Bu çalışma kısmen, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği'nden bir JSPS KAKENHI hibesi ile desteklenmiştir (No. 19K10397'den H.K.'ye ve No. 18K09862'den I.M.'ye).

Tüm hayvan prosedürleri ve hayvan bakımı, Tohoku Üniversitesi kural ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Yenidoğan dmp1-topaz fare calvaria'nın diseksiyonu
<ol><li>Bu protokol için, C57BL / 6-Tg (Dmp1-Topaz) 1Ikal / J farelerinin 6\u20127 günlük yavrularını kullanın. Fareleri% 5 izofluran inhalasyonu ile ötenazi yapın ve daha sonra yavruları% 70 etanol'e aktarın.</li>
	<li>Ötanazi yapılan yavruyu tedavi edilmemiş bir kültür kabına aktarın.</li>
	<li>Makas ve cımbız kullanarak, kafatasının tabanındaki cildi tutun ve bir kesi yapın.</li>
	<li>İlk insizyonu başlangıç noktası olarak kullanarak, kafatasının her iki lateral tarafını kulakların önünde kesin, cildi çıkarın ve kalvariyi açığa çıkarın.</li>
	<li>Kafayı burun köprüsünden tutun ve lambdoid sütür boyunca kalvariyi kesin. Parietal kemiklerin yanal kenarları boyunca kesin ve ön kısmı içerecek şekilde genişletin.</li>
	<li>Kalvariyi altta yatan beyin dokusundan ayırın. NOT: Minimal yumuşak doku ekine sahip temiz bir kemikli kalvari sağlamak için kemiğin derinliklerine kesilmemelidir; referans olarak, kemiğin altındaki makasın gölgesini görebilmelidir.</li>
	<li>Kalvariyi fosfat tamponlu saline aktarın (protokol boyunca PBS, pH 7.4). İçbükey kısmın yukarı baktığından emin olun.</li>
</ol>2. Yenidoğan fare kalvarisinin fraksiyonasyonu
<ol><li>5 mL 2 mg/mL kollajenaz çözeltisi içeren 50 mL'lik bir konik tüpe 5 kalvariye kadar aktarın. Kullanımdan hemen önce hazırlanan taze kollajenaz çözeltisini kullanın.<ol><li>Taze bir kollajenaz çözeltisi hazırlamak için, 2 mg / mL'de izolasyon tamponuna (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl2, 1 mg / mL sığır serum albümini (BSA), 5 mg / mL glikoz ve 25 mM HEPES) kollajenaz tozu ekleyin. Kollajenaz tozunu manyetik bir karıştırıcı üzerinde çözün.</li>
		<li>Kollajenaz çözeltisini 0,22 μm'lik steril bir filtre ünitesinden 50 mL'lik bir tüpe çalıştırın ve protokol boyunca buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Kesir 1'i elde etmek için kalvariyi 37 ° C'de 20 dakika boyunca 300 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Fraksiyon 1'in sindirimini atın, kalvariyi 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve yıkamayı atın.</li>
	<li>PBS'de 1 mg/mL BSA içeren 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 15 dakika boyunca 37 °C'de PH 7.4 içeren 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içindeki kalvariyi inkübe edin.</li>
	<li>Sindirimi 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın. Kalvariyi 5 mL PBS ile yıkayın ve yıkama solüsyonunu sindirime ekleyin. NOT: Sindirimin toplanması ve yıkanmasının her noktasında, hücreleri kemikten ayırmak ve çiftleri ve hücre agregalarını önlemek için kemikleri çözeltilerinde pipetleyin.</li>
