ניתוח שיטתי של

מחקר זה השתמש במערכת microfluidic צלחת רב גם, להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מתגלגלים תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. לאור החשיבות של מתגלגל תא בתא רב שלבי ביות מפל ואת החשיבות של ביות התא הבאה משלוח מערכתי של אוכלוסיות אקסוגניים של תאים בחולים, מערכת זו מציעה פוטנציאל כפלטפורמת הקרנה כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים.

אתגר גדול לטיפול מבוסס תאים הוא חוסר היכולת למקד מערכתי כמות גדולה של תאי קיימא עם יעילות גבוהה לרקמות של העניין הבא עירוי תוך ורידי או intraarterial. כתוצאה מכך, הגדלת ביות תא כרגע למד כאסטרטגיה כדי לשפר את הטיפול בתאים. תא מתגלגל על האנדותל של כלי הדם הוא צעד חשוב בתהליך של ביות של תאים ויכול להיות נחקר במבחנה באמצעות זרימת צלחת קאמרית מקבילה (PPFC). עם זאת, זה assay תפוקה משעמם מאוד, נמוך, עם תזרים תנאים מבוקרים היטב. במקום זאת, השתמשנו במערכת microfluidic צלחת רב גם המאפשרת חקר התכונות מתגלגלים סלולארי בתפוקה גבוהה יותר תחת מבוקרת בדיוק, זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ^1,2. במאמר זה, אנו מראים כיצד המאפיינים המתגלגלים של HL-60 (לוקמיה פרומיילוציטית האנושית) תאים על משטחי E-מצופה selectin P-וכמו גם על משטחים מצופים monolayer תא יכולים להיות readily שנבדק. כדי לדמות טוב יותר במצבים דלקתיים, משטח ערוץ microfluidic היה מצופה בתאי האנדותל (ECS), אשר לאחר מכן הופעלו עם הגורם-α גידול הנמק (TNF-α), להגדיל באופן משמעותי את אינטראקציות עם HL-60 תאים בתנאים דינמיים. התפוקה המשופרת ופלטפורמה משולבת רב פרמטר ניתוח תוכנה, המאפשרת ניתוח מהיר של פרמטרים כגון מתגלגל מהירויות ומתגלגלים בדרך, הן יתרונות חשובים להערכת מאפייני תא מתגלגל חוץ גופייה. המאפשר ניתוח מהיר ומדויק של גישות הנדסיות שנועדו להשפיע מתגלגל תא וביות, פלטפורמה זו עשויה לסייע בטיפול מבוסס תאים אקסוגניים מראש.

אחד האתגרים המרכזיים בתרגום הקליני המוצלח של טיפול מבוסס תאים הוא המסירה יעילה או מיקוד של תאים חדורים מערכתית לאתרים רצויים ^3,4. כתוצאה מכך, יש חיפוש מתמיד אחר גישות כדי לשפר את הביות של תאים, ותאים במיוחד מתגלגל, כאסטרטגיה לשיפור טיפול בתא. תא מתגלגל על כלי דם הוא צעד מפתח במפל ביות תא, באופן קלאסי המוגדר לויקוציטים שמגויסים לאתרי מחלה ^5. צעד זה נשלטת על ידי אינטראקציות ספציפיות בין selectins אנדותל, כלומר P-ו-E-selectin (P-ו-E-SEL), וligands המתפרץ שלהם על פני השטח של כדוריות דם לבנות ^5,6. הבנה טובה יותר ויעילות משופרת של ביות תא, ובאופן ספציפי את הצעד מתגלגל, הם בעלי חשיבות רבה בחיפוש אחר פלטפורמות חדשות כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים. למועד זה הושג על ידי שימוש בתאים במקביל זרימת צלחת (PPFCs), הכוללת שני פלאט השטוחes עם אטם ביניהם, עם נמל יבוא ו יצוא ממוקם על הצלחת העליונה, שדרכו השעיה תא perfused באמצעות מזרק לשאוב ^{7,8, 9.} פני השטח של הצלחת התחתונה יכולים להיות מצופה עם monolayer התא / מצעים רלוונטיים והאינטראקציה בין תאי perfused והשטח תחת זרימת גזירה היא לאחר מכן בחן ^7. עם זאת, PPFC היא תפוקה נמוכה, מגיב בעליות, ושיטה מייגעת למדי, עם היווצרות בועה, נזילה ותזרים מבוקר היטב הצגת חסרונות עיקריים.

טכניקה חלופית לPPFC המסורתי היא מערכת microfluidic צלחת רבת היטב, המאפשר ביצועים גבוהים יותר תפוקה של מבחני סלולריים (גבוהים יותר עד פי 10 מ PPFCs) תחת זרימת גזירה מדויקת, מבוקר מחשב, עם הצריכה נמוכה מגיב ^1,10. ניסויים מתגלגלים תא מבוצעים בתוך ערוצי microfluidic, שיכול להיות מצופה עם monolayers תא או מצעים מהונדסים וצלם USIng מיקרוסקופ, עם מאפיינים מתגלגלים בקלות נותח באמצעות תוכנה מתאימה. במחקר זה, אנו מדגימים את היכולות של מערכת צלחת רב גם זה microfluidic על ידי בוחן את המאפיינים המתגלגלים של לוקמיה פרומיילוציטית האנושית (HL-60) תאים על משטחים שונים. HL-60 מתגלגל על ​​מצעים כמו P-ו-E-sel, כמו גם על משטחי תא לבטא קולטנים מתגלגלים שונים, נותחו. בנוסף, נוגדנים (Ab) חסימה שימשו להפגין מעורבות ישירה של selectins הספציפי בתיווך תנועת הגלגול של HL-60 על משטחים אלו. ניסויים מתגלגלים בוצעו עם תפוקה מוגברת, תחת זרימת גזירה יציבה, עם הצריכה מגיב / תא מינימאלי, המאפשרים ניתוח יעיל של פרמטרים מתגלגלים מפתח כגון מהירות מתגלגלת, מספר התאים מתגלגלים, ומאפייני דרך מתגלגלים.

