لقد طورنا سير عمل سريعا لمدة سبعة أيام لاختبار كيفية استجابة الخلايا السرطانية للأدوية باستخدام أجنة الزرد. نظرا لكوننا قريبين من أورام الأطفال ، فلدينا إمكانية الوصول إلى عينات السرطان النادرة ، وبدأنا بسرطان الدم السلائف للخلايا البائية ، لكننا نعتمد البروتوكول الآن لأورام الأطفال الصلبة لمعرفة ما إذا كان الاختبار سيعمل في بيئة سريرية أيضا. يمكننا أن ننجح في زراعة خلايا سرطان الدم المشتقة من المريض في أجنة الزرد ، مما يجعلها نموذجا رائعا قبل السريرية.
ومع ذلك ، يمكن أن تكون الحركية الدوائية صعبة ، لأن بعض الأدوية تكافح لعبور الحواجز البيولوجية ، وبالتالي نتأكد من اختبار الاختراق قبل أن نبدأ التجارب. نهجنا فريد من نوعه لأنه يمنع تمايز الخلايا المناعية الفطرية ، مما يساعد خلايا الكسب غير المشروع لسرطان الدم على البقاء على قيد الحياة بشكل أفضل. بالإضافة إلى ذلك ، نستخدم قياس التدفق الخلوي لقياس صلاحية الخلية المفردة وتكاثرها في خلايا الكسب غير المشروع في تجمعات مكونة من 10 أسماك مضيفة.
هذا يسمح لنا بالحصول على بيانات استجابة دوائية دقيقة للغاية وقوة إحصائية كبيرة. للبدء ، قم بإذابة 1٪ agarose في 100 مل من وسط E3 في الميكروويف. بالنسبة للوحة الزرع ، اسكب حوالي 20 مل من الوسط في طبق بتري بطول 10 سم ، واملأه في منتصف الطريق.
قم بتدوير الطبق برفق لتوزيع السائل بالتساوي. بالنسبة لألواح حقن المورفولينو ، ضع قالب الحقن على سائل الاغاروز في طبقين من بتري ، مع ضمان عدم تكوين فقاعات. قم بإمالة الأغطية لتغطية الأطباق واتركها في درجة حرارة الغرفة حتى يتجمد الاغاروز.
بمجرد أن تصلب الاغاروز ، قم بتخزين الأطباق رأسا على عقب عند أربع درجات مئوية في كيس بلاستيكي محكم الغلق. بعد ذلك ، قم بإنشاء الإبر من الشعيرات الدموية 10 سم باستخدام مجتذب إبرة. اقطع أطراف الإبر لتحقيق قطر يقدر ب 10 ميكرومتر.
لحقن المورفولينوس ، قم بنقل دفعات من 100 بيضة من سمكة الزرد المخصبة مع الحد الأدنى من السائل إلى لوحة الحقن المعدة مسبقا. قم بمحاذاة الأجنة بعناية في أخاديد اللوحة. حقن نانولتر واحد من مزيج 50 ميكرومولار من spi1 و csf3r morpholinos في الخلية أو كيس الصفار أسفل الخلية مباشرة خلال مرحلة الخلية الواحدة.
احتضان البيض المحقون عند 28 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم الثالث ، لبدء التفكيك ، باستخدام ماصة باستور ، قم بإزالة أي أجنة ميتة لا تظهر أي نبضات قلب أو حركة ، أو تبدو معتمة ، أو لها أشكال غير منتظمة من الطبق. باستخدام ملقطين دقيقين ، اضغط على المشيمة لتثبيتها في مكانها.
قرصة بالقرب من طرف الملقط مع تأمين الجنين بمجموعة ثانية من الملقط. اسحب المشيمة بعناية لتحرير الجنين. احتضان الأجنة المفككة عند 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
للبدء ، قم بإعداد طبقين من بتري بطول 10 سم مملوءين بوسط E3 مكمل بستربتومايسين البنسلين أو E3 / P / S. ضع الأطباق على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتسخينها مسبقا. بعد وضع العلامات على الخلايا الفلورية باستخدام CellTrace Violet ، أو CTV ، قم بالطرد المركزي لخلايا BCP-ALL.
ثم أضف PBS لتحقيق تركيز الخلية المطلوب والاحتفاظ بها على الجليد. قم بتحميل أربعة ميكرولترات من تعليق الخلية في إبرة الزرع باستخدام طرف اللودر الدقيق. أضف التريكيين إلى طبق بتري مع وسط E3 / P / S وأجنة الأسماك لتحقيق تركيز نهائي يبلغ أربعة جرامات لكل لتر لتخدير الأجنة لمدة دقيقتين على الأقل قبل الحقن.
بعد ذلك ، انقل 15 إلى 20 جنينا ممزقا إلى طبق حقن مغطى بالأغروز وانزع السوائل الزائدة لمنع الأجنة من الانزلاق. رتب الأجنة على طبق الحقن. إدخال الإبرة بزاوية 45 درجة من الاتجاه الذيلي الظهري ، قم بحقن ما يقرب من 1,000 خلية BCP-ALL إيجابية CTV في تجويف التامور.
