Zebra balığı embriyolarını kullanırken tümör hücrelerinin ilaçlara nasıl tepki verdiğini test etmek için yedi günlük hızlı bir iş akışı geliştirdik. Pediatrik onkolojiye yakın olduğumuz için nadir kanser örneklerine erişimimiz var ve B hücreli öncü lösemi ile başladık, ancak testin klinik ortamda da işe yarayıp yaramayacağını görmek için katı pediatrik tümörler için protokolü şimdi benimsiyoruz. Zebra balığı embriyolarında hasta kaynaklı lösemi hücrelerini başarılı bir şekilde büyütebiliriz, bu da onları müthiş bir klinik öncesi model haline getirir.
Bununla birlikte, farmakokinetiği yanıltıcı olabilir, çünkü bazı ilaçlar biyolojik engelleri aşmak için mücadele eder ve bu nedenle deneylere başlamadan önce penetrasyonu test ettiğimizden emin oluruz. Yaklaşımımız benzersizdir çünkü löseminin greft hücrelerinin daha iyi hayatta kalmasına yardımcı olan doğuştan gelen bağışıklık hücresi farklılaşmasını engeller. Ayrıca, 10 konukçu balıktan oluşan havuzlardaki greft hücrelerinde tek hücre canlılığını ve proliferasyonunu ölçmek için akış sitometrisi kullanıyoruz.
Bu, çok hassas ilaç yanıt verilerine ve büyük istatistiksel güce sahip olmamızı sağlar. Başlamak için, bir mikrodalgada 100 mililitre E3 ortamında% 1 agarozu çözün. Transplantasyon plakası için, yaklaşık 20 mililitre besiyerini 10 santimetrelik bir Petri kabına dökün ve yarıya kadar doldurun.
Sıvıyı eşit şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe döndürün. Morfolino enjeksiyon plakaları için, enjeksiyon kalıbını iki Petri kabındaki sıvı agarozun üzerine yerleştirin ve kabarcık oluşmadığından emin olun. Bulaşıkların üzerini örtmek için kapakları eğin ve agaroz katılaşana kadar oda sıcaklığında bırakın.
Agaroz katılaştıktan sonra, plakaları kapalı bir plastik torba içinde dört santigrat derecede baş aşağı saklayın. Ardından, bir iğne çektirme kullanarak 10 santimetrelik kılcal damarlardan iğneleri oluşturun. Tahmini 10 mikrometre çapa ulaşmak için iğnelerin uçlarını kırın.
Morfolinoları enjekte etmek için, 100 döllenmiş zebra balığı yumurtasından oluşan partileri minimum sıvı ile önceden hazırlanmış enjeksiyon plakasına aktarın. Embriyoları plakanın oluklarına dikkatlice hizalayın. Tek hücreli aşamada 50 mikromolar spi1 ve csf3r morfolinos karışımının bir nanolitresini hücreye veya hücrenin hemen altındaki yumurta sarısı torbasına enjekte edin.
Enjekte edilen yumurtaları gece boyunca 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Üçüncü gün, dekoryonasyonu başlatmak için, bir Pasteur pipeti kullanarak, kalp atışı veya hareket göstermeyen, opak görünen veya düzensiz şekillere sahip ölü embriyoları tabaktan çıkarın. İki hassas forseps kullanarak, koryonu yerinde tutmak için sıkıştırın.
Embriyoyu ikinci bir forseps seti ile sabitlerken forsepsin ucuna yakın bir yere sıkıştırın. Embriyoyu serbest bırakmak için koryonu dikkatlice ayırın. Dekoryonlu embriyoları gece boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.
Başlamak için, penisilin streptomisin veya E3 / P / S ile desteklenmiş E3 ortamı ile doldurulmuş iki adet 10 santimetrelik Petri kabı hazırlayın. Bulaşıkları önceden ısıtmak için 30 dakika boyunca 28 santigrat dereceye yerleştirin. CellTrace Violet veya CTV ile floresan hücre etiketlemesinden sonra, BCP-ALL hücrelerini santrifüjleyin.
Daha sonra istenen hücre konsantrasyonunu elde etmek için PBS ekleyin ve buz üzerinde tutun. Bir mikro yükleyici ucu kullanarak transplantasyon iğnesine dört mikrolitre hücre süspansiyonu yükleyin. Enjeksiyondan en az iki dakika önce embriyoları uyuşturmak için litre başına dört gramlık bir son konsantrasyon elde etmek için E3 / P / S ortamı ve balık embriyoları içeren bir Petri kabına tricaine ekleyin.
Daha sonra, 15 ila 20 dekoryonlu embriyoyu agaroz kaplı bir enjeksiyon kabına aktarın ve embriyoların kaymasını önlemek için fazla sıvıyı alın. Embriyoları enjeksiyon kabına yerleştirin. İğneyi dorsoküde yönden 45 derecelik bir açıyla sokarak, perikardiyal boşluğa yaklaşık 1.000 CTV-pozitif BCP-ALL hücresi enjekte edin.
