私たちは、ゼブラフィッシュの胚を使用する際に腫瘍細胞が薬物にどのように反応するかをテストするために、7日間の高速ワークフローを開発しました。小児腫瘍学に近いため、希少ながんサンプルにアクセスでき、B細胞前駆体白血病から始めましたが、現在、このアッセイが臨床現場でも機能するかどうかを調べるために、固形の小児腫瘍に対してこのプロトコルを採用しています。ゼブラフィッシュの胚で患者由来の白血病細胞をうまく増殖させることができ、これは素晴らしい前臨床モデルです。
しかし、薬物動態は厄介な場合があり、一部の薬物は生物学的な障壁を越えるのに苦労するため、実験を開始する前に必ず浸透をテストするようにしています。私たちのアプローチは、自然免疫細胞の分化を阻害し、白血病の移植片細胞がよりよく生き残るのを助けるという点でユニークです。さらに、フローサイトメトリーを使用して、10匹の宿主魚のプール内のグラフト細胞における単一細胞の生存率と増殖を測定しています。
これにより、非常に正確な薬物反応データと大きな統計的検出力を得ることができます。まず、1%アガロースを100ミリリットルのE3培地に電子レンジで溶解します。移植プレートには、約20ミリリットルの培地を10センチメートルのペトリ皿に注ぎ、半分まで満たします。
プレートを静かに渦巻いて、液体を均等に分配します。モルフォリノ注入プレートの場合、射出成形金型を2つのペトリ皿内の液体アガロースに置き、気泡が形成されないようにします。蓋を傾けて皿を覆い、アガロースが固まるまで室温で放置します。
アガロースが固まったら、プレートを逆さまにして摂氏4度で密封されたビニール袋に保管します。次に、ニードルプラーを使用して10センチメートルの毛細血管から針を生成します。針の先端を折って、推定直径10マイクロメートルを達成します。
モルフォリノを注入するには、100個のゼブラフィッシュの受精卵のバッチを最小限の液体で、事前に準備した注入プレートに移します。胚をプレートの溝に注意深く位置合わせします。spi1とcsf3rモルフォリノの50マイクロモル混合物の1ナノリットルを、1細胞期に細胞または細胞のすぐ下にある卵黄袋に注入します。
注入した卵を摂氏28度で一晩インキュベートします。3日目に、パスツールピペットを使用して絨毛切除を開始するために、心拍や動きを示さない、不透明に見える、または不規則な形をしている死んだ胚を皿から取り出します。2つの精密鉗子を使用して、絨毛膜をつまんで所定の位置に保持します。
鉗子の先端近くをつまみながら、2番目の鉗子セットで胚を固定します。絨毛膜を慎重に引き離して胚を解放します。デコレーション化した胚を摂氏28度で一晩インキュベートします。
まず、ペニシリンストレプトマイシンまたはE3 / P / Sを補充したE3培地で満たされた2つの10センチのペトリ皿を準備します。CellTrace Violet(CTV)で細胞を蛍光標識した後、BCP-ALL細胞を遠心分離します。
次に、PBSを添加して目的の細胞濃度を達成し、氷上に保ちます。マイクロローダーチップを使用して、4マイクロリットルの細胞懸濁液を移植針にロードします。E3/P/S培地と魚の胚を入れたシャーレにトリカインを加え、注射の少なくとも2分間前に胚を麻酔するための最終濃度を1リットルあたり4グラムにします。
次に、アガロースコーティングされた注入皿に15〜20個のデコレーション胚を移し、胚が滑らないように余分な液体を取り除きます。胚を注射皿に並べます。背尾方向から45度の角度で針を導入し、約1, 000個のCTV陽性BCP-ALL細胞を心膜腔に注入します。
15〜20個の胚を注入したら、E3 / P / S培地で満たされた予熱したペトリ皿に移します。移植された胚と移植されていないコントロールの両方を摂氏28度で1〜3時間インキュベートします。蛍光実体顕微鏡下で、胚をスクリーニングして生着が成功したことを確認し、卵黄が無傷であることを確認します。
100マイクロリットルのE3/P/S培地と0.5%DMSOを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。ガラス製のパスツールピペットを使用して、E3培地をできるだけ少なくして生着した胚をピックアップします。ピペットを傾けて、胚がピペットチップの底に沈むようにし、毛細管現象の力を使用してウェルに放出します。
96ウェルプレートの24ウェルに、ビヒクル制御溶液またはベネトクラクスの2倍濃縮溶液のいずれかの100マイクロリットルを充填します。胚を35°Cに72時間維持し、移植されていない胚を対照として含めます。3日目の終わりに、生着したゼブラフィッシュの胚が入った96ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。
実体顕微鏡を使用してプレートをスクリーニングし、健康なゼブラフィッシュの胚を同定して選択します。各条件から10個の宿主胚を1.5ミリリットルの微量遠心チューブにランダムにプールし、理想的には条件ごとに2本のチューブを作成します。各チューブからできるだけ多くの液体を取り除きます。
各チューブに500マイクロリットルのカルシウムおよびマグネシウムフリーのHBSSを追加します。200マイクロリットルのマイクロピペットチップを使用してトリチュレーションすることにより、胚と移植片細胞を機械的に解離し、約15回ピペッティングします。チューブを350gで室温で5分間遠心分離し、組織片をペレット化します。
35マイクロメートルの細かいメッシュのフィルターストレーナーキャップに、1条件あたり2ミリリットルのPBSが入ったFACSチューブを準備します。次に、ペレットを500マイクロリットルの酵素混合物に再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション中は、組織の損失を防ぐために、各チューブに同じピペットチップを使用して混合物を5分ごとにピペットで上下させます。
解離した細胞をFACSチューブの35マイクロメートルのファインメッシュフィルターストレーナキャップに移します。チューブを350gで5分間遠心分離します。フローサイトメトリー解析を実施して、移植片細胞の総数を評価します。
CTVおよびCD19染色した3dpi培養細胞でデータ解析を開始します。CD19とCTVでドットプロットを作成し、シグナルが重なっていることを確認し、二重に染色されたがん細胞の存在を確認します。次に、FSC-AとSSC-Aでドットプロットを作成し、無傷の細胞と破片を区別します。
次に、インタクトな細胞集団を使用して、SSC-A と SSC-H で新しいプロットを作成し、単一細胞を同定します。単一細胞集団を使用して 7AAD と Annexin V のドット プロットを作成し、細胞を 4 つの集団に区別します。生着したゼブラフィッシュのファイルを開きます。
ヒト移植片細胞を宿主細胞から分離し、CTVおよびCD19のドットプロットを使用します。CTV、CD19ダブルポジティブグラフト細胞を同定し、単離します。3dpi培養細胞について説明したのと同じゲーティング戦略をコピーして、グラフト細胞集団に適用します。
すべてのアネキシンVおよび7AAD陰性細胞集団を、X軸にCTV値を持つヒストグラムにマージします。5つのサンプルすべての幾何平均を計算して、増殖速度を決定します。フローサイトメトリーのデータによると、ゼブラフィッシュの胚に生着した新鮮なBCP-ALL単一細胞は、3日後の生存率が95.2%で、皿培養細胞の生存率61.9%の1.5倍でした。
in vivoおよびin vitro条件の両方でCTV蛍光強度は3日間で同様に減少し、細胞分裂速度が同等であることを示しています。3日後の胚あたりの無傷の移植片細胞は、各プールで定量され、一貫した生着が示されました。