1. תרבית תאים

1. לוקמיה פרומיילוציטית אדם תאים (HL-60)
   1. תרבות HL-60 תאים ב75 סנטימטר ² צלוחיות עם 15 מיליליטר של המדיום (IMDM) של Iscove השתנה Dulbecco, בתוספת 20% (v / v) בסרום שור העובר (FBS), 1% (v / v) L-גלוטמין ו 1 % (V / v) פניצילין, סטרפטומיצין.
   2. שינוי בתקשורת כל 3 ימים על ידי aspirating חצי של ההשעיה נפח התא והחלפתו בתקשורת IMDM מלאה.
   3. לdiacetate carboxyfluorescein, מכתים succinimidyl אסתר (CFSE), HL-60 השעיה צנטריפוגה תאים (400 XG, 5 דקות), resuspend בפתרון CFSE 1 מיקרומטר (שהוכן PBS prewarmed) ו דגירה במשך 15 דקות ב37 ° C. לאחר מכן תאי צנטריפוגה, לשאוב supernatant ותאי resuspend במדיום prewarmed טרי למשך 30 דקות. שטוף תאים בPBS ולאחר מכן להשתמש בניסויים מתגלגלים (ראה איור 1 ב לתמונה מייצגת של HL-60 תאים צבעוניים CFSE על מצופה sel P פני השטח).

ss = "jove_content"> הערה: מכתים CFSE הוא אופציונלי, והוא מוצג כאן כדי להמחיש את התופעה מתגלגלת בערוץ microfluidic. ניתוח של פרמטרים מתגלגלים מוצגים בכתב היד הזה בוצע על תאים בלא כתם באמצעות הדמיה brightfield סטנדרטית.

2. תאי אנדותל כלי הדם ריאה (LMVECs)
   1. 100 מ"מ צלחות פטרי עם מעיל 0.1% פתרון ג'לטין (v v / PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס לפחות 30 דקות.
   2. LMVECs תרבות ב100 מ"מ צלחות פטרי ג'לטין מצופה במדיום גידול אנדותל השלם (בינוני 2 (EBM-2) אנדותל בסיסי), בתוספת ערכת תוסף צמיחה מסוימת, ראה ראגנטים). שינוי בתקשורת בכל יום אחר ותאים תת תרבות עם הגיע מפגש 80-90%.
   3. עבור תת תרבות, לשטוף תאים עם PBS ולאחר מכן לנתק את התאים עם 4 מיליליטר של 1x טריפסין-EDTA במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולנטרל בנפח שווה של EBM-2 מדיה מלאה. מעביר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר וcentrifugדואר (400 XG, 5 דקות). בעקבות צנטריפוגה, resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר של תקשורת אנדותל השלמה ולספור תאים עם hemocytometer. האם התאים לא מעל המעבר, שכן זה משפיע על המורפולוגיה שלהם ותפקוד שימוש רק תאים תחת חלוף 7 לכל הניסויים.

3. שחלות-P-selectin הסיני תאים (CHO-P)
   1. תאי CHO-P, שהם תאי CHO יציבות transfected להביע את P-sel האנושי, נמסרו על ידי משתפי פעולה (בית ישראל דיקונס מרכז רפואי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד) ^11,12.
   2. תרבות תאי CHO-P בס"מ T175 ² צלוחיות ב25 מיליליטר של ה-F-12 תקשורת.
   3. לpassaging, לשטוף תאים עם 10 מיליליטר של PBS ל4-5 שניות ולאחר מכן trypsinize ב10 מיליליטר של 1x טריפסין-EDTA במשך 3 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ואחרי נטרול באמצעי תקשורת מלאה.
   4. צנטריפוגה ההשעיה תא (400 XG, 5 דקות), לשאוב בזהירות את supernatant, resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר של תקשורת מלאה ולספור את התאים עםhemocytometer.