	<li>Fraksiyon 2'yi elde etmek için, sindirimi 5 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı atın, peleti% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 IU / mL penisilin G ve 100 μg / mL streptomisin içeren 8 mL α-Minimum Esansiyel Ortamda (MEM) tekrar askıya alın. 10 cm'lik bir kültür kabına tohumlayın. Fraksiyon 2'yi 37 ° C'de% 5 CO2 altında inkübe edin.</li>
	<li>Kalvariyi 37 ° C'de 5 mL kollajenaz çözeltisi içinde 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Kesir 3'ü toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 3'ü 37 °C'de %5 CO2 altında inkübe edin. NOT: Bu noktada kemikler küçülecek ve parçalara ayrılacaktır. Hiçbir kemiğin yanlışlıkla sindirimlere aspire edilmemesini ve bu da süreçte hücre kaybına yol açmamasını sağlamak için, özetleri toplamak için küçük bir uç pipeti kullanın (1000\u2012200 μL pipet uçları).</li>
	<li>Kalvariyi 37 ° C'de 5 mL kollajenaz çözeltisi içinde 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Kesir 4'ü toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 4'ü 37 °C'de %5 CO2 altında inkübe edin.</li>
	<li>Kalvariyi, PBS'de (pH 7.4) 1 mg/mL BSA içeren 5 mL 5 mM EDTA'da, 37 °C'de 300 rpm'de bir çalkalayıcıda 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Kesir 5'i toplamak için 2.5\u20122.6 adımlarını yineleyin. Fraksiyon 5'i 37 °C'de %5 CO2 altında inkübe edin. Osteositler aynı gün sıralama için hazırlanabilir veya sıralamadan önce 24 saate kadar kültürlenebilir.</li>
</ol>3. Floresan aktive hücre sıralaması için osteositlerin hazırlanması
<ol><li>Her hücre fraksiyonunun ortamını aspire edin ve iki kez 10 mL PBS ile nazikçe yıkayın.</li>
	<li>PBS'ye 5 mL% 0.5 Tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri nazikçe ayırmak için 5 mL% 10 FBS α-MEM ve pipet ekleyin. Her fraksiyondaki hücreleri, 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne eleyerek birleştirin.</li>
	<li>Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne elenerek toplayın. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve pelete% 10 FBS α-MEM ekleyin. Hücre konsantrasyonunu yaklaşık 1 x 107 hücre/mL'ye ayarlayın.</li>
	<li>Hücreleri 35 μm naylon ağ kapaklı bir tüpte filtreleyin. Hücreler artık FACS için hazırdır.</li>
	<li>Bu protokol için 100 μm boyutunda bir nozul kullanın. Toplama sıvısı %10 FBS α-MEM'den oluşmalıdır. Numuneyi karıştırma sırasında ve mümkünse sıralama boyunca 4 °C'de tutun.</li>
	<li>Sıralamadan önce, yan saçılma (SSC) alanını ve ileri saçılma (FSC) alanını ayarlayarak yapıları ve hücreleri kaldırmak için geçidi en iyi duruma getirin. SSC genişliğini SSC-Yüksekliğine ve FSC alanını FSC-genişliğine göre ayarlayarak çiftleri ortadan kaldırın. GFP-negatif osteositler, sıralama cihazının parametrelerini ayarlamak için bir kontrol olarak kullanılmalıdır.</li>
	<li>Hücre toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 300 x g'de santrifüj edin. PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Hücreleri yeniden askıya alın ve %10 FBS α-MEM kullanarak sayıyı istediğiniz gibi ayarlayın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

