Мы разработали быстрый семидневный рабочий процесс, чтобы проверить, как опухолевые клетки реагируют на лекарства при использовании эмбрионов рыбок данио. Поскольку мы близки к детской онкологии, у нас есть доступ к редким образцам рака, и мы начали с лейкемии-предшественника B-клеток, но сейчас мы принимаем протокол для солидных детских опухолей, чтобы увидеть, будет ли этот анализ работать и в клинических условиях. Мы можем успешно выращивать клетки лейкемии, полученные от пациентов, в эмбрионах рыбок данио, что делает их потрясающей доклинической моделью.
Тем не менее, фармакокинетика может быть сложной, поскольку некоторые лекарства с трудом преодолевают биологические барьеры, и поэтому мы обязательно проверяем проникновение, прежде чем начинать эксперименты. Наш подход уникален тем, что он блокирует дифференцировку клеток врожденного иммунитета, что помогает трансплантатам лейкемии лучше выживать. Кроме того, мы используем проточную цитометрию для измерения жизнеспособности и пролиферации одиночных клеток в привитых клетках в бассейнах из 10 рыб-хозяев.
Это позволяет нам иметь очень точные данные о реакции на лекарства и большую статистическую мощность. Для начала растворите 1%-ную агарозу в 100 миллилитрах среды Е3 в микроволновой печи. Для рассадной тарелки насыпьте в 10-сантиметровую чашку Петри около 10 миллилитров среды, заполнив ее наполовину.
Аккуратно покрутите пластину, чтобы равномерно распределить жидкость. Для инъекционных пластин морфолино поместите форму для литья под давлением на жидкую агарозу в двух чашках Петри, чтобы не образовываться пузырьки. Наклоните крышки, чтобы накрыть посуду, и оставьте ее при комнатной температуре, пока агароза не застынет.
Как только агароза застынет, храните пластины вверх дном при температуре четыре градуса Цельсия в герметичном пластиковом пакете. Далее сгенерируйте иглы из 10-сантиметровых капилляров с помощью иглосъемника. Отломайте кончики игл, чтобы достичь предполагаемого диаметра 10 микрометров.
Чтобы ввести морфолино, переложите партии из 100 оплодотворенных икринок данио с минимальным количеством жидкости в заранее подготовленную инъекционную пластину. Аккуратно выровняйте зародыши в бороздках пластины. Введите один нанолитр 50 микромолярной смеси морфолино spi1 и csf3r в клетку или желточный мешок непосредственно под клеткой на одноклеточной стадии.
Инкубируйте введенные яйца при температуре 28 градусов Цельсия в течение ночи. На третий день, чтобы начать дехорионацию, с помощью пастеровской пипетки удалите все мертвые эмбрионы, которые не показывают сердцебиения или движения, кажутся непрозрачными или имеют неправильную форму. С помощью двух прецизионных щипцов зажмите хорион, чтобы удержать его на месте.
Зажмите возле кончика щипцов, фиксируя эмбрион вторым комплектом щипцов. Осторожно раздвиньте хорион, чтобы выпустить эмбрион. Инкубируйте дехорионированные эмбрионы при температуре 28 градусов Цельсия в течение ночи.
Для начала приготовьте две 10-сантиметровые чашки Петри, наполненные средой Е3 с добавлением пенициллина стрептомицина или Е3//С. Поставьте посуду при температуре 28 градусов Цельсия на 30 минут для предварительного прогревания. После флуоресцентного мечения клеток с помощью CellTrace Violet или CTV центрифугируйте клетки BCP-ALL.
Затем добавьте PBS для достижения нужной концентрации клеток и держите их на льду. Загрузите четыре микролитра клеточной суспензии в иглу для трансплантации с помощью наконечника микрозагрузчика. Добавьте трикаин в чашку Петри со средой E3/P/S и эмбрионами рыбы до достижения конечной концентрации четырех граммов на литр для обезболивания эмбрионов в течение как минимум двух минут перед инъекцией.
Затем перенесите от 15 до 20 дехорионированных эмбрионов в чашку для инъекций, покрытую агарозой, и удалите лишнюю жидкость, чтобы предотвратить соскальзывание эмбрионов. Разложите эмбрионы на чашке для инъекций. Вводя иглу под углом 45 градусов от дорсокаудального направления, введите примерно 1000 CTV-положительных клеток BCP-ALL в полость перикарда.