بمجرد حقن 15 إلى 20 جنينا ، انقلها إلى طبق بتري الدافئ مسبقا المملوء بوسط E3 / P / S. احتضان كل من الأجنة المزروعة والضوابط غير المزروعة عند 28 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات. تحت مجهر ستيريو فلوري ، قم بفحص الأجنة لتأكيد النقش الناجح والتأكد من أن صفار البيض سليم.
أضف 100 ميكرولتر من E3 / P / S المتوسط و 0.5٪ DMSO إلى كل بئر من لوحة 96 بئر. باستخدام ماصة باستور زجاجية ، التقط الجنين المطعمة بأقل قدر ممكن من وسط E3. قم بإمالة الماصة للسماح للجنين بالغرق في قاع طرف الماصة وإطلاقه في البئر باستخدام قوى الشعيرات الدموية.
املأ 24 بئرا من لوحة البئر 96 ب 100 ميكرولتر إما من محلول التحكم في السيارة أو المحاليل المركزة مرتين من الفينيتوكلاكس. حافظ على الأجنة عند 35 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ، بما في ذلك الأجنة غير المزروعة كعناصر تحكم. في نهاية اليوم الثالث ، قم بإزالة صفيحة البئر 96 التي تحتوي على أجنة أسماك الزرد المطعمة من الحاضنة.
فحص اللوحة باستخدام الفحص المجهري المجسم لتحديد واختيار أجنة أسماك الزرد السليمة. قم بتجميع 10 أجنة مضيفة بشكل عشوائي من كل حالة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، مما ينتج عنه أنبوبان من الناحية المثالية لكل حالة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من كل أنبوب.
أضف 500 ميكرولتر من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم إلى كل أنبوب. قم بفصل الأجنة وخلايا الكسب غير المشروع ميكانيكيا عن طريق الخلية باستخدام طرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر ، مع سحب العينات لأعلى ولأسفل 15 مرة تقريبا. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 350 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكسير شظايا الأنسجة.
قم بإعداد أنابيب FACS بغطاء مصفاة مرشح شبكي دقيق 35 ميكرومتر يحتوي على ملليلترين من PBS لكل حالة. ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من مزيج الإنزيم واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل كل خمس دقائق باستخدام نفس طرف الماصة لكل أنبوب لتجنب فقدان الأنسجة.
انقل الخلايا المنفصلة إلى غطاء مصفاة مرشح شبكي دقيق 35 ميكرومتر لأنابيب FACS. الطرد المركزي الأنبوب عند 350 جم لمدة خمس دقائق. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لتقييم العدد الإجمالي لخلايا الطعم.
ابدأ تحليل البيانات باستخدام خلايا مزرعة 3dpi ملطخة CTV و CD19. قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام CD19 و CTV للتأكد من تداخل الإشارة وتأكيد وجود الخلايا السرطانية ذات الصبغة المزدوجة. بعد ذلك ، قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام FSC-A و SSC-A لتمييز الخلايا السليمة عن الحطام.
ثم استخدم مجموعة الخلايا السليمة لإنشاء مخطط جديد باستخدام SSC-A و SSC-H لتحديد الخلايا المفردة. قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام 7AAD و Annexin V باستخدام مجموعة الخلايا المفردة لتمييز الخلايا إلى أربعة مجموعات سكانية. افتح ملف سمكة الزرد المطعمة.
افصل خلايا الكسب غير المشروع البشري عن الخلايا المضيفة باستخدام مخطط نقطي مع CTV و CD19. تحديد وعزل خلايا الكسب غير المشروع الإيجابية المزدوجة CTV و CD19. انسخ وطبق نفس استراتيجية البوابات الموضحة لخلايا زراعة 3 نقطة في البوصة على مجموعة خلايا الكسب غير المشروع.
ادمج جميع مجموعات الخلايا السالبة في الملحق V و 7AAD في رسم بياني مع قيم CTV على المحور x. احسب المتوسط الهندسي لجميع العينات الخمس لتحديد معدلات الانتشار. أظهرت بيانات قياس التدفق الخلوي أن الخلايا المفردة الطازجة BCP-ALL المطعمة في أجنة الزرد لديها قابلية للحياة بنسبة 95.2٪ بعد ثلاثة أيام ، أي أعلى بمقدار 1.5 مرة من قابلية الخلايا المستزرعة في الطبق بنسبة 61.9٪.
انخفضت شدة مضان CTV في كل من الظروف في الجسم الحي وفي المختبر بالمثل على مدى ثلاثة أيام ، مما يشير إلى معدلات انقسام الخلايا المماثلة. تم قياس خلايا الكسب غير المشروع السليمة لكل جنين بعد ثلاثة أيام في كل تجمع ، مما يشير إلى نقش ثابت.