İlk izole osteosit, (OB7.3) veya PHEX'in kuş düşmanı varyantı kullanılarak izole edilen bir tavuk calvaria 7'dendi; Bununla birlikte, bu yöntem, uygulanabilir antikorların mevcudiyeti ile sınırlıdır, çünkü aynı zamanda türe özgü olan osteosit spesifik antikorların üretilmesi gerekir. Araştırmacılar, fare ve sıçan uzun kemiklerinden osteositler elde etmek için sıralı enzimatik işlemin farklı bir modifikasyonunu kullandılar; Bu kültürlerin bildirilen saflığı yaklaşık% 70 olarak belirlenmiştir9. Cre fare modelinin geliştirilmesi, yüzeylerinde GFP'yi ifade eden mühendislik osteositlerine izin verdi. Bu fare modeli, FACS ile birlikte, primer osteositlerin saf kültürlerini elde etmek için kullanıldı20.
Fraksiyon 1 ve fraksiyon 6\u20128 kullanımını atlıyoruz, çünkü bu fraksiyonlarda az miktarda osteosit çıkıyor. 2\u20125 fraksiyonlarının kullanılması, en kısa işlem süresi boyunca osteositlerin mümkün olan en iyi verimini verir; Bu, osteositlerin kullanım süresini sınırlar ve hücre ölümünü veya hücrenin fraksiyonasyon sırasında maruz kaldığı stresin bir sonucu olarak hücre sinyalizasyonunda olası bir değişikliği önlemeye yönelik çalışır. Ayrıca, 24 saat ön sıralama için osteositleri kültürlüyoruz, bu da varsayılan olarak, sıralama hazırlığı sırasında yapışkan olmayan süspansiyon hücrelerini (hematopoetik hücreler) hariç tutuyor. Bu, GFP22'yi eksprese eden hematopoetik hücreler tarafından kontaminasyonu en aza indirir. Bu protokolde sağlanan iş akışı, daha önce yayınlanmış yöntem23'ten yararlanır ve minimum kontaminasyonla verimli ve hızlı bir osteosit iyileşmesine izin veren sıralama süresini kısaltır.
Protokoldeki kritik adımlar, temiz bir kemikli kalvari elde etmeyi ve yapışkan hücrelerin (fibroblast ve sinir hücreleri) kontaminasyonunu sınırlamak için beyinden veya kemiğe bağlı bağ dokusundan yumuşak dokunun kesilmesini içerir. Ayrıca, sindirimin elde edilmesini ve yıkanmasını içeren adımlar sırasında hücrelerin pipetlenmesi çok önemlidir, çünkü hücre agregaları ve çiftleri sıralama sırasında atık olarak okunur ve düşük osteosit verimine katkıda bulunur.
Osteositler önceden kültür olmadan sıralanabilir. Bununla birlikte, bu, daha fazla sayıda hücrenin sıralanması gerektiği, türün süresini arttırdığı ve hematopoetik kontaminasyon olasılığını arttırdığı anlamına gelir. Bu, hematopoetik hücre tükenmesi ön sıralaması uygulanarak hafifletilebilir. Bununla birlikte, bu vergilendiricidir ve rutin ve toplu laboratuvar analizleri için önerilmez22. Büyük hücre agregalarının varlığı ve ayıklama makinesinin sıvı akışını tıkayan çiftlerin varlığı nedeniyle sıralama sırasında sorun ortaya çıkabilir. Protokolümüzde bu bir sorun olmamıştır, ancak bu, sıralama arabelleğinin FBS içeriğini azaltarak (% 10'dan az) çözülebilir.
Bu protokol sınırlama olmaksızın gelmez. Bu yöntem, insan osteositlerine tamamen benzemeyen fare osteositlerini kullanır. Bu, murin osteositlerinin incelenmesiyle elde edilen sonuçların anlamlı klinik sonuçlara genişletilmesini kısıtlar. İnsan osteositlerinin izolasyonu için protokollertanımlanmıştır 24 ve araştırmacılar hedeflerine en iyi hizmet eden hücre türlerini kullanmaya teşvik edilmektedir. Diğer protokollerde olduğu gibi, bu protokol kullanılarak elde edilen osteosit miktarları sınırlıdır ve büyük ölçekli analiz için çok sayıda fare gereklidir, ancak osteositlerin hazırlanması ve sıralanması için gereken süreyi azaltarak, tek bir zaman diliminde daha yüksek miktarlarda hücre elde edilebilir.
Bu işlemle elde edilen osteositler, daha ileri kültür ve ko-kültür, gen ekspresyon analizi, substrat aktivasyonu / inhibisyonunun aşağı akış analizi, moleküler problama ve boyama uygulamaları için kullanılabilir. Birincil hücreler, mekanotransdüksiyon ve mekanosensing çalışması için doğal osteositik ortama benzeyen bir 3D osteosit matris modeli oluşturmak için de kullanılabilir.