2. מבצע של מערכת microfluidic הצלחת רב גם המשולבת

1. ודא שכל הציוד מחובר כראוי ולהדליק מודולים השונים: מחשב, בקר, מיקרוסקופ ההפוך, ומצלמת CCD.
2. פתח את תוכנת ההדמיה; לוודא מודול הצלחת רב גם ומודול ההדמיה מוצגים כראוי על המסך.
3. חבר את הצינורות למלכודת האדים (מחוברת לבקר) וגם לחבר אותם לממשק הלחץ.
4. מניחים את הצלחת רב גם בתנור / מתאם צלחת. להוסיף חומרים כימיים לבארות (שיפורט להלן) ולצרף את ממשק על גבי הצלחת. מניחים צלחת להדמיה בשלב אוטומטי.
5. הממשק מתחבר לחלק העליון של הצלחת וחל בלחץ פנאומטי מן הבקר לחלק העליון של הבארות, הנהיגה הנוזל דרך ערוצי microfluidic בקצב הזרימה המוגדר, לשלוט בקלות באמצעות הצלחת רב גםמסך מודול תחת מצב ידני.
6. ריאגנטים בערוץ הזרימה על פני שטח תצפית, הממוקם בין הבארות. ממדי ערוץ microfluidic הם 350 מיקרומטר x רחב 70 מיקרומטר גבוה. אורכו של הערוץ ליניארי הוא 1 מ"מ והתחתון של הערוצים כולל זכוכית coverslip 180 מיקרומטר, אשר תואם עם brightfield, שלב, הקרינה ומיקרוסקופיה confocal.
7. לרכוש קטעי וידאו באמצעות מצלמת CCD (רכישת הנחל, 11 מסגרות / sec) ולנתח באמצעות תוכנה תואמת.

3. ציפוי של ערוצי microfluidic עם מצע חלבון או חד שכבתי נייד

1. ציפוי ערוץ microfluidic עם פיברונקטין או P-/E-selectin
   1. הכן 1 מיליליטר של 20 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין פתרון ב-PBS. אלתר נפח המבוסס על מספר הערוצים להיות מצופים (להשתמש 25-50 μl של פיברונקטין לכל ערוץ).
   2. הוספת 25-50 μl של פתרון פיברונקטין לכל כניסה כן. להפעיל כוח גזירה של 2 dyn / ² סנטימטרבמשך 5 דקות כדי תנקבנה את הערוץ. לתשומת לבך חרוז של נוזל המופיע גם בשקע. דגירה של 30-45 דקות ב RT
   3. לשאוב את הפתרון מבארות (לא לשאוב ישירות ממעגל ביניים המזין את הערוץ) ^1,13. להוסיף 200-500 μl של PBS לשקע היטב ולשטוף ערוץ עם PBS על ידי יישום זרימת גזירה של 2 dyn / ² סנטימטר על 5 דקות. הערוץ כעת מצופה כראוי עם פיברונקטין ומוכן לשימוש.
   4. למעייל עם P-או E-sel, להכין פתרון 5 מיקרוגרם / מיליליטר של חלבון רקומביננטי אדם הרצוי ב-PBS, ומעיל הערוצים כפי שתואר לעיל, עם דגירה השעה 1 ב37 ° C כדי לאפשר ציפוי פני השטח.
2. יצירה של CHO-P או LMVEC monolayer בתוך הערוץ microfluidic
   1. בעדינות trypsinize תאים ממנות התרבות במשך 3 דקות, להרוות באמצעות נפח פי 2 מתקשורת ו צנטריפוגות מלאה (5 דקות ב400 XG). תאי resuspend עם 10 מיליליטר של תקשורת ו צנטריפוגות מלאה (5 דקות ב400 XG) again.
   2. ספירת התאים כדי לקבוע ריכוז תא בהשעיה. כדי להבטיח את היווצרות monolayer LMVEC מחוברות בתוך הערוץ, להביא את ריכוז תא ל15-20 מיליון תאים / מיליליטר. לmonolayer תא מחוברות CHO-P, השתמש 50-60 מיליון תאים / מיליליטר. מספר תא ראשוני לקבוע משמש לניסוי בהתאם - השתמש 25-50 μl של תא השעיה לכל ערוץ.
   3. הוספת 25-50 μl של השעיה תא בריכוז המתאים לכניסה טובה. מניחים את הצלחת על הבמה מיקרוסקופ ולהציג את התאים לתוך הערוץ (2 dyn / ² סנטימטר) ועד לתאים הם נצפו על המסך ממלא את כל הערוצים, ולאחר מכן לעצור את הזרימה.
   4. מלא את שני לשקע ויניקה עם 200 μl של או LMVEC מלא או מדיה CHO. בואו התאים להתיישב ולדבוק עבור 3 שעות בחממה (37 מעלות צלזיוס, CO ₂ של 5%).
   5. לאחר הדגירה 3 שעות, לשטוף את הערוץ עם תקשורת מלאה (2 dyn / ² סנטימטר, 10-15 דקות) כדי להסיר פנויתאים. תאים אמורים להופיע מחוברות לחלוטין והערוץ עכשיו הוא מוכן לשימוש. בהתאם לצפיפות זריעת תאים ראשונית, ייתכן שיידרשו 2-3 שעות נוספות ליישוב זמן כדי להבטיח כיסוי של המשטח שלם עם התאים.

4. הפעלת Pro דלקתית LMVEC וחסימה של נוגדן P-/E-selectin

1. הכן פתרון TNF-α (10 ng / ml) בתקשורת הבסיסית LMVEC.
2. כדי לגרום להפעלה דלקתית של LMVEC בערוצים, להוסיף מפתרון TNF-α 100 μl למפרצון היטב ולהציג את הפתרון לערוץ על ידי יישום זרימת גזירה של 2 dyn / ² סנטימטר על 5 דקות. עבור ערוצי שליטה (ECs nonactivated), להוסיף מתקשורת הבסיסית LMVEC 100 μl למפרצון היטב ולהכניס לערוץ (2 dyn / ² סנטימטר על 5 דקות). הערוץ מוכן לassay מתגלגל עכשיו.
3. כדי לחסום P-sel ו-E-sel על LMVECs ותאי CHO-P, להציג נטרול P-sel (AK4 שיבוט, 5 מיקרוגרם / מיליליטר בbaתקשורת סאל) או E-sel (P2H3 שיבוט, 5 מיקרוגרם / מיליליטר בתקשורת הבסיסית) נוגדנים לתוך הערוץ ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C. בשלב בא, לשטוף את הערוצים עם תקשורת הבסיסית (2 dyn / ² סנטימטר על 5 דקות). ערוצים מוכנים לassay מתגלגל עכשיו.

