلفة. HL-60 المتداول على ركائز مثل P و E-SEL، فضلا عن الطبقات الوحيدة الخلية التعبير عن مستقبلات المتداول مختلفة، تم تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، تم الأضداد (أب) تستخدم الحجب لإثبات المشاركة المباشرة من selectins محددة في التوسط في الحركة المتداول من HL-60 على تلك السطوح. وأجريت التجارب المتداول مع زيادة الإنتاجية، في ظل تدفق مستقر القص، مع الحد الأدنى من استهلاك كاشف / خلية، مما يتيح تحليل كفاءة المعلمات المتداول الرئيسية مثل سرعة المتداول، وعدد الخلايا المتداول، والمتداول خصائص المسار.

1. الثقافة الخلية

1. اللوكيميا الإنسان (HL-60) الخلايا
   1. ثقافة HL-60 خلايا في 75 سم ² القوارير مع 15 مل من Iscove في التعديل Dulbecco ومتوسطة (IMDM)، على أن تستكمل مع 20٪ (V / V) مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ (V / V) L-الجلوتامين و1 ٪ (ت / ت) البنسلين، الستربتوميسين.
   2. تغيير وسائل الاعلام كل 3 أيام عن طريق الشفط نصف حجم تعليق خلية واستبدالها كاملة سائل الإعلام IMDM.
   3. لcarboxyfluorescein ثنائي الأسيتات، استر succinimidyl (CFSE) تلطيخ، الطرد المركزي HL-60 تعليق خلية (400 x ج، 5 دقائق)، resuspend في محلول 1 ميكرومتر CFSE (المعد في برنامج تلفزيوني prewarmed)، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم الطرد المركزي الخلايا، والخلايا نضح طاف resuspend في المتوسط ​​prewarmed الطازجة لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني ومن ثم استخدامها لتجارب المتداول (انظر الشكل 1B لصورة ممثل CFSE الملطخة HL-60 على الخلايا P-المغلفة SEL السطح).

ق ق = "jove_content"> ملاحظة: CFSE تلطيخ هو اختياري، ويرد هنا للتدليل على ظاهرة المتداول في قناة ميكروفلويديك. تم إجراء تحليل المعلمات المتداول المقدمة في هذه المخطوطة على الخلايا غير ملوثين باستخدام التصوير brightfield القياسية.

2. الرئة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (LMVECs)
   1. معطف 100 ملم أطباق بتري مع 0.1٪ محلول الجيلاتين (ت / ت في برنامج تلفزيوني)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   2. LMVECs الثقافة على 100 ملم أطباق بتري المغلفة الجيلاتين في كامل متوسطة النمو البطاني (البطانية القاعدية المتوسطة 2 (EBM-2))، على أن تستكمل مع مجموعة محددة تكملة النمو، انظر الكواشف). تغيير وسائل الاعلام كل يوم والخلايا الثقافة الفرعية عند بلوغه 80-90٪ التقاء.
   3. للثقافة الفرعية، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثم فصل الخلايا مع 4 مل من 1X التربسين EDTA-لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية وتحييد في حجم مساو من اكتمال EBM-2 وسائل الاعلام. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل وcentrifugه (400 x ج، 5 دقائق). بعد الطرد المركزي، resuspend الكرية في 1 مل من وسائل الإعلام البطانية كاملة وتعول الخلايا مع عدادة الكريات. لا الإفراط مرور الخلايا، وهذا يؤثر على التشكل والاستخدام وظيفة الخلايا إلا في ظل مرور 7 لجميع التجارب.

3. الصينية الهامستر المبيض، ف selectin (CHO-P) خلايا
   1. خلايا CHO-P، وهي الخلايا CHO ستابلي للتعبير عن الإنسان P-SEL، وقدمت من قبل المتعاونين (مركز بيث إسرائيل ديكونيس الطبي، كلية الطب بجامعة هارفارد) ^11،12.
   2. خلايا الثقافة CHO-P في T175 سم ² القوارير في 25 مل من F-12 وسائل الإعلام.
   3. لالركض، وغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 4-5 ثانية ثم يعرض للتريبسين في 10 مل من 1X التربسين EDTA-لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية، تليها تحييد كامل في وسائل الإعلام.
   4. الطرد المركزي تعليق خلية (400 x ج، 5 دقائق)، ونضح بعناية طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل من وسائل الإعلام الكامل وعدد الخلايا مععدادة الكريات.