Osteositler, salgılanan matriks1'e gömülmüş osteoblastik progenitörlerden terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Kemik hücresi popülasyonları arasında en bol ve en uzun yaşayan hücrelerdir. Lakunalar içinde bulunurlar ve kanalikül adı verilen kanallar boyunca uzanan dendritlerle karakteristik bir yıldız morfolojisine sahiptirler ve çevrelerindeki çevre ve kemik yüzeyi2 ile geniş bir iletişim ve metabolik değişim ağı oluştururlar. Osteositler hem osteoblastların hem de osteoklastların kemik yeniden şekillenmesindeki rollerini koreografi yaparlar, mekanik yükleme3'e adaptasyon sağlayan birincil mekanosensoriyel hücrelerdir, fosfat homeostazı4 ve kemik matriks mineralizasyonundarol alırlar 5 ve lakunokanaliküler sistemle birlikte uzak dokuları işaret eden endokrin bir organ görevi görürler6.
Osteositler, erişilebilirliği sınırlayan ve izolasyonlarını zorlaştıran, böylece in vitro araştırmayı engelleyen mineralize bir matris içinde yer almaktadır. İlk izolasyon yöntemlerinden biri, daha sonra PHEX'in kuş varyantı olarak bilinen osteosit spesifik bir monoklonal antikor (OB7.3)7 kullanarak tavuk kalvarisinden izole osteositleri tanımlamıştır (X kromozomundaki Endopeptidazlara homoloji ile PHosfat düzenleyici gen)8. Diğer araştırmacılar, osteosit saflığının yaklaşık% 70 olduğu bildirilen osteosit bakımından zengin fraksiyonlar elde etmek için sıçan9 veya fare10 uzun kemiklerinin sıralı sindirimini kullandılar9. Bu prosedürün sınırlamaları, osteositlerin yanı sıra diğer hücre tipleriyle kontamine olmuş kültürlerin optimal olmayan saflığını ve osteositlerin bölünme yeteneğini kaybettiği için osteositlerin kültürdeki diğer hücreler tarafından potansiyel olarak büyüyebileceğini içerir. Bu zorluklar uzun vadeli kültürlerin kullanılabilirliğini kısıtlamaktadır.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı osteosit hücre hatları geliştirilmiştir. MLO-Y4 hücre hattı11 ve MLO-A5 hücre hattı12, özellikle erken evre osteositlerin incelenmesi için yararlı olan en yaygın olarak çalışılan hücre hatlarıdır; Bununla birlikte, her ikisi de olgun osteosit belirteçleri olan düşük sklerostin ve FGF2313 seviyelerini ifade ettikleri için olgun osteosit sinyallemesini incelemek için daha az faydalıdırlar. IDG-SW314 ve Ocy45415 dahil olmak üzere diğer hücre hatları, yüksek seviyelerde sklerostin ve FGF23 eksprese eder ve geç osteosit evresinin incelenmesinde yararlıdır. Hücre hatlarının yararlı araştırma araçları olduğu kanıtlanmıştır; Bununla birlikte, birincil hücrenin biyolojisini tam olarak temsil etmedikleri için sınırlama olmaksızın gelmezler. Farklı hücre hatları, osteosit olgunluk spektrumunun farklı gelişim aşamalarını temsil eder ve hücre hatları, primer osteositlerin heterojenliğini temsil edemez16,17.
Primer osteositlerin saf kültürlerini elde etmek için araştırmacılar, osteositlerde yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu yönlendirmek için 8-kb dmp1 promotörünün kullanıldığı cre fare modelinden yararlandılar18,19. Paic ve ark.19 tarafından çift transgenik fareler (pOB-Col 2.3- GFP-camgöbeği ve DMP1-GFP-topaz) ve Nakashima ve ark.20 tarafından dmp1-topaz transgenik fareler osteosit popülasyonları elde etmek için kullanılmıştır. Primer osteositlerin kültürlerini elde etmek için GFP'yi ifade eden osteositlerin sıralı sindirim ve FACS'sini kullandılar19,20. TdDomates proteinini aktive eden 10 kb dmp1 muhabir fare Ai9'daki cre yönünün, osteositlerde, osteoblastlarda, kaslarda ve kemik iliğindeki hücrelerde mevcut olduğu gösterilmiştir. 