5. HL-60 רולינג Assay בערוצי microfluidic מצופה חד שכבתי תשתית / הסלולרי

1. לבחון בזהירות את הערוצים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר שערוצים הם מצופים כראוי (במקרה של ציפוי עם תאים, monolayer תא מחוברות באופן מלא יש לשים לב).
2. כדי להכין HL-60 השעיה תא לניסויים מתגלגלים, HL-60 צנטריפוגה ההשעיה תא (5 דקות ב400 XG) ולשטוף פעם עם תקשורת הבסיסית. ספירת התאים ו resuspend ב IMDM (התקשורת הבסיסית, המכילים Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +)} כדי ליצור השעיה תא HL-60 עם 5 מיליון תאים / מיליליטר. השתמש 25-50 μl של השעיה תא לכל ערוץ כדי לבצע את assay מתגלגל.
3. הוספת 25-50 μl של suspe התאnsion לשקע היטב, צלחת מקום בתוך בעל הטמפרטורה מבוקרת צלחת (37 מעלות צלזיוס) ומניחים על הבמה מיקרוסקופ. בשלב בא, להציג את התאים לתוך התעלה על ידי הפעלת כוח גזירה של 2 dyn / ² סנטימטר (יש לשים לב תאים בתוך 10-15 שניות זורמים משקע למפרצון).
4. כדי לבחון את התגובה מתגלגלת כפונקציה של מאמץ גזירה, להפחית את הגזירה ל0.25 dyn / ² סנטימטר ולרכוש 20-30 קטעי וידאו שניות (באמצעות פונקציה "רכישת זרם") בכל גזירה רצויה (להגביר את הגזירה בהדרגה מ0.25 עד 5 dyn / ² סנטימטר. אפשר גם להשתמש במספריים גבוהים יותר).
5. לרכוש קטעי וידאו באמצעות מצלמת CCD (רכישת הנחל, 11 מסגרות / sec) ולנתח מהירויות גלגול שבילים ומתגלגלים באמצעות תוכנה תואמת.

6. Cytometry זרימה לזיהוי ביטוי של מולקולות פני שטח

1. בעקבות trypsinization, להכין השעיה תא (באמצעות 1-2 x 10 ⁵ תאים / לדוגמא) מסוג תאים רצוי (HL-60, CHO-(P או LMVECs) ב-PBS - / -), בתוספת 2% FBS. שטוף תאים פעמיים ולהביא את נפח דגימה 50 μl (תוך שימוש באותו המאגר).
2. דגירה כל דגימה עם Ab הרצוי fluorophore מצומדות (ראה טבלה המצורפת לקבלת מידע מפורט) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (מכסה בנייר אלומיניום).
3. לשטוף את התאים פעמיים (אותו חיץ) ולהביא את הנפח סופי של השעיה תא מוכתמת 200 μl. ניתוח דגימות באמצעות cytometer זרימה לזהות ביטוי של מולקולות פני השטח.

HL-60 תאים גלגל על ​​משטחי P-ו-E-selectin, אבל לא על פיברונקטין

HL-60 תאים נחשבים "רולים" תקן זהב כפי שהם מבטאים מגוון של ligands מתביית, כולל ligands מתגלגל P-גליקופרוטאין sel יגנד-1 (PSGL-1) וSialyl לואיס X (SLeX) ^5,14 (איור 1 א ). חלבון משטח PSGL-1 פועל כפיגום לSLeX טטרה saccharide, תיווך אינטראקציה ספציפית עם P-ו-E-sel, אשר מעלה מוסדרת על האנדותל במהלך דלקת ^5,6,15. כדי לבדוק את היכולות של מערכת microfluidic צלחת רב גם, ערוצי microfluidic רבים היו מצופים בו זמנית עם מצעים שונים ואינטראקציות מתגלגלות של HL-60 תאים עם המשטחים אלה נותחו. HL-60 תאים הפגינו התנהגות מתגלגלת חזקה על מצופה sel P פני השטח, עם תאים שנתפסו ראשון מזרימה, ואחריו תנועת גלגול שונה. כפי שניתן לראות באיור 1 ג, ומורכבאף אוזן גרון עם הספרות, HL-60 תאים מפגינים התנהגות דומה מתגלגלת על משטחי E-sel, ובכל זאת לא על מצעים מצופים פיברונקטין ^14,16-19. תא מהירות, נותחה באמצעות תוכנה תואמת, שזממה נגד לחץ גזירה, מראה תגובה מתגלגלת חזקה של תאים על P-ו-E-sel עם מהירות ממוצעת בין 1-12 מיקרומטר / sec.

