Nous avons mis au point un flux de travail rapide de sept jours pour tester comment les cellules tumorales réagissent aux médicaments en utilisant des embryons de poisson-zèbre. Étant proche de l’oncologie pédiatrique, nous avons accès à des échantillons de cancer rares, et nous avons commencé avec la leucémie à précurseurs à cellules B, mais nous adoptons maintenant le protocole pour les tumeurs pédiatriques solides afin de voir si le test fonctionnerait également dans un cadre clinique. Nous pouvons cultiver avec succès des cellules leucémiques dérivées de patients dans des embryons de poisson-zèbre, ce qui en fait un excellent modèle préclinique.
Cependant, la pharmacocinétique peut être délicate, car certains médicaments ont du mal à traverser les barrières biologiques, et nous nous assurons donc de tester la pénétration avant de commencer les expériences. Notre approche est unique car elle bloque la différenciation des cellules immunitaires innées, ce qui aide les cellules greffées de la leucémie à mieux survivre. De plus, nous utilisons la cytométrie en flux pour mesurer la viabilité et la prolifération d’une seule cellule dans les cellules greffées dans des groupes de 10 poissons hôtes.
Cela nous permet d’avoir des données très précises sur la réponse aux médicaments et une grande puissance statistique. Pour commencer, dissolvez 1 % d’agarose dans 100 millilitres de milieu E3 au micro-ondes. Pour la plaque de transplantation, versez environ 20 millilitres de milieu dans une boîte de Pétri de 10 centimètres, en la remplissant à moitié.
Tournez doucement la plaque pour répartir uniformément le liquide. Pour les plaques d’injection morpholino, placez le moule d’injection sur l’agarose liquide dans deux boîtes de Pétri, en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forme. Inclinez les couvercles pour couvrir la vaisselle et laissez-les à température ambiante jusqu’à ce que l’agarose se solidifie.
Une fois que l’agarose s’est solidifiée, conservez les assiettes à l’envers à quatre degrés Celsius dans un sac en plastique scellé. Ensuite, générez les aiguilles à partir de capillaires de 10 centimètres à l’aide d’un extracteur d’aiguille. Cassez les pointes des aiguilles pour obtenir un diamètre estimé à 10 micromètres.
Pour injecter les morpholinos, transférez des lots de 100 œufs de poisson-zèbre fécondés avec un minimum de liquide dans la plaque d’injection préalablement préparée. Alignez soigneusement les embryons dans les rainures de la plaque. Injectez un nanolitre d’un mélange de 50 micromolaires de morpholinos spi1 et csf3r dans la cellule ou le sac vitellin juste en dessous de la cellule pendant le stade unicellulaire.
Incuber les œufs injectés à 28 degrés Celsius pendant la nuit. Le troisième jour, pour initier la déchorionation, à l’aide d’une pipette Pasteur, retirez de la boîte tous les embryons morts qui ne montrent aucun battement de cœur ou mouvement, qui semblent opaques ou qui ont des formes irrégulières. À l’aide de deux pinces de précision, pincez le chorion pour le maintenir en place.
Pincez près de l’extrémité de la pince tout en fixant l’embryon avec une deuxième paire de pinces. Séparez délicatement le chorion pour libérer l’embryon. Incuber des embryons déchoionnés à 28 degrés Celsius pendant la nuit.
Pour commencer, préparez deux boîtes de Pétri de 10 centimètres remplies de milieu E3 complété par de la pénicilline, de la streptomycine ou de l’E3/P/S. Placez les plats à 28 degrés Celsius pendant 30 minutes pour les préchauffer. Après le marquage des cellules fluorescentes avec CellTrace Violet, ou CTV, centrifugez les cellules BCP-ALL.
Ajoutez ensuite du PBS pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée et maintenez-le sur de la glace. Chargez quatre microlitres de suspension cellulaire dans l’aiguille de transplantation à l’aide d’une pointe de microchargeur. Ajoutez de la tricaïne dans une boîte de Pétri avec un milieu E3/P/S et des embryons de poisson pour obtenir une concentration finale de quatre grammes par litre pour anesthésier les embryons pendant au moins deux minutes avant l’injection.
Ensuite, transférez 15 à 20 embryons déchorionnés dans une boîte d’injection enrobée d’agarose et retirez l’excès de liquide pour éviter que les embryons ne glissent. Disposez les embryons sur la boîte d’injection. En introduisant l’aiguille à un angle de 45 degrés par rapport à la direction dorso-caudale, injectez environ 1 000 cellules BCP-ALL positives au CTV dans la cavité péricardique.