8-kb dmp1 promotörü aynı ekspresyon modeline sahipti, ancak osteoblastların ve kemik iliği hücrelerinin sadece bir kısmı proteini ifade etti, bu da 8-kb dmp1 promotörünün daha spesifik21 olduğunu gösteriyor. Buna rağmen, 8-kb dmp1 promotörü kullanılarak elde edilen sonuçlar dikkatle yorumlanmalı ve elde edilen popülasyonun yeterince yüksek saflıkta olmasını sağlamak için osteosit ve osteoblasta özgü belirteçler kullanılarak gen ekspresyon profilleri rutin olarak gerçekleştirilmelidir.
Osteoklast belirteçleri OSCAR ve Dcstamp, hematopoetik tükenmemiş ve tükenmiş osteosit popülasyonlarında bulundu, bu bulgu yazarları 8-kb dmp1-topaz yenidoğan kalvarisinin fraksiyonasyonundan ve GFP ayıklamasından elde edilen sindirimlerin hematopoetik hücrelerle kontamine olduğu sonucuna götürdü. GFP-pozitif hematopoetik hücreler GFP-pozitif mezenkimal hücrelerden (osteositler)22 oldukça düşük GFP yoğunluğuna sahip olduklarından, GFP sıralama kapısının sıkılaştırılmasıyla hematopoetik hücrelerle kontaminasyon azaltılabilirdi.
Osteositleri in vitro olarak incelemek için kullanılan yöntemler, osteosit biyolojisi hakkındaki son zamanlardaki bilgi zenginliğine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, osteosit izolasyonu, düşük hücre verimi ile emek yoğun ve uzun süren bir prosedür olmaya devam etmektedir. Kollajenaz ve EDTA kullanılarak sıklıkla fraksiyon 823'e kadar tarif edilen kemik sindirim yöntemi, osteosit canlılığının vergilendirildiği birkaç saat sürer. Araştırmacılar, hücre sıralaması 20 için fraksiyonlar (2\u20125) kullandıklarını bildirmişlerdir ve osteositlerle ilişkili genlerin osteoblastlarınkilere karşı ekspresyon profilinin, saf osteosit popülasyonlarının izole edilmesinin başarısını doğruladığını göstermiştir20. Bu makalede, fraksiyon elde etme sürecini (2\u20125) açıklayacağız ve her fraksiyondaki osteositlerin geri dönüşünü belirlemek için fraksiyon 1 ila 8 ile başlayan her fraksiyondan osteositlerin verimini karşılaştırıyoruz. Ayrıca, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve kollajenaz ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanılarak kalvaryal sindirimin yanı sıra FACS için hücrelerin hazırlanmasını da tanımladık.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Data aquisition and analysis</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &amp;mu;m nylon mesh.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td>034-22363</td><td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td></td><td></td><td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Millex Sterile Filter Unit</td><td>Merck Millipore, Ireland</td><td>SLGV033RS</td><td>0.22&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Nylon cell strainer</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, USA</td><td></td><td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td></td><td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &amp;mu;g/ml streptomycin</td></tr></tbody></table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