HL-60 תאים להתגלגל על ​​monolayer CHO-P ציפוי ערוץ microfluidic

בשלב הבא, אנחנו מכוונים כדי להעריך את הכדאיות של שימוש במערכת microfluidic זו כדי לבדוק בצורה יעילה את יחסי גומלין בין תאים של העניין וmonolayer תא ציפוי פני השטח. כדי לחקור את האינטראקציה של HL-60 תאים עם monolayer תא שמבטא סמנים מתגלגלים, השתמשנו בתאי CHO-P, שהם transfected להביע ביציבות P-, אך לא E-, 2A sel (איור. כמו כן ראו איור 2 ב לנציג תמונה של HL-60 תאים על monolayer CHO-P ציפוי ערוץ microfluidic) ^11,12. HL-60 תאים מוצגים תגובה חזקה מתגלגלת על תאי CHO-P (איור 2 ג). כדי לבדוק אם תנועה מתגלגלת זו מתווכת אכן על ידי P-sel, monolayer CHO-P היה preincubated עם חסימת נוגדנים לשני P-או E-sel, לפני טפטוף של HL-60 תאים לתוך התעלה. כפי שמוצג באיור 2 ג, חוסם את monolayer CHO-P עם P-sel Ab הביא לירידה משמעותית במספר של גלגול HL-60 תאים על פני השטח, הוכחת כי P-sel אכן מתווך HL-60 מתגלגלים כמו בעבר תאר ^14,18. ביצוע assay בערוץ microfluidic מאפשר סינון מהיר של תנאים שונים וחסימה יעילה של קולטנים על ידי שימוש רק בנפחים קטנים, קטנים ככל 25 μl. שליטת אלוטיפ או Ab חסימת E-sel (שלא באו לידי ביטוי בתאי CHO-P) לא השפיעה על מספר התאים מתגלגלים על תאי CHO-P, הממחיש את כוחו של assay זה בצורה מדויקת פינים מצביעים המעורבות הישירה של surfac הספציפיסמני דואר באינטראקציות מתגלגלות סלולריות.

רולינג של HL-60 תאים בLMVECs-הופעל-TNF מתווך על ידי E-selectin

תאי האנדותל ידועים סמנים מעלה להסדיר הידבקות פני השטח, כגון P-ו-E-sel, במהלך דלקת, סיוע בגיוס של לויקוציטים לאתרים של דלקת ^5,6. עם זאת, בעוד ECs העכברי לבטא גם P-ו-E-sel בתגובה לגירויים דלקתיים כמו interleukin-1 (IL-1) וגורם-α גידול הנמק (TNF-α), ECS אדם להביע רק E-sel בתגובה לאלה ציטוקינים ^20,21. זו קבלה תוקף בזרימה שלנו cytometry assay, מראה ביטוי של E-sel, אבל לא P-sel, על תאי אנדותל כלי הדם ריאה (LMVEC) בתגובה לגירוי TNF-α (איור 3 א). צלחת microfluidic רב גם מורכבת ממספר רב של ערוצי microfluidic נפרדים, המאפשרת בדיקת תפוקה גבוהה יותר של מצבים שונים מרובים. אנחנו השתמשנו עיצוב יתרון זהלצלחת LMVECs בתוך ערוצי microfluidic (איור 3 ב) כדי לנתח במהירות את יחסי הגומלין של HL-60 תאים עם ECs בתנאים מרובים. כדי לדמות הגדרות דלקתיות, LMVECs טופל קודם לכן בציטוקינים, TNF-α פרו דלקתי. מעניין, HL-60 תאים לא אינטראקציה עם LMVECs מופעל האו"ם, ותאים לא נצפו לגלגל על ​​המשטח הזה. אדרבה, HL-60 תאים מוצגים התנהגות מתגלגלת חזקה על מופעל α TNF LMVECs, עם מהירות של 5-15 מיקרומטר / שנייה בממוצע (איור 3 ג).

לאחר מכן, אנו שמטרה לחקור את מעורבותם של P-sel או E-sel באינטראקציה מתגלגלת בין תאי HL-60 וLMVECs הופעל. לשם כך, TNF-α-הופעל ECs היה preincubated עם P-sel או E-sel חסימת נוגדנים, והגלגול של HL-60 תאים נותח. כפי שניתן לראות בתרשים 4A, חסימת E-sel, שהיה מוסדר עד-on-הופעל α TNF LMVECs, הביא significירידת נמלה במספר תאים מתגלגלים על monolayer אנדותל הופעל. בניגוד לכך, שימוש בפקד אלוטיפ או Ab נגד P-sel, שלא באו לידי ביטוי בECs הופעל, לא היה לו השפעה משמעותית על HL-60 מתגלגל על ​​שכבת האנדותל הופעלה. נתונים אלה ממחישים את מעורבותו הישירה של ה-sel בHL-60 מתגלגל על TNF-α-הופעל ECS, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים ^20,21. מקטעי הווידאו שנרכש, תוכנת ניתוח היתרים אחד כדי לעקוב אחר הנתיבים של תאים בודדים אינטראקציה עם המצע. אנחנו השתמשנו ביכולת זו כדי לעקוב אחר הנתיב של תאים בודדים שתקשרו עם TNF-α-הופעל ECs w / וו חסימת E-sel במיוחד. כפי שניתן לראות באיור 4 ב ', מספר תאים מתגלגלים על LMVECs הופעל חסימה היה גבוה יותר באופן משמעותי מאשר ב E-sel-חסם ECs הופעל. יתר על כן, נראה כי תנועת הגלגול של HL-60 על LMVECs חסימה היא רציפה ויציבה, ואילו נתיבים המתגלגלים של תאיםב E--חסם sel ECs היה מקוטע (כל צבע מייצג תאים שונים, ראה לדוגמא תאי af לעומת GL באיור 4 ב). בעקביות עם ממצא זה, את מהירות הגלגול של HL-60 תאים בTNF-α-הופעל ECs חסימה הייתה נמוכה באופן משמעותי ממהירות הגלגול שלהם ב E--חסם sel ECS (איור 4C).