Une fois les 15 à 20 embryons injectés, transférez-les dans la boîte de Pétri préchauffée remplie de milieu E3/P/S. Incuber les embryons transplantés et les témoins non transplantés à 28 degrés Celsius pendant une à trois heures. À l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence, examinez les embryons pour confirmer la réussite de la greffe et assurez-vous que le jaune est intact.
Ajouter 100 microlitres de milieu E3/P/S et 0,5 % de DMSO dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélevez l’embryon greffé avec le moins de milieu E3 possible. Inclinez la pipette pour permettre à l’embryon de couler au fond de la pointe de la pipette et relâchez-le dans le puits en utilisant les forces capillaires.
Remplissez 24 puits de la plaque de 96 puits avec 100 microlitres de solution de contrôle du véhicule ou deux solutions concentrées de vénétoclax. Maintenez les embryons à 35 degrés Celsius pendant 72 heures, y compris les embryons non transplantés comme témoins. À la fin du troisième jour, retirez de l’incubateur la plaque de 96 puits contenant les embryons de poisson-zèbre greffés.
Examinez la plaque à l’aide de la stéréomicroscopie pour identifier et sélectionner des embryons de poisson-zèbre sains. Combinez au hasard 10 embryons hôtes de chaque condition dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, ce qui donne idéalement deux tubes par condition. Retirez autant de liquide que possible de chaque tube.
Ajoutez 500 microlitres de HBSS sans calcium ni magnésium dans chaque tube. Dissocier mécaniquement les embryons et les cellules greffées par trituration à l’aide d’une pointe de micropipette de 200 microlitres, en pipetant de haut en bas environ 15 fois. Centrifugez les tubes à 350 g pendant cinq minutes à température ambiante pour granuler les fragments de tissu.
Préparez des tubes FACS avec un capuchon de filtre à mailles fines de 35 micromètres contenant deux millilitres de PBS par condition. Ensuite, mettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de mélange d’enzymes et incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, pipetez le mélange de haut en bas toutes les cinq minutes en utilisant la même pointe de pipette pour chaque tube afin d’éviter la perte de tissu.
Transférez les cellules dissociées dans le capuchon de filtre à mailles fines de 35 micromètres des tubes FACS. Centrifugez le tube à 350 g pendant cinq minutes. Effectuer une analyse par cytométrie en flux pour évaluer le nombre total de cellules greffées.
Démarrez l’analyse des données avec les cellules de culture 3dpi colorées CTV et CD19. Créez un diagramme à points avec CD19 et CTV pour vous assurer que le signal se chevauche et pour confirmer la présence des cellules cancéreuses doublement colorées. Ensuite, créez un graphique à points avec FSC-A et SSC-A pour distinguer les cellules intactes des débris.
Ensuite, utilisez la population de cellules intactes pour créer un nouveau graphique avec SSC-A et SSC-H afin d’identifier les cellules individuelles. Créez un diagramme à points avec 7AAD et Annexine V en utilisant la population de cellules uniques pour distinguer les cellules en quatre populations. Ouvrez le fichier d’un poisson-zèbre greffé.
Séparez les cellules greffées humaines des cellules hôtes à l’aide d’un diagramme à points avec CTV et CD19. Identifier et isoler les cellules greffées CTV, CD19 double positive. Copiez et appliquez la même stratégie de contrôle décrite pour les cellules de culture 3 dpi à la population de cellules greffées.
Fusionnez toutes les populations de cellules négatives Annexine V et 7AAD dans un histogramme avec des valeurs CTV sur l’axe des x. Calculez la moyenne géométrique des cinq échantillons pour déterminer les taux de prolifération. Les données de cytométrie en flux ont montré que les cellules uniques fraîches de BCP-ALL greffées dans des embryons de poisson-zèbre avaient une viabilité de 95,2 % après trois jours, soit 1,5 fois plus élevée que la viabilité de 61,9 % des cellules cultivées en boîte.
L’intensité de la fluorescence CTV dans des conditions in vivo et in vitro a diminué de manière similaire sur trois jours, indiquant des taux de division cellulaire comparables. Les cellules greffées intactes par embryon après trois jours ont été quantifiées dans chaque pool, indiquant une greffe cohérente.