2. تشغيل نظام ميكروفلويديك المتكاملة متعدد جيدا بلايت

1. تأكد من توصيل كافة المعدات بشكل صحيح وتشغيل وحدات مختلفة: الكمبيوتر، وحدة تحكم، المجهر المقلوب، وكاميرا CCD.
2. فتح برامج التصوير، تأكد من يتم عرض بشكل صحيح وحدة لوحة متعددة جيدا وحدة التصوير على الشاشة.
3. توصيل أنابيب إلى فخ بخار (متصلة إلى وحدة تحكم) وكذلك ربطها واجهة الضغط.
4. وضع لوحة متعددة جيدا في لوحة سخان / محول. إضافة الكواشف لآبار (موضح أدناه) ونعلق على رأس واجهة من لوحة. وضع لوحة للتصوير على خشبة المسرح الآلي.
5. وتعلق واجهة إلى الأعلى من لوحة وينطبق ضغط هوائي من وحدة تحكم إلى الجزء العلوي من الآبار، والقيادة السائل من خلال القنوات ميكروفلويديك في معدل تدفق المعرفة، التي تسيطر عليها بسهولة باستخدام لوحة متعددة جيداالشاشة وحدة تحت وضع يدوي.
6. الكواشف في تدفق قناة عبر منطقة المراقبة، وتقع بين الآبار. أبعاد قناة ميكروفلويديك هي 350 ميكرون واسعة س 70 ميكرون طويل القامة. طول القناة الخطي هو 1 مم ويضم الجزء السفلي من القنوات ساترة الزجاج 180 ميكرون، والذي يتوافق مع brightfield، المرحلة، ومتحد البؤر المجهري مضان.
7. الحصول على أشرطة الفيديو باستخدام كاميرا CCD (اقتناء تيار، 11 لقطة / ثانية) وتحليل عن طريق برنامج متوافق.

3. طلاء القنوات ميكروفلويديك مع الركيزة البروتين أو أحادي الطبقة خلية

1. طلاء قناة ميكروفلويديك مع فبرونيكتين أو P-/E-selectin
   1. إعداد 1 مل من 20 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني. تغيير حجم استنادا إلى عدد من القنوات لتكون مغلفة (استخدام 25-50 ميكرولتر من فبرونيكتين لكل قناة).
   2. إضافة 25-50 ميكرولتر من محلول فبرونيكتين على كل مدخل جيدا. تطبيق قوة القص من 2 داين / سم ²لمدة 5 دقائق ليروي القناة. يرجى ملاحظة حبة من السائل الظهور في منفذ بشكل جيد. احتضان لمدة 30-45 دقيقة في RT
   3. نضح الحل من الآبار (لا نضح مباشرة من الدائرة الوسطى التي تغذي قناة) ^1،13. إضافة 200-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في منفذ جيدا ويغسل مع برنامج تلفزيوني قناة من خلال تطبيق تدفق القص من 2 داين / سم ² لمدة 5 دقائق. الآن المغلفة القناة بشكل صحيح مع فبرونيكتين وعلى استعداد لاستخدامها.
   4. لمعطف مع P-E أو قانون حالة الطوارئ، وإعداد حل 5 ميكروغرام / مل من البروتين المؤتلف الإنسان المطلوب في برنامج تلفزيوني، ومعطف القنوات كما هو موضح أعلاه، مع 1 ساعة الحضانة عند 37 درجة مئوية للسماح للطلاء السطح.
2. إنشاء CHO-P أو LMVEC أحادي الطبقة داخل القناة ميكروفلويديك
   1. بلطف يعرض للتريبسين الخلايا من الأطباق الثقافة لمدة 3 دقائق، ويشفي باستخدام حجم 2 أضعاف من وسائل الإعلام الكامل وأجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 400 x ج). Resuspend الخلايا مع 10 مل من وسائل الإعلام الكامل وأجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 400 x ج) ضد هبوطن.
   2. عد الخلايا لتحديد تركيز خلية في التعليق. لضمان تشكيل أحادي الطبقة متموجة LMVEC داخل القناة، وجلب تركيز الخلية إلى 15-20 مليون خلية / مل. لمتموجة CHO-P أحادي الطبقة الخلية، استخدم 50-60000000 خلية / مل. استخدام 25-50 ميكرولتر من تعليق خلية لكل قناة - تحديد عدد الخلايا الأولية المستخدمة في التجربة وفقا لذلك.
   3. إضافة 25-50 ميكرولتر من تعليق خلية في تركيز المناسبة لمدخل جيدا. وضع لوحة على المسرح المجهر وإدخال خلايا في القناة (2 داين / سم ²⁾ حتى لوحظ الخلايا على الشاشة ملء قنوات بأكملها، ومن ثم وقف تدفق.
   4. ملء كل من مخرج ومدخل مع 200 ميكرولتر من LMVEC إما كاملة أو CHO سائل الإعلام. السماح للخلايا تسوية والالتزام لمدة 3 ساعة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO _2).
   5. بعد الحضانة 3 ساعة، وغسل القناة الكامل مع وسائل الإعلام (2 داين / سم ^2، 10-15 دقيقة) لإزالة غير مرتبطالخلايا. الخلايا يجب أن تظهر الآن متكدسة تماما والقناة هي الآن جاهزة للاستخدام. اعتمادا على كثافة البذر الخلية الأولي، قد يكون مطلوبا 2-3 ساعة إضافية لتسوية الوقت لضمان تغطية كاملة من السطح مع الخلايا.