איור 1. HL-60 תאים גלגל על משטחי E-מצופה selectin P-ו. () HL-60 תאים להביע ligands מתגלגל PSGL-1 וSLeX (CTR Iso - שליטת אלוטיפ, לא Ab - אין נוגדנים). תמונת הצמד ירה נציג של HL-60 תאים צבעוניים CFSE על P-sel (ב ') מצופה משטח מתחת לזרם. (C) HL-60 תאי חסונה גלגל על משטחי E-מצופה sel P-ו, אבל לא על משטח מצופה פיברונקטין. מהירות רולינג זממו נגד לחץ גזירה (n = 10-15 תאים לכל נקודת נתונים, מהירויות נותחו על ידי תוכנה תואמת). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2. מתגלגל על monolayer תא CHO-P HL-60 מתווך ישירות על ידי P-SEL. (א) בתאים CHO-P להביע את P-sel, אבל לא E-SEL. (ב ') תמונת נציג HL-60 תאים על monolayer CHO-P ציפוי פני השטח של ערוץ microfluidic (הגדלה 10X). (C) HL -60 תא מתגלגל על ​​monolayer CHO-P מתווך ישירות על ידי P-sel כפי שהודגם על ידי Ab חסימת assay (חסימה - monolayer CHO-P לא הודגרו עם נוגדן, monolayer אלוטיפ CTR-CHO-P הודגרו עם שליטת אלוטיפ; * p <0.05, בכיוון אחד ANOVA היה בשימוש עם מבחן post hoc-HSD של Tukey, ברים שגיאה מייצגיםSEM, n = 3.

איור 3. HL-60 תאים גלגל על מופעל α TNF LMVECs. () הפעלת TNF-α של LMVECs לגרום לביטוי על פני השטח של E-sel, אבל לא P-SEL. תמונת נציג המחוברות monolayer LMVEC בשני ערוצי microfluidic (הגדלה 4X) (ב). (C) HL-60 תאי תערוכה תגובה חזקה מתגלגלת על מופעל α TNF LMVECs, אבל לא על LMVECs מופעל האו"ם. ctr Iso - שליטת אלוטיפ, ECS unact - תאי האנדותל כלא פעילים, ECS TNF-α-מעשה -. TNF-α-הופעל בתאי האנדותל לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

< br /> איור 4. HL-60 מתגלגל על מופעל α TNF LMVECs מתווך על ידי E-selectin. () HL-60 מתגלגלים על TNF-α-הופעל LMVECs מתווך על ידי E-sel, ולא P-sel, כפי שהודגם על ידי חסימת Ab assay (monolayer אלוטיפ CTR-EC הודגרו עם שליטת אלוטיפ; * p <0.05, בכיוון אחד ANOVA היה בשימוש עם מבחן post hoc-HSD של Tukey, ברים שגיאה מייצגים SEM, n = 3) (ב) ניתוח נתיבים סלולרי מגלה רציף. ומתגלגל חזקים של HL-60 תאים בECs הופעל חסימה לעומת מתגלגל מקוטע, חלש נצפה על חסום-E-sel ECs הופעל (כל צבע מייצג תאים שונים. ניתוח בוצע באמצעות תוכנה מתאימה). (C) HL-60 מתגלגל מהירות על ECs הופעל-TNF-α היא איטית יותר בECs הופעל חסימה בהשוואה לחסום-E-sel ECs המופעל (מאמץ גזירה בשימוש:. 2 dyn / ² סנטימטר * p <0.05, מבחן t, ברים שגיאת שני זנב מזווג מייצגים SEM, n = 17-36 תאים לכל קבוצה)."Target =" _blank www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "> לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

אחד האתגרים המרכזיים בתרגום מוצלח של טיפול מבוסס תאי אקסוגני הוא חוסר היכולת לספק תאים ביעילות לאתרים של פגיעה ודלקת הגבוה engraftment יעילות ^3. מתגלגל תא מייצג שלב קריטי בתהליך של ביות של תאים, להקל על ההאטה של תאים בדפנות כלי דם, סופו של דבר מוביל להידבקות המשרד וגלגולם דרך האנדותל לרקמה ^5. הבנה טובה יותר של התהליך מתגלגל לסוגי תאי מועמד עשויה להוביל לפיתוח של טכניקות כדי לשפר את הביות של תאים ולתרום באופן משמעותי לשיפור טיפול המבוסס על תאים.