Bir zamanlar mekanik yüklemeyi algılamanın sahne arkası işlevi göz önüne alındığında kemiğin pasif bir sakini olduğu düşünülen osteosit, şimdi spot ışığına çıkarılmıştır ve hücre dışı matrisi aktif olarak modifiye etmek ve uzak bölgelere mesaj gönderen lakunokanaliküler sistemle endokrin bir organ oluşturmak gibi birçok önemli fonksiyona sahip olduğu gösterilmiştir. Osteositi in vitro olarak primer osteositlerin izole edilmesinden osteosit benzeri hücre hatlarına kadar test etmeyi mümkün kılan yöntemler sayesinde, osteositler şimdi yankılanan bir ilgi ve yapı ve işlev hakkında bilgi artışı yaşamaktadır. Osteosit biyolojisinin birçok yönü ve diğer moleküler bileşenlerle etkileşimi henüz keşfedilmemiştir. Bu protokolde, osteositlerdeki yeşil floresan proteinini eksprese eden dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositlerin hücre fraksiyonasyonu yoluyla ve daha sonra FACS ile primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi yoluyla etkili izolasyonunu ayrıntılı olarak açıklayacağız.

Bu protokolün amacı, kalsiyum şelasyonu için kollajen matriksini ve EDTA'yı parçalamak için kollajenaz kullanan bir fraksiyonasyon işlemi yoluyla dmp1-topaz yenidoğan fare kalvarisinden primer osteosit kültürlerinin elde edilmesi sürecini göstermektir, bundan sonra hücreler FACS'ın osteositleri diğer hücre popülasyonlarından ayırması için hazırlanır.
Yenidoğan fare kalvarisinden primer osteositler elde etme yöntemleri genellikle23'ü sıralamak için fraksiyonların (1\u20128) kullanımını tanımlar. Bu yöntemin etkinliğini test etmek için, 1 ila 8 fraksiyonlarından başlayarak bir dmp1-topaz fare kalvarisinden elde edilen osteositlerin verimini karşılaştırdık. Fraksiyonlar 1\u20128, her fraksiyondan osteositlerin yüzdesini ve verimini belirlemek için ayrı ayrı sıralandı. Sıralamadan sonra, tohumlanan hücrelerin yoğunluğunu karşılaştırmak için osteositleri 96 delikli bir plaka üzerinde 24 saat boyunca kültürledik. Fraksiyon 2\u20125'teki osteositlerin yoğunluğunun fraksiyon 1'den daha yüksek olduğu gösterilmiştir ve osteosit yoğunluğu fraksiyon 6, 7 ve 8'de belirgin bir şekilde azalmaya başlar (Şekil 1A).
Tüm fraksiyonlar arasında elde edilen osteosit yüzdesi istatistiksel olarak anlamlı olmasa da (Şekil 1B), osteositlerin yoğunluğu önemli ölçüde farklılık göstermektedir. Araştırmacılar20 , FACS yoluyla osteositleri izole etmek için fraksiyon 2\u20125 kullanımını bildirmişlerdir ve Şekil 1'de fraksiyonların 2\u20125 kullanılmasının osteosit elde etme sürecini optimize ettiğini ve türün süresini azalttığını gösteriyoruz.
Şekil 2 , GFP-negatif fare kalvarisinin fraksiyonasyonu yoluyla elde edilen hücrelerin kontrol olarak kullanıldığı GFP-pozitif hücreleri GFP-negatif hücrelerden izole etmek için uygulanan hücre sayısını ve geçit stratejisini göstermektedir. Bu yöntemle elde edilen osteositler, osteosit belirteçleri olarak bilinen Dmp1 ve SOST'un gen ekspresyonu için analiz edildi. Dmp1 ve SOST mRNA ekspresyonları, osteositlerde, yüksek osteoblast fraksiyonu olarak bilinen ön sıralama fraksiyonu 2 ile karşılaştırıldığında daha yüksektir (Şekil 3A). Şekil 3B , GFP-pozitif bir osteositin morfolojisini, plastik bir kültür kabı post sortunda 24 saat boyunca kültürlenen hücre gövdesinden uzanan dendritlerle yıldız şeklini koruduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61513/61513fig01.jpg"> Şekil 1: Osteosit fraksiyonasyonunun etkinliği. (A) 1\u20128 fraksiyonlarından osteositlerin yoğunluğunun mikroskobik görüntüleri, türün 24 saatinden sonra yakalanan 96 delikli bir plaka üzerine tohumlanır. Kesirler 2\u20125, kesirler 1 ve 6\u20128'den daha yüksek hücre yoğunluğuna sahiptir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Akış sitometre yazılımı tarafından ölçülen 1\u20128 fraksiyonlarından elde edilen osteositlerin yüzdesi. Sonuçlar üç ayrı temsili deneyden elde edilmiştir. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61513/61513fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61513/61513fig02.jpg"> Şekil 2: GFP-pozitif osteositlerin floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama yoluyla izolasyonu. Üst panel, GFP eşik kontrolü olarak GFP-negatif C57Bl / 6J çöp arkadaşı kalvaryasından izole edilen hücreleri temsil eder. Alt panel, dmp1-topaz fare kalvarisinden elde edilen fraksiyon 2'de GFP-pozitif osteositleri GFP-negatif hücrelerden izole etmek için uygulanan hücre sayısını ve geçit kontrolünü temsil eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61513/61513fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61513/61513fig03.jpg"> Şekil 3: Osteosit karakterizasyonu sonrası sıralama. (A) 24 saat boyunca kültürlenmiş fraksiyon 2 hücrelerinin Dmp1 ve SOST'unun göreceli mRNA ekspresyonu ve 24 saat sonrası sıralama için kültürlenmiş osteositler. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur. İstatistiksel farklılıklar Student t-testi kullanılarak saptandı: * p < 0.05, **p < 0.01. (B) 24 saat sonra kültürlenmiş hücre gövdesinden dışarıya doğru uzanan dendritleri tutan bir osteositin mikroskobik görüntüsü. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61513/61513fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Bu protokol, floresan aktive hücre sıralama (FACS) için osteosit hazırlığına ek olarak, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve yeşil floresan proteinini hücre sindirimi ve fraksiyonasyonu yoluyla eksprese eden osteositlerin izolasyonunu açıklar.