4. LMVEC تفعيل برو الأجسام المضادة للالتهابات وحجب P-/E-selectin

1. يعد حل TNF-α (10 نانوغرام / مل) في وسائل الإعلام LMVEC القاعدية.
2. للحث على تنشيط التهابات LMVEC في القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من الحل TNF-α إلى مدخل جيدا وتقديم الحل في القناة من خلال تطبيق تدفق القص من 2 داين / سم ² لمدة 5 دقائق. لمراقبة القنوات (ECS nonactivated)، إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام LMVEC القاعدية إلى مدخل جيدا وندخل في قناة (2 داين / سم ² لمدة 5 دقائق). قناة جاهز الآن للمقايسة المتداول.
3. لمنع P-SEL وE-SEL على LMVECs والخلايا CHO-P، وإدخال تحييد P-SEL (استنساخ AK4، 5 ميكروغرام / مل في باوسائل الإعلام سال) أو E-SEL (P2H3 استنساخ، 5 ميكروغرام / مل في وسائل الإعلام القاعدية) الأجسام المضادة في القناة واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. المقبل، وغسل القنوات مع وسائل الاعلام القاعدية (2 داين / سم ² لمدة 5 دقائق). القنوات هي الآن جاهزة للمقايسة المتداول.

5. HL-60 المتداول الفحص على الركيزة / خلية المغلفة أحادي الطبقة القنوات ميكروفلويديك

1. تدرس بعناية قنوات تحت المجهر للتأكد من أن القنوات والمغلفة بشكل صحيح (في حالة الطلاء مع الخلايا، ينبغي مراعاة أحادي الطبقة الخلية متكدسة بالكامل).
2. لإعداد HL-60 خلية تعليق للتجارب المتداول، وأجهزة الطرد المركزي HL-60 خلية تعليق (5 دقائق في 400 x ج) ويغسل مرة واحدة مع وسائل الاعلام القاعدية. عد الخلايا و resuspend في IMDM (وسائل الإعلام القاعدية، التي تحتوي على الكالسيوم ^{2 +} والمغنيسيوم ^{2 +)} لإنشاء خلية التعليق HL-60 مع 5 مليون خلية / مل. استخدام 25-50 ميكرولتر من تعليق خلية لكل قناة لإجراء فحص المتداول.
3. إضافة 25-50 ميكرولتر من الخلايا suspension إلى منفذ بشكل جيد، ومكان لوحة داخل لوحة التحكم في درجة حرارته حامل (37 ° C) ومكان على المسرح المجهر. المقبل، وإدخال خلايا في القناة من خلال تطبيق قوة القص من 2 داين / سم ² (ينبغي التقيد الخلايا في غضون 10-15 ثانية تتدفق من مخرج إلى مدخل).
4. لدراسة استجابة المتداول بوصفها وظيفة من إجهاد القص، والحد من القص إلى 0.25 داين / سم ² والحصول على أشرطة الفيديو 20-30 ثانية (باستخدام وظيفة "اقتناء تيار") في كل القص المطلوب (زيادة القص تدريجيا من 0.25 حتى 5 داين / سم ^2. ومن الممكن أيضا استخدام المقصات أعلى).
5. الحصول على أشرطة الفيديو باستخدام كاميرا CCD (اقتناء تيار، 11 لقطة / ثانية) وتحليل المسارات والمتداول المتداول السرعات عن طريق برنامج متوافق.

6. التدفق الخلوي لكشف التعبير عن جزيئات السطح

1. trypsinization التالية، وإعداد تعليق خلية (باستخدام 1-2 × 10 ⁵ خلية / عينة) من نوع من الخلايا المطلوبة (HL-60، CHO-P أو LMVECs) في برنامج تلفزيوني (- / -)، على أن تستكمل مع FBS 2٪. غسل الخلايا مرتين ويصل حجم العينة إلى 50 ميكرولتر (باستخدام نفس المخزن المؤقت).
2. احتضان كل عينة لدى fluorophore مترافق أب المطلوب (انظر الجدول المرفق للحصول على معلومات مفصلة) في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة (مع تغطية احباط الألومنيوم).
3. غسل الخلايا مرتين (نفس عازلة) وجلب الحجم النهائي من تعليق خلية الملون إلى 200 ميكرولتر. تحليل العينات باستخدام تدفق عداد الكريات للكشف عن التعبير عن جزيئات السطح.