15 ila 20 embriyo enjekte edildikten sonra, bunları E3 / P / S ortamı ile doldurulmuş önceden ısıtılmış Petri kabına aktarın. Hem nakledilen embriyoları hem de nakledilmeyen kontrolleri 28 santigrat derecede bir ila üç saat boyunca inkübe edin. Floresan stereo mikroskop altında, başarılı bir aşılamayı doğrulamak için embriyoları tarayın ve yumurta sarısının sağlam olduğundan emin olun.
96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre E3 / P / S ortamı ve% 0.5 DMSO ekleyin. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, aşılanmış embriyoyu mümkün olduğunca az E3 ortamı ile alın. Embriyonun pipet ucunun dibine batmasını sağlamak için pipeti eğin ve kılcal kuvvetler kullanarak kuyuya bırakın.
96 oyuklu plakanın 24 kuyusunu 100 mikrolitre araç kontrol solüsyonu veya iki kez konsantre venetoclax solüsyonu ile doldurun. Embriyoları, nakledilmeyen embriyolar da dahil olmak üzere 72 saat boyunca 35 santigrat derecede tutun. Üçüncü günün sonunda, aşılanmış zebra balığı embriyolarını içeren 96 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın.
Sağlıklı zebra balığı embriyolarını tanımlamak ve seçmek için stereo mikroskopi kullanarak plakayı tarayın. Her koşuldan 10 konakçı embriyoyu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne rastgele bir araya getirin, ideal olarak koşul başına iki tüp ile sonuçlanır. Her tüpten mümkün olduğunca fazla sıvı alın.
Her tüpe 500 mikrolitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ekleyin. Embriyoları ve greft hücrelerini, yaklaşık 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 200 mikrolitrelik bir mikropipet ucu kullanarak ezme yoluyla mekanik olarak ayırın. Doku parçalarını peletlemek için tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 350 g'da santrifüjleyin.
FACS tüplerini, koşul başına iki mililitre PBS içeren 35 mikrometre ince gözenekli filtre süzgeci kapağı ile hazırlayın. Daha sonra peleti 500 mikrolitre enzim karışımında tekrar süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, doku kaybını önlemek için her tüp için aynı pipet ucunu kullanarak karışımı her beş dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin.
Ayrışan hücreleri, FACS tüplerinin 35 mikrometre ince gözenekli filtre süzgeç kapağına aktarın. Tüpü 350 g'da beş dakika santrifüjleyin. Toplam greft hücresi sayısını değerlendirmek için akış sitometrisi analizi yapın.
CTV ve CD19 boyanmış 3dpi kültür hücreleri ile veri analizine başlayın. Sinyalin örtüştüğünden emin olmak ve çift lekeli kanser hücrelerinin varlığını doğrulamak için CD19 ve CTV ile bir nokta grafiği oluşturun. Ardından, sağlam hücreleri döküntülerden ayırt etmek için FSC-A ve SSC-A ile bir nokta grafiği oluşturun.
Ardından, tek hücreleri tanımlamak için SSC-A ve SSC-H ile yeni bir çizim oluşturmak için sağlam hücre popülasyonunu kullanın. Hücreleri dört popülasyona ayırmak için tek hücre popülasyonunu kullanarak 7AAD ve Annexin V ile bir nokta grafiği oluşturun. Aşılanmış bir zebra balığının dosyasını açın.
CTV ve CD19 ile bir nokta grafiği kullanarak insan greft hücrelerini konak hücrelerden ayırın. CTV, CD19 çift pozitif greft hücrelerini tanımlayın ve izole edin. 3dpi kültür hücreleri için açıklanan aynı geçit stratejisini kopyalayın ve greft hücresi popülasyonuna uygulayın.
Tüm Annexin V ve 7AAD negatif hücre popülasyonlarını, x ekseninde CTV değerleri olan bir histogramda birleştirin. Proliferasyon oranlarını belirlemek için beş numunenin tümü için geometrik ortalamayı hesaplayın. Akış sitometrisi verileri, zebra balığı embriyolarında aşılanan taze BCP-ALL tek hücrelerinin, üç gün sonra% 95.2 canlılığa sahip olduğunu, çanak kültürlenmiş hücrelerin% 61.9 canlılığından 1.5 kat daha yüksek olduğunu gösterdi.
Hem in vivo hem de in vitro koşullarda CTV floresan yoğunluğu, üç gün boyunca benzer şekilde azaldı ve bu da karşılaştırılabilir hücre bölünme oranlarını gösterdi. Üç gün sonra embriyo başına sağlam greft hücreleri, her havuzda ölçüldü ve bu da tutarlı bir aşılamayı gösterdi.
