Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro rapido di sette giorni per testare come le cellule tumorali rispondono ai farmaci utilizzando embrioni di zebrafish. Essendo vicini all'oncologia pediatrica, abbiamo accesso a campioni di cancro rari e abbiamo iniziato con la leucemia precursore delle cellule B, ma ora stiamo adottando il protocollo per i tumori pediatrici solidi per vedere se il test funzionerebbe anche in ambito clinico. Siamo in grado di far crescere con successo cellule leucemiche derivate da pazienti in embrioni di zebrafish, il che li rende un modello preclinico formidabile.
Tuttavia, la farmacocinetica può essere complicata, poiché alcuni farmaci faticano a superare le barriere biologiche e quindi ci assicuriamo di testare la penetrazione prima di iniziare gli esperimenti. Il nostro approccio è unico perché blocca la differenziazione delle cellule immunitarie innate, che aiuta le cellule del trapianto della leucemia a sopravvivere meglio. Inoltre, stiamo utilizzando la citometria a flusso per misurare la vitalità e la proliferazione di singole cellule in cellule di innesto in pool di 10 pesci ospiti.
Questo ci permette di avere dati molto precisi sulla risposta ai farmaci e una grande potenza statistica. Per iniziare, sciogliere l'1% di agarosio in 100 millilitri di terreno E3 in un forno a microonde. Per la piastra di trapianto, versare circa 20 millilitri di terreno in una capsula di Petri da 10 centimetri, riempiendola a metà.
Agitare delicatamente il piatto per distribuire uniformemente il liquido. Per le piastre di iniezione del morfolino, posizionare lo stampo a iniezione sull'agarosio liquido in due piastre di Petri, assicurandosi che non si formino bolle. Inclinare i coperchi per coprire i piatti e lasciarli a temperatura ambiente fino a quando l'agarosio non si solidifica.
Una volta che l'agarosio si è solidificato, conservare le piastre capovolte a quattro gradi Celsius in un sacchetto di plastica sigillato. Successivamente, generare gli aghi da capillari di 10 centimetri utilizzando un estrattore di aghi. Rompere le punte degli aghi per ottenere un diametro stimato di 10 micrometri.
Per iniettare i morfolini, trasferire lotti di 100 uova fecondate di zebrafish con una quantità minima di liquido nella piastra di iniezione precedentemente preparata. Allineare accuratamente gli embrioni nelle scanalature della piastra. Iniettare un nanolitro di una miscela da 50 micromolari di morfolini spi1 e csf3r nella cellula o nel sacco vitellino appena sotto la cellula durante lo stadio di una cellula.
Incubare le uova iniettate a 28 gradi Celsius durante la notte. Il terzo giorno, per iniziare la decorioizzazione, utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere dal piatto gli embrioni morti che non mostrano battito cardiaco o movimento, appaiono opachi o hanno forme irregolari. Usando due pinze di precisione, pizzica il corion per tenerlo in posizione.
Pizzica vicino alla punta della pinza mentre assicuri l'embrione con una seconda serie di pinze. Separare con cautela il corion per rilasciare l'embrione. Incubare gli embrioni dechorionati a 28 gradi Celsius durante la notte.
Per iniziare, prepara due piastre di Petri da 10 centimetri riempite con terreno E3 integrato con penicillina streptomicina o E3/P/S. Posizionare le stoviglie a 28 gradi Celsius per 30 minuti per preriscaldarle. Dopo la marcatura cellulare fluorescente con CellTrace Violet, o CTV, centrifugare le cellule BCP-ALL.
Quindi aggiungere PBS per ottenere la concentrazione cellulare desiderata e mantenerla in ghiaccio. Caricare quattro microlitri di sospensione cellulare nell'ago da trapianto utilizzando una punta per microcaricatore. Aggiungere la tricaina a una capsula di Petri con terreno E3/P/S e gli embrioni di pesce per raggiungere una concentrazione finale di quattro grammi per litro per anestetizzare gli embrioni per almeno due minuti prima dell'iniezione.
Successivamente, trasferisci da 15 a 20 embrioni dechorionati su una piastra per iniezione rivestita di agarosio e rimuovi il liquido in eccesso per evitare che gli embrioni scivolino. Disporre gli embrioni sulla piastra per l'iniezione. Introducendo l'ago con un angolo di 45 gradi rispetto alla direzione dorso-caudale, iniettare circa 1.000 cellule BCP-ALL CTV-positive nella cavità pericardica.