HL-60 لفة على خلايا-P وselectin E السطوح، ولكن ليس على فبرونيكتين

تعتبر HL-60 خلايا "بكرات" معيار الذهب لأنها تعبر عن مجموعة متنوعة من بروابط صاروخ موجه، بما في ذلك بروابط المتداول P-SEL بروتين سكري يجند-1 (PSGL-1) وSialyl لويس العاشر (SLEX) ^5،14 (الشكل 1A ). بروتين السطح PSGL-1 بمثابة سقالة للSLEX رباعي السكريد، والتوسط التفاعل محددة مع P-E وقانون حالة الطوارئ، والتي تصل التنظيم على البطانة أثناء التهاب ^5،6،15. لاختبار قدرات النظام لوحة ميكروفلويديك متعددة أيضا، كانت مغلفة العديد من القنوات ميكروفلويديك في وقت واحد مع ركائز مختلفة وتفاعلات المتداول من HL-60 مع خلايا تم تحليل تلك السطوح. HL-60 خلايا أظهرت السلوك المتداول قوية على P-المغلفة SEL السطح، مع الخلايا والقبض أول من التدفق، تليها حركة المتداول متميزة. كما هو مبين في الشكل 1C، وتتكونوالأنف والحنجرة مع الأدب، HL-60 الخلايا يحمل السلوك المتداول مماثلة على أسطح E-SEL، ولكن ليس على ركائز المغلفة فبرونيكتين ^14،16-19. سرعة الخلية وتحليلها عن طريق برنامج متوافق، وقد تآمر ضد إجهاد القص، مما يدل على استجابة قوية من الخلايا المتداول على P و E-SEL بمتوسط ​​سرعة بين 1-12 ميكرون / ثانية.

HL-60 لفة على الخلايا CHO-P أحادي الطبقة طلاء قناة ميكروفلويديك

المقبل، ونحن تهدف لتقييم جدوى استخدام هذا النظام ميكروفلويديك لاختبار كفاءة التفاعلات بين الخلايا من الفائدة وأحادي الطبقة الخلية طلاء السطح. لاستكشاف تفاعل HL-60 مع خلايا أحادي الطبقة الخلية التي تعبر عن علامات المتداول، استخدمنا خلايا CHO-P، الذي و transfected للتعبير ثابت P-، ولكن ليس الإلكتروني، قانون حالة الطوارئ (الشكل 2A انظر أيضا الشكل 2B للممثل صورة HL-60 الخلايا على أحادي الطبقة CHO-P طلاء قناة ميكروفلويديك) ^11،12. HL-60 الخلايا المعروضة استجابة قوية المتداول على خلايا CHO-P (الشكل 2C). لاختبار ما إذا كانت هذه الحركة المتداول هو في الواقع بوساطة بواسطة P-SEL، وpreincubated على CHO-P أحادي الطبقة مع الأجسام المضادة لعرقلة إما P أو-E قانون حالة الطوارئ، وذلك قبل التروية من HL-60 خلايا في القناة. كما هو مبين في الشكل 2C، وعرقلة أحادي الطبقة CHO-P مع P-SEL أدى أب في انخفاض ملحوظ في عدد المتداول HL-60 الخلايا على السطح، مما يدل على أن P-SEL يتوسط الواقع HL-60 المتداول كما سبق وصفها ^14،18. أداء الاختبار في قناة ميكروفلويديك يسمح الفحص السريع للظروف مختلفة وحجب كفاءة المستقبلات باستخدام كميات صغيرة فقط، أقل قدر 25 ميكرولتر. لم isotype السيطرة أو أب مؤمن SEL E (التي لا يتم التعبير على الخلايا CHO-P) لن يؤثر على عدد من الخلايا المتداول على خلايا CHO-P، مما يدل على قوة هذا الاختبار بدقة في دبوس مشيرا المشاركة المباشرة من السطحية محددةعلامات الإلكترونية في التفاعلات المتداول الخلوية.

وتتوسط المتداول من HL-60 الخلايا على LMVECs واحد تنشيط TNF بواسطة E-selectin

ومن المعروف أن الخلايا البطانية ليصل تنظيم علامات سطح التصاق، مثل P و E-SEL، أثناء الالتهاب، والمساعدة في تجنيد الكريات البيض إلى مواقع الالتهاب ^5،6. ومع ذلك، في حين أن الفئران ECS التعبير عن كل من P-E-SEL واستجابة لمحفزات للالتهابات مثل انترلوكين 1 (IL-1) وعامل نخر الورم-α (TNF-α)، ECS الإنسان التعبير عن قانون حالة الطوارئ فقط-E في استجابة لهذه السيتوكينات ^20،21. تم التحقق من صحة هذه في تدفق الخلوي مقايسة لدينا، والتي تبين التعبير عن E-SEL، ولكن ليس ف قانون حالة الطوارئ، على خلايا الاوعية الدموية الدقيقة البطانية الرئة (LMVEC) ردا على التحفيز TNF-α (الشكل 3A). تتكون لوحة متعددة جيدا ميكروفلويديك العديد من القنوات ميكروفلويديك منفصلة، ​​مما يتيح أعلى اختبار مرت من ظروف مختلفة متعددة. استخدمنا هذا التصميم المفيدلوحة LMVECs داخل قنوات ميكروفلويديك (الشكل 3B) لتحليل بسرعة تفاعلات HL-60 الخلايا مع ECS تحت ظروف متعددة. لمحاكاة إعدادات التهابات، وكانت سابقة التجهيز LMVECs مع الموالية للالتهابات خلوى، TNF-α. ومن المثير للاهتمام، لم HL-60 خلايا لا تتفاعل مع LMVECs تنشيط الامم المتحدة، ولم تراع الخلايا للفة على هذا السطح. على العكس من ذلك، عرض HL-60 خلايا سلوك المتداول قوية على تنشيط TNF α LMVECs، مع متوسط ​​سرعة 5-15 ميكرون / ثانية (الشكل 3C).