После того, как от 15 до 20 эмбрионов будут введены, перенесите их в предварительно подогретую чашку Петри, заполненную средой E3/P/S. Инкубируйте как трансплантированные, так и нетрансплантированные контрольные эмбрионы при температуре 28 градусов Цельсия в течение одного-трех часов. Под флуоресцентным стереомикроскопом проведите скрининг эмбрионов, чтобы подтвердить успешное приживление и убедиться, что желток не поврежден.
Добавьте 100 микролитров среды E3/P/S и 0,5% ДМСО в каждую лунку 96-луночного планшета. С помощью стеклянной пастеровской пипетки возьмите прижившийся эмбрион с минимальным количеством среды Е3. Наклоните пипетку, чтобы позволить эмбриону опуститься на дно наконечника пипетки, и выпустите его в лунку с помощью капиллярных сил.
Заполните 24 лунки из 96-луночной пластины 100 микролитрами либо раствора для управления транспортным средством, либо двукратно концентрированными растворами венетоклакса. Поддерживайте эмбрионы при температуре 35 градусов Цельсия в течение 72 часов, включая нетрансплантированные эмбрионы в качестве контрольной группы. В конце третьего дня извлеките из инкубатора 96-луночную пластину, содержащую приживленные эмбрионы данио-рерио.
Проведите скрининг планшета с помощью стереомикроскопии, чтобы идентифицировать и отобрать здоровые эмбрионы рыбок данио. Случайным образом объедините 10 эмбрионов хозяина из каждого состояния в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, в идеале получив две пробирки на одно состояние. Удалите как можно больше жидкости из каждой трубки.
Добавьте в каждую трубку по 500 микролитров HBSS без кальция и магния. Механически диссоциируйте эмбрионы и клетки трансплантата путем растирания с помощью наконечника микропипетки объемом 200 микролитров, пипетируя вверх и вниз примерно 15 раз. Центрифугируйте пробирки при 350 г в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать фрагменты ткани.
Подготовьте пробирки FACS с мелкоячеистым фильтрующим колпачком 35 микрометров, содержащим два миллилитра PBS на одно условие. Затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах ферментной смеси и выдержите 15 минут при комнатной температуре. Во время инкубации пипетируйте смесь вверх и вниз каждые пять минут, используя один и тот же наконечник пипетки для каждой пробирки, чтобы избежать потери тканей.
Перенесите диссоциированные ячейки в мелкоячеистый фильтрующий колпачок 35 микрометров пробирок FACS. Центрифугируйте пробирку при 350 г в течение пяти минут. Провести анализ проточной цитометрии для оценки общего количества клеток трансплантата.
Начните анализ данных с культуральных клеток, окрашенных CTV и CD19 с разрешением 3 точки. Создайте точечную диаграмму с CD19 и CTV, чтобы убедиться в перекрытии сигнала и подтвердить наличие раковых клеток с двойным окрашиванием. Затем создайте точечную диаграмму с FSC-A и SSC-A, чтобы отличить неповрежденные клетки от мусора.
Затем используйте популяцию интактных клеток для создания нового графика с SSC-A и SSC-H для идентификации отдельных клеток. Создайте точечную диаграмму с 7AAD и аннексином V, используя популяцию отдельных клеток, чтобы разделить клетки на четыре популяции. Откройте файл прижившейся рыбки данио.
Отделите человеческие трансплантаты от клеток хозяина с помощью точечной диаграммы с CTV и CD19. Идентификация и выделение CTV, CD19 двойных положительных клеток трансплантата. Скопируйте и примените ту же стратегию гейтирования, которая описана для культуральных клеток с разрешением 3 DPI, к популяции клеток трансплантата.
Объедините все популяции отрицательных клеток Аннексина V и 7AAD в гистограмму со значениями CTV по оси x. Рассчитайте среднее геометрическое для всех пяти образцов, чтобы определить темпы распространения. Данные проточной цитометрии показали, что свежие одиночные клетки BCP-ALL, привитые эмбрионам рыбок данио, имели 95,2% жизнеспособности через три дня, что в 1,5 раза выше, чем 61,9% жизнеспособности клеток, культивируемых в чашке.
Интенсивность флуоресценции CTV как in vivo, так и in vitro снижалась одинаково в течение трех дней, что указывает на сопоставимые скорости деления клеток. Количество интактных клеток трансплантата на эмбрион через три дня было количественно определено в каждом пуле, что указывает на последовательное приживление.