PPFC הוא כלי המשמש באופן נרחב כדי לחקור מתגלגלים תא, כמו גם התנהגויות סלולריות אחרות תחת זרימת גזירה. היישום של PPFC לבחינת הידבקות נויטרופילים על האנדותל נחקר לראשונה על ידי לורנס ואח'. ב1987, ומאז produc זמין מסחריts פותחו ^8,9. PPFCs מורכב משתי צלחות שטוחות מופרדות באטם השולט על הממדים של החדר ^7. הצלחת העליונה מכילה זרם ונמל יצוא, אשר באמצעות משאבת מזרק מאפשר טפטוף של ההשעיה התא דרך ^7,8 הקאמרית. יש גם יציאה נוספת המתייחסת ללחץ שלילי (ואקום) כדי לשמור על הצלחות לחצו יחד ^7. למרות זרימת צלחת תאים במקביל היו בשימוש בצורה יעילה כדי לחקור תגובות הסלולר, כוללים גלגול תא, בתנאי זרימת גזירה, יש מספר רב של מגבלות שמפחיתות את האפקטיביות שלה. מגבלה העיקרית של זרימת תאים היא המספר הגבוה של תאים וכמויות גדולות של חומרים כימיים הנדרשים עקב הנפח המת הגדול בתוך מערכת הזרימה ^7. נושא קריטי נוסף הוא הנוכחות של בועות אוויר, אשר יכול בקלות להתעורר במהלך תא זרימת הרכבה, באופן פוטנציאלי פוגע monolayer התא ומצעציפוי בצלחת התחתונה ^22. עם זאת, שינויים נוספים נעשו כדי PPCFs המסורתי לשלב יציאה נוספת על הצלחת העליונה לפעול כמלכודת בועה כדי להקל על הסרת בועות האוויר ^23. הגדרת ניסוי PPFC גם מייגע, ותא הזרימה הוא רגיש לזליגה אם האטם פגום או שלא הורכב בזהירות. לבסוף, יש הבדל בין שיעורי גזירה הרצויות ומיושמים באופן ניסיוני, שתוצאה בטווח צר של ספיקות אחידות. לפי תיאורטי השוואת ארבע PPFCs עם משתנה עמדות כניסה ויציאה, נמצא כי שתי התצורות במתכונת שיעורי גזירה שחרגו משיעורי הגזירה מחושבים על ידי עד 75% ^24. כדי לעשות שימוש חוזר באותו התא מחייב שלבי כביסה זמן רב, ושילוב עם האתגרים שתוארו לעיל, זה הופך את PPFCs די מייגע ותפוקה נמוכה.

במחקר שלנו, השתמשנו p רב גם משולב במלואומערכת מאוחר microfluidic, בהסתמך על זרימת גזירה ^1,2,13 במדויק מבוקרות. צלחת גם microfluidic 48 זה כוללת 24 ערוצים microfluidic, עם כל זוג של בארות סמוכות מחוברים עם ^1,25 ערוץ microfluidic. ניתן לבצע 10-12 מבחני מתגלגלים ב1 שעות, המאפשרים סינון מהיר של מספר תנאי עשרות ביום אחד. ערוצי microfluidic יכולים להיות מצופים בקלות עם מצע חלבון או monolayers תא, ואת האינטראקציה בין התאים של עניין ועל פני השטח ניתן הדמיה באמצעות מיקרוסקופ, שנרכש על ידי מצלמת CCD ונותח על ידי תוכנה תואמת. ניתן להשיג בקלות פרמטרים מרכזיים כגון כימות תא, חישוב של מהירות מתגלגלת וניתוח נתיב מסלול ספציפי כדי לנתח את ההתנהגות מתגלגלת ביעילות על מצעים מרובים ^13. במחקר זה, חוקרים הערכנו את היעילות של מערכת זו בלימוד מתגלגל תא באמצעות HL-60 שורת תאים לוקמיה פרומיילוציטית, "רולים" מבוססים היטב המבטאים מפתחligands מתגלגל, כגון PSGL-1 וSLeX, אשר יחד פועל כligands עמיתו לP-ו-E-sel ^15.26. במתאם עם דיווחים קודמים, תאי HL60 אכן הפגינו התנהגות מתגלגלת חזקה בערוצים microfluidic E-מצופה sel P-ו, עם מהירויות גלגול איטיות של 1-12 מיקרומטר / sec ^14,17-19. HL-60 תאים לא להתגלגל על פני השטח פיברונקטין, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים שהראו כי HL-60 תאים שלא עברו התמיינות אינם מציגים אינטראקציות דבקים עם פיברונקטין ^16. העיצוב של מערכת microfluidic צלחת רב היטב, המאפשר עד 10-12 מבחני / שעה לעומת רק 1-2 מבחני / שעה שניתן לבדוק באמצעות PPFCs, מגביר באופן משמעותי את התפוקה על ידי לפחות 5 פעמים. יתר על כן, PPFCs צריך להיות מחדש ורחץ לפני כל שימוש חוזר, האטה נוספת שיעור ביצוע. בנוסף, הזרימה לשלוט בקלות מאפשרת ביצועים מהירים של ניסויי הגזירה תלויה, אשר לאחר מכן ניתן לנתח בקלות באמצעות תוכנה מתאימה.