نحن ثم تهدف لاستكشاف إشراك P-SEL أو SEL E في التفاعل المتداول بين HL-60 خلايا وLMVECs تفعيلها. لهذا، تم preincubated TNF-α تنشيط ECS مع P-SEL أو E-SEL منع الأجسام المضادة، وجرى تحليل المتداول من HL-60 الخلايا. كما هو مبين في الشكل 4A، عرقلة قانون حالة الطوارئ E، الذي كان يصل ينظم على تنشيط TNF α LMVECs، أسفرت عن significتراجع النمل في عدد الخلايا المتداول على أحادي الطبقة البطانية تفعيلها. في المقابل، لم تستخدم isotype السيطرة أو أب ضد P-SEL، الذي لم يكن أعرب عن ECS تفعيلها، لا يكون لها تأثير كبير على HL-60 المتداول على الطبقة البطانية تفعيلها. يوضح هذه البيانات المشاركة المباشرة للE-SEL في HL-60 المتداول على TNF-α تنشيط ECS، بما يتفق مع تقارير سابقة ^20،21. من أشرطة الفيديو المكتسبة، وبرامج التحليل يسمح احد لتتبع مسارات الخلايا الفردية التفاعل مع الركيزة. استخدمنا هذه القدرة على تتبع مسار تحديدا الخلايا الفردية التي تفاعلت مع TNF-α تنشيط ECS ث / التعليم الجامعي E-SEL حظر. كما هو مبين في الشكل 4B، كان عدد الخلايا المتداول على LMVECs تنشيط الافراج أعلى بكثير من على حظر E-SEL تنشيط ECS. وعلاوة على ذلك، يبدو أن الحركة المتداول من HL-60 على LMVECs الافراج مستمرة وقوية، في حين أن مسارات المتداول من الخلاياعلى الإلكترونى منعت SEL ECS تم تجزئة (كل لون يمثل مختلفة من الخلايا، انظر على سبيل المثال خلايا بالعربية مقابل GL في الشكل 4B). في الاحقية مع هذا الاستنتاج، كان سرعة المتداول من HL-60 الخلايا على الافراج TNF-α تنشيط ECS أقل بكثير من سرعة المتداول على الإلكترونى منعت SEL ECS (الشكل 4C).

الشكل 1. HL-60 خلايا لفة على الأسطح المطلية E-selectin-P و. (A) HL-60 خلايا تعبر عن بروابط المتداول PSGL-1 وSLEX (ايزو المركز - isotype السيطرة، لا أب - أي الأجسام المضادة). (B) صورة الممثل الإضافية تسديدة من CFSE الملطخة HL-60-P الخلايا على قانون حالة الطوارئ المغلفة السطح تحت التدفق. (C) HL-60 لفة الخلايا بقوة على الأسطح المطلية E-SEL-P و، ولكن ليس على سطح المغلفة فبرونيكتين. يتم رسم السرعة المتداول ضد إجهاد القص (ن = 10-15 خلايا لكل نقطة البيانات، وقد تم تحليل السرعات بواسطة برنامج متوافق). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2. وتتوسط HL-60 المتداول على CHO-P أحادي الطبقة الخلية مباشرة P-SEL. (A) خلايا CHO ف ف التعبير عن قانون حالة الطوارئ، ولكن SEL-E لا. (B) صورة الممثل من HL-60 على الخلايا CHO-P أحادي الطبقة طلاء سطح قناة ميكروفلويديك (10X التكبير). (C) HL -60 الخلية المتداول على CHO-P أحادي الطبقة وبوساطة مباشرة من P-SEL كما يتبين من أب حجب مقايسة (حررت - لم المحتضنة CHO-P أحادي الطبقة مع الأجسام المضادة، للحد من الخطر نمط إسوي-CHO-P أحادي الطبقة المحتضنة مع isotype السيطرة؛ * ع <0.05، في اتجاه واحد كان يستخدم ANOVA مع HSD اختبار بعد مخصصة توكي، تمثل أشرطة الخطأSEM، ن = 3.