Una volta iniettati i 15-20 embrioni, trasferirli nella capsula di Petri preriscaldata riempita con terreno E3/P/S. Incubare sia gli embrioni trapiantati che i controlli non trapiantati a 28 gradi Celsius per una o tre ore. Sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza, esamina gli embrioni per confermare l'attecchimento riuscito e assicurarti che il tuorlo sia intatto.
Aggiungere 100 microlitri di terreno E3/P/S e 0,5% di DMSO a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Utilizzando una pipetta di vetro Pasteur, prelevare l'embrione innestato con la minor quantità possibile di terreno E3. Inclinare la pipetta per consentire all'embrione di affondare sul fondo della punta della pipetta e rilasciarla nel pozzetto usando la forza capillare.
Riempire 24 pozzetti della piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri della soluzione di controllo del veicolo o di soluzioni concentrate due volte di venetoclax. Mantenere gli embrioni a 35 gradi Celsius per 72 ore, compresi gli embrioni non trapiantati come controlli. Alla fine del terzo giorno, rimuovere dall'incubatrice la piastra a 96 pozzetti contenente gli embrioni di zebrafish trapiantati.
Screening della piastra mediante stereomicroscopia per identificare e selezionare embrioni sani di zebrafish. Raggruppa casualmente 10 embrioni ospiti di ciascuna condizione in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri, ottenendo idealmente due provette per condizione. Rimuovere quanto più liquido possibile da ogni tubo.
Aggiungere 500 microlitri di HBSS senza calcio e magnesio in ogni provetta. Dissociare meccanicamente gli embrioni e le cellule del trapianto mediante triturazione utilizzando un puntale per micropipetta da 200 microlitri, pipettando su e giù circa 15 volte. Centrifugare le provette a 350 g per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettare i frammenti di tessuto.
Preparare le provette FACS con un tappo del filtro a maglia fine da 35 micrometri contenente due millilitri di PBS per condizione. Quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di miscela enzimatica e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, pipettare la miscela su e giù ogni cinque minuti utilizzando lo stesso puntale per pipetta per ogni provetta per evitare la perdita di tessuto.
Trasferire le cellule dissociate nel tappo del filtro a maglia fine da 35 micrometri delle provette FACS. Centrifugare la provetta a 350 g per cinque minuti. Condurre l'analisi della citometria a flusso per valutare il numero totale di cellule del trapianto.
Iniziate l'analisi dei dati con le cellule di coltura colorate con CTV e CD19 a 3dpi. Crea un grafico a punti con CD19 e CTV per assicurarti che il segnale si sovrapponga e per confermare la presenza delle cellule tumorali a doppia colorazione. Quindi, crea un grafico a punti con FSC-A e SSC-A per distinguere le cellule intatte dai detriti.
Quindi utilizzare la popolazione cellulare intatta per creare un nuovo grafico con SSC-A e SSC-H per identificare le singole cellule. Crea un grafico a punti con 7AAD e Annexin V utilizzando la popolazione di singole cellule per distinguere le cellule in quattro popolazioni. Apri il file di un pesce zebra innestato.
Separare le cellule del trapianto umano dalle cellule ospiti utilizzando un grafico a punti con CTV e CD19. Identificare e isolare le cellule del trapianto CTV, CD19 doppio positivo. Copiare e applicare la stessa strategia di gating descritta per le cellule di coltura a 3 dpi alla popolazione di cellule del trapianto.
Unire tutte le popolazioni cellulari negative all'annessina V e 7AAD in un istogramma con i valori CTV sull'asse x. Calcolare la media geometrica per tutti e cinque i campioni per determinare i tassi di proliferazione. I dati della citometria a flusso hanno mostrato che le singole cellule BCP-ALL fresche trapiantate in embrioni di zebrafish avevano una vitalità del 95,2% dopo tre giorni, 1,5 volte superiore alla vitalità del 61,9% delle cellule coltivate in piatto.
L'intensità della fluorescenza CTV sia in vivo che in vitro è diminuita in modo simile nell'arco di tre giorni, indicando tassi di divisione cellulare comparabili. Le cellule del trapianto intatte per embrione dopo tre giorni sono state quantificate in ciascun pool, indicando un attecchimento costante.