בשלב הבא אנו בדקנו את מערכת צלחת רב גם זה על ידי ניתוח אינטראקציות בין HL-60 תאים וECs ציפוי ערוץ microfluidic. ECs ידוע לבטא את P-ו-E-sel במהלך התהליך דלקתי ^5. כדי לספק ECs עם גירוי דלקתי, אנו pretreated עם TNF-α. בעוד E-sel היה מוסדר עד, P-sel לא היה, עולה בקנה אחד עם הספרות המראה כי ECs האדם להביע את E-sel, אבל לא P-sel, בתגובה להפעלת TNF-α שכן אמרגן P-sel קופים חסר TNF -Α אלמנטי תגובה, resulting באינדוקצית תעתיק של רק ^20,21 E-SEL. מצבים דלקתיים ואז היו מדומים בתוך הערוץ על ידי דוגרים monolayer EC עם TNF-α, ואחריו טפטוף של HL-60 תאים לחקור אינטראקציות שלה עם משטח EC. בעוד HL-60 לא אינטראקציה עם ECs הכלא פעיל, הם עשו להציג תגובה חזקה מתגלגלת על TNF-α-הופעל ECS (איור 3 ג), מתואמת עם התגובה שדווחה בספרות ^22. Ab חסימת ניסויים (איור 4 א) ולאחר מכן הראתה כי E-sel, אבל לא P-sel, החסימה הביא לירידה משמעותית בHL-60 מתגלגלת על ECs הופעל. נתונים אלה מראים מעורבות הישירה של E-sel, ולא P-sel, בתיווך המתגלגל של HL-60 על TNF-α-הופעל ECs אדם ^20,21. Ab חסימת ניסויים, לעומת מראה מתגלגלים בתיווך-E-sel על ECs הופעל לעומת תיווך-P-sel מתגלגל על ​​CHO-P, נוסף מאמת את ההיתכנות ואת הרלוונטיות של blocki Abניסויים שבוצעו במהירות ng במערכת microfluidic זה. מעניין לציין, כי עיכוב זה של מתגלגל לא היה שלם (הפחתה כ -70%) המצביעים על כך קולטנים משטח אחרים, כגון VCAM-1, גם להשתתף בHL-60 מתגלגלים על ECs הופעל ^27. ניתוח נתיב מסלול גילה עוד תופעה מעניינת - בעוד הגלגול של HL-60 על ECs הופעל חסימה היה רציף ויציב, המספר הנמוך של תאים שעדיין התגלגל על ​​E-sel חסם הופעל ECs מוצג נתיב מתגלגל מקוטע על ECs החסום ( איור 4). תופעה זו לא נצפתה בECs הודגרו עם חסימת P-sel או שליטת אלוטיפ (מידע לא מוצג). זה מצביע על כך בזמן שתשובה מתגלגלת היא אפשרית באמצעות סמנים אחרים כאשר EC E-sel חסום, מתגלגלים זה מסתמך על אינטראקציות חלשות, חלקיות HL-60-EC, תומך רק תגובה רופפת, חלקית מתגלגלים עם ECs הופעל ^{5,22 ,27-29.} זו נתמכת על ידי הנתונים שמוצגים באיור 4C , הוכחת גלגול איטי יותר באופן משמעותי של HL-60 תאים בECs הופעל חסימה בהשוואה לגלגולם על חסום-E-sel ECs הופעל, מה שמעיד על תגובה חלשה מתגלגל ב E--חסם sel ECS. שימוש במערכת microfluidic צלחת רב גם במקום PPFC אפשר לנו לבצע את ניסויי HL60-ECs העדינים במהירות, תוך שליטה מדויקת זרימת גזירה, הימנעות בועות ורק באמצעות כרכים מינימאליים של שרירי הבטן ותאים. שימוש יתרון של מיקרופלואידיקה עבור יישומים מתגלגלים תא הודגם בעבר ^30-33, ושיפור תפוקה של מיקרופלואידיקה באמצעות מערכת הצלחת רב גם הוצגה כאן, מדגיש עוד יותר את הפוטנציאל של טכנולוגיה זו לצורך הניתוח יעיל ומדויק של מאפיינים מתגלגלים מפתח לקראת שיפור יישומים טיפוליים .

מחקר זה התמקד בבחינה של HL-60 תא מתגלגל על ​​מצעי חלבון וmonolayers תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ומדויק נשלטה באמצעותמערכת microfluidic צלחת רב כן. באופן דומה, יכולים בקלות לשמש סוגי תאים אחרים וmonolayers מצעים / תא האחר כדי ללמוד המאפיינים המתגלגלים שלהם. קלות שימוש וניתוח פשוט מאפשרת ניתוח מדויק של מאפיינים מתגלגלים חשובים וחסימת Ab או הפעלה עם גורמי גדילה שונים או מעכבים יכולה לשמש כדי לחקור את מעורבותו הפוטנציאלית של סמנים מולקולריים בתגובה מתגלגלת. זה עשוי להיות שימושי במיוחד ללימוד מתגלגל בתאי גזע וביות, דבר שעלול להיות מהונדס כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאי גזע ^34-36. חשוב מכך, ניתן לבדוק תנאים מרובים עם תפוקה משופרת (5-10 גבוה פי לעומת PPFCs), המאפשרים לימוד מהיר ויעיל של נכסים מתגלגלים בשל עיצוב הצלחת. מבחני אחרים רלוונטיים לביות תא, כגון הידבקות תא, chemotaxis וגלגול יכולים להיות גם למדו באמצעות מערכת זו ^1,10,13. בסך הכל, מערכת microfluidic זו מתגלה כטכניקה רבת עוצמה כדי לחקור מתגלגלים תא ושלhould לשמש ככלי שימושי כדי לסייע בתרגום הקליני של טיפול מבוסס תאים חיצוניים.

מחברים מצהירים שום ניגוד העניינים.

תאי CHO-P היו מתנת סוג של ד"ר ברברה Furie (ישראל דיקונס מרכז רפואי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק HL095722 לJMK עבודה זו נתמכה גם בחלק סרטן קרן אתגר פרס Movember-ערמונית לJMK ידי