الرقم 3. HL-60 لفة الخلايا على تنشيط TNF α LMVECs. (A) TNF-α التنشيط من LMVECs لحث على التعبير سطح E-SEL، ولكن ليس ف قانون حالة الطوارئ. (B) صورة الممثل من متكدسة LMVEC أحادي الطبقة في قناتين ميكروفلويديك (4X التكبير). (C) HL-60 الخلايا يحمل استجابة المتداول قوية على تنشيط TNF α LMVECs، ولكن ليس على LMVECs تنشيط الامم المتحدة. ايزو المركز - isotype السيطرة، unact ECS - الخلايا البطانية unactivated، ECS-TNF-α الفعل -. TNF-α تنشيط الخلايا البطانية انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

< ر /> الشكل 4. HL-60-المتداول على تنشيط TNF α LMVECs بوساطة E-selectin. (A) HL-60 المتداول على TNF-α وتفعيلها بوساطة LMVECs بواسطة E-SEL، بدلا من P-SEL، كما يتبين من أب الحجب مقايسة (نمط إسوي الظهور-EC أحادي الطبقة المحتضنة مع isotype السيطرة؛ * ع <0.05، في اتجاه واحد كان يستخدم ANOVA مع HSD اختبار بعد مخصصة توكي، أشرطة الخطأ تمثل SEM، ن = 3) (ب) تحليل المسار الخليوي يكشف المستمر. والمتداول قوية من HL-60 الخلايا على تنشيط ECS الافراج مقارنة مجزأة، المتداول ضعيفة لوحظ على حظر E-SEL-ECS تنشيط (كل لون يمثل خلية مختلفة. تم إجراء تحليل عن طريق برنامج مناسب). (C) HL-60 المتداول السرعة على تنشيط TNF-α-ECS أبطأ على ECS تنشيط الافراج مقارنة منعت E-SEL-ECS المنشط (إجهاد القص المستخدمة: 2 داين / سم ² * ع <تمثل 0.05، المفردة اختبار t، أشرطة الخطأ ثنائي الطرف SEM، ن = 17-36 الخلايا لكل مجموعة).www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

واحدة من التحديات الرئيسية في الترجمة الناجحة من العلاج القائم على الخلية الخارجية هو عدم القدرة على تقديم الخلايا بكفاءة إلى مواقع الإصابة والتهاب ذات كفاءة عالية engraftment ^3. يمثل المتداول خلية خطوة حاسمة في عملية صاروخ موجه الخلية، وتسهيل تباطؤ الخلايا على جدران الأوعية الدموية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى التصاق شركاتهم والتهجير من خلال البطانة في الأنسجة ^5. فهم أفضل لعملية المتداول لأنواع الخلايا المرشح قد تؤدي إلى تطوير تقنيات لتعزيز صاروخ موجه الخلايا وتساهم بشكل كبير في تحسين العلاج القائم على الخلية.

PPFC هو أداة تستخدم على نطاق واسع لاستكشاف المتداول الخلية، وكذلك السلوكيات الخلوية الأخرى تحت تدفق القص. تمت دراسة تطبيق PPFC لفحص العدلات التصاق على البطانة أول مرة من قبل لورنس وآخرون. في عام 1987، ومنذ ذلك الحين المنتج المتاحة تجارياوقد وضعت نهاية الخبر ^8،9. تتكون PPFCs اثنين من لوحات مسطحة مفصولة طوقا التي تسيطر على أبعاد الغرفة ^7. يحتوي على لوحة العلوي تدفق وتدفق الميناء، والتي من خلال استخدام مضخة الحقنة تمكن من نضح تعليق الخلية من خلال ^7،8 الغرفة. هناك أيضا منفذ الإضافية التي ينطبق الضغط السلبي (فراغ) للحفاظ على لوحات ضغطت معا ^7. على الرغم من تدفق موازية غرف لوحة تم استخدامها بشكل فعال لتحقيق الاستجابات الخلوية، بما في ذلك الخلايا المتداول، في ظل ظروف تدفق القص، وهناك العديد من القيود التي تحد من فعاليته. وجود قيود كبيرة من غرف تدفق عدد كبير من الخلايا وكميات كبيرة من الكواشف المطلوبة نظرا لحجم القتلى الكبير داخل منظومة تدفق ^7. مسألة حرجة أخرى هو وجود فقاعات الهواء، والتي يمكن أن تنشأ بسهولة أثناء التجمع غرفة التدفق، ويحتمل أن تعوق أحادي الطبقة الخلية والركيزةطلاء على لوحة أسفل ^22. ومع ذلك، فقد تم إحراز مزيد من التعديلات على PPCFs التقليدية لدمج منفذ إضافية على لوحة العلوي ليكون بمثابة فخ فقاعة لتسهيل إزالة فقاعات الهواء ^23. إعداد التجربة PPFC هو أيضا مملة، والخلية التدفق هو عرضة للتسرب في حالة تلف طوقا أو غير مجمعة بعناية. أخيرا، هناك فرق بين المطلوب وتطبيقها تجريبيا معدلات القص، والذي ينتج في نطاق ضيق من معدلات تدفق موحدة. من خلال مقارنة نظريا أربعة PPFCs مع مدخل ومخرج مواقف متباينة، فقد وجد أن اثنين من تكوينات غرار معدلات القص التي انحرفت عن معدلات القص يحسب بنسبة تصل إلى 75٪ ^24. لإعادة استخدام نفس الغرفة يتطلب وقتا طويلا خطوات الغسيل، وجنبا إلى جنب مع التحديات المذكورة أعلاه، وهذا يجعل مملة إلى حد ما PPFCs وانخفاض الإنتاجية.

في دراستنا، استخدمنا متعددة جيدا ع متكاملةنظام ميكروفلويديك في وقت متأخر، والاعتماد على التحكم بدقة ^1،2،13 تدفق القص. ويشمل هذا 48 لوحة جيدا ميكروفلويديك 24 قنوات ميكروفلويديك، مع كل زوج من الآبار المجاورة اتصال مع قناة ^1،25 ميكروفلويديك. 10-12 المقايسات المتداول لا يمكن أن يؤديها في 1 ساعة، مما يسمح للفحص السريع للظروف عدة عشرات في يوم واحد. القنوات ميكروفلويديك يمكن أن تطلى بسهولة مع الركيزة البروتين أو الطبقات الوحيدة الخلية، والتفاعل بين الخلايا من الفائدة وسطح يمكن تصويرها باستخدام مجهر، التي حصل عليها كاميرا CCD وتحليلها بواسطة برنامج متوافق. المعايير الأساسية مثل الكمي الخلية، وحساب السرعة المتداول وتحليل محددة المسار المسار يمكن الحصول عليها بسهولة لتحليل السلوك بكفاءة المتداول على ركائز متعددة ^13. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم كفاءة هذا النظام في دراسة الخلية المتداول باستخدام HL-60 البرولمفوسيت خط خلية سرطان الدم "بكرات" راسخة تعبر عن المفتاحبروابط المتداول، مثل PSGL-1 وSLEX، والتي تعمل معا مثل بروابط نظيره لP-E-SEL ^و15،26. في ارتباط مع التقارير السابقة، وخلايا HL60 عرضت بالفعل على سلوك المتداول قوية ف والمغلفة E-SEL قنوات ميكروفلويديك، مع سرعات بطيئة المتداول من 1-12 ميكرون / ثانية ^14،17-19. لم HL-60 الخلايا لا لفة على سطح فبرونيكتين، بما يتفق مع التقارير السابقة تبين أن المفاضلة HL-60 الخلايا لا تظهر التفاعلات مع اصق فبرونيكتين ^16. تصميم لوحة النظام ميكروفلويديك متعددة جيدا، والسماح تصل إلى 10-12 المقايسات / ساعة مقارنة فقط 1-2 المقايسات / ساعة التي يمكن اختبارها باستخدام PPFCs، يزيد بشكل ملحوظ الإنتاجية بنسبة 5 مرات على الأقل. علاوة على ذلك، تحتاج PPFCs أن تكون إعادة تجميعها وغسلها قبل كل إعادة الاستخدام، ومزيد من تباطؤ معدل الأداء. بالإضافة إلى ذلك، تدفق السيطرة عليها بسهولة تمكن الأداء السريع من التجارب التي تعتمد على القص، ومن ثم يمكن تحليلها بسهولة عن طريق البرمجيات المناسبة.

اختبرنا هذا النظام القادم لوحة متعددة جيدا من خلال تحليل التفاعلات بين HL-60 الخلايا وECS طلاء قناة ميكروفلويديك. ومن المعروف ECS للتعبير عن P-E وقانون حالة الطوارئ أثناء عملية التهابات ^5. لتوفير ECS مع حافز التهابات، ونحن سابقة التجهيز لهم TNF-α. بينما كان E-SEL يصل ينظم، كان P-SEL لا، بما يتفق مع الأدب وتبين أن الإنسان ECS سرعة إنهاء قانون حالة الطوارئ E، ولكن ليس ف قانون حالة الطوارئ، واستجابة لتنشيط TNF-α منذ الرئيسيات P-SEL المروج يفتقر TNF -α عناصر ردا على ذلك، دورة الفتشوبlting في الحث النسخي فقط E-SEL ^20،21. ثم تم محاكاة حالات الالتهابات داخل القناة التي يحتضنها أحادي الطبقة EC مع TNF-α، يليه نضح من HL-60 خلايا لاستكشاف تفاعلاته مع سطح EC. بينما HL-60 لم تتفاعل مع unactivated ECS، فعلوا عرض استجابة المتداول قوية على TNF-α تنشيط ECS (الشكل 3C)، يرتبط استجابتها ذكرت في الأدبيات ^22. أب منع التجارب (الشكل 4A) ثم أظهرت أن E-SEL، ولكن ليس ف قانون حالة الطوارئ، ومنع أدى إلى انخفاض كبير في HL-60 المتداول على تنشيط ECS. تثبت هذه البيانات المشاركة المباشرة للE-SEL، وليس ف قانون حالة الطوارئ، في التوسط في المتداول من HL-60 على TNF-α تنشيط الإنسان ECS ^20،21. وأب حظر التجارب، والتي تبين العكس بوساطة SEL E-المتداول على تنشيط ECS مقابل بوساطة P-SEL المتداول على CHO-P، بالتحقق من صحة مزيد من جدوى وأهمية أب blockiتجارب نانوغرام يؤديها بسرعة في هذا النظام ميكروفلويديك. ومن المثير للاهتمام، وكان هذا تثبيط المتداول يست كاملة (الحد من حوالي 70٪) مما يشير إلى أن المستقبلات السطحية الأخرى، مثل VCAM-1، والمشاركة أيضا في HL-60 المتداول على تنشيط ECS ^27. وكشف تحليل المسار المسار المزيد من ظاهرة أخرى مثيرة للاهتمام - في حين أن المتداول من HL-60 على الافراج ECS تفعيلها المستمر والقوي، وانخفاض عدد الخلايا التي لا تزال توالت على E-SEL منعت تنشيط ECS عرض مسار المتداول مجزأة على ECS منعت ( الشكل 4B). لم يكن لوحظ هذه الظاهرة في ECS حضنت مع حجب P-SEL أو isotype السيطرة (لا تظهر البيانات). هذا يوحي بقوة أنه في حين أن استجابة المتداول هو ممكن عن طريق علامات أخرى عندما يتم حظر EC E-SEL، ويعتمد هذا على المتداول ضعيفة، جزئية التفاعلات HL-60-EC، ودعم فقط فضفاضة، واستجابة جزئية المتداول مع ECS تنشيط ^{5،22 ،27-29.} ويؤيد ذلك البيانات هو مبين في الشكل 4C ، مما يدل المتداول أبطأ بكثير من HL-60 الخلايا على تنشيط ECS الافراج مقارنة المتداول على حظر-SEL E-ECS تفعيلها، مما يدل على استجابة أضعف المتداول على الإلكترونى منعت SEL ECS. باستخدام نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا بدلا من السماح لنا PPFC لإجراء التجارب الدقيقة HL60-ECS بسرعة، في حين تسيطر بدقة تدفق القص، وتجنب فقاعات وفقط باستخدام كميات ضئيلة من القيمة المطلقة والخلايا. استخدام المفيد من على microfluidics لتطبيقات الخلايا المتداول وقد تجلى سابقا ^30-33، وتحسين الإنتاجية من على microfluidics عن طريق نظام لوحة متعددة جيدا المعروضة هنا، يسلط مزيدا من الضوء على إمكانات هذه التكنولوجيا لتحليل كفاءة ودقة لخصائص المتداول رئيسية نحو تحسين التطبيقات العلاجية .

وركزت هذه الدراسة على فحص HL-60 خلية المتداول على ركائز البروتين والطبقات الوحيدة الخلية تحت تدفق القص ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية والتحكم بدقة باستخدامنظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا. وبالمثل، أنواع الخلايا الأخرى وغيرها من الطبقات الوحيدة ركائز / خلية يمكن بسهولة أن تستخدم لدراسة خصائص المتداول. سهولة الاستخدام وتحليل بسيط يسمح التحليل الدقيق للخصائص المتداول الهامة وحجب أب أو التنشيط مع عوامل النمو المختلفة أو مثبطات يمكن استخدامها لاستكشاف إمكانية إشراك الواسمات الجزيئية في الاستجابة المتداول. قد يكون هذا مفيدا على وجه التحديد نحو دراسة الخلايا الجذعية المتداول وصاروخ موجه، والتي يمكن تصميمها لتحسين العلاج القائم على الخلايا الجذعية ^34-36. الأهم من ذلك، يمكن اختبار شروط متعددة مع تحسين الإنتاجية (أعلى 5-10 مرات مقابل PPFCs)، والسماح دراسة سريعة وفعالة من خصائص المتداول نظرا لتصميم لوحة. المقايسات الأخرى ذات الصلة لصاروخ موجه الخلية، مثل التصاق الخلية، الكيميائي والتهجير ويمكن أيضا أن تدرس باستخدام هذا النظام ^1،10،13. عموما، هذا النظام ميكروفلويديك يخرج كأسلوب قوية لدراسة المتداول الخلية وقhould معها يكون بمثابة أداة مفيدة للمساعدة في الترجمة السريرية لعلاج خلية مقرها الخارجية.

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

كانت الخلايا CHO-P هدية عينية من الدكتور باربرا Furie (مركز بيث إسرائيل ديكونيس الطبي، كلية الطب بجامعة هارفارد). وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة HL095722 منحة لJMK وأيد هذا العمل أيضا في جزء من جائزة التحدي مؤسسة سرطان البروستاتا لMovember-JMK