GFP eksprese eden osteositlerin murin kalvarial fraksiyonasyonu yoluyla primer osteositlerin elde edilmesi

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

2.0K Görüntüleme.  Tohoku University Graduate School of Dentistry. Bu protokol, floresan aktive hücre sıralama (FACS) için osteosit hazırlığına ek olarak, yenidoğan dmp1-topaz fare kalvarisinin diseksiyonunu ve yeşil floresan proteinini hücre sindirimi ve fraksiyonasyonu yoluyla eksprese eden osteositlerin izolasyonunu açıklar.

Video: Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Gelişim Biyolojisi

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Tıp

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, are responsible for the mechanosensory function of bone tissue. Studies employing histology, mathematical modeling, cell culture, and ex vivo bone organ cultures have greatly advanced the understanding of osteocyte mechanobiology. However, the fundamental question of how osteocytes respond to and encode mechanical information at the molecular level in vivo is not well understood. Intracellular calcium concentration fluctuations in osteocytes offer a useful target for learning more about acute bone mechanotransduction mechanisms. Here, we report a method for studying osteocyte mechanobiology in vivo, combining a mouse strain with a fluorescently genetically encoded calcium indicator expressed in osteocytes with an in vivo loading and imaging system to directly detect osteocyte calcium levels during loading. This is achieved with a three-point bending device that can deliver well-defined mechanical loads to the third metatarsal of living mice while simultaneously monitoring fluorescently indicated calcium responses of osteocytes using two-photon microscopy. This technique allows for direct in vivo observation of osteocyte calcium signaling events in response to whole bone loading and is useful in the endeavor to reveal mechanisms in osteocyte mechanobiology.

The current article describes performing an intravital imaging approach to observe mechanically induced calcium signaling of embedded osteocytes in vivo in real-time in response to tissue-level mechanical loading of the mouse third metatarsal.

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, ...

Biyomühendislik

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

İlköğretim Fare Osteoblastlar gelen osteositlere Kültürler Edinme Retinoik Asit Uygulama

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Biyoloji

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

<meta charset="utf8"></head><body>Kemikte Mekanosensasyonu İncelemek için CFD Analizi için Osteositlerin 3D Modellemesi

Analysis and Imaging of Osteocytes

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological pathways in a process known as mechanotransduction. Confocal image-derived models of osteocyte networks are a valuable tool for conducting Computational Fluid Dynamics&#160;(CFD) analysis to evaluate shear stresses on the osteocyte membrane, which cannot be determined by direct measurement. Computational modeling using these high-resolution images of the microstructural architecture of bone was used to numerically simulate the mechanical loading exerted on bone and understand the load-induced stimulation of osteocytes.
This study elaborates on the methods to develop 3D single osteocyte models using confocal microscope images of the Lacunar-Canalicular Network&#160;(LCN) to perform CFD analysis utilizing various computational modeling software. Prior to confocal microscopy, the mouse bones are sectioned and stained with Fluorescein isothiocyanate (FITC) dye to label the LCN. At 100x resolution, Z-stack images are collected using a confocal microscope and imported into MIMICS software (3D image-based processing software) to construct a surface model of the LCN and osteocyte-dendritic processes.
These surfaces are then subtracted using a Boolean operation in 3-Matic software (3D data optimization software) to model the lacunar fluidic space around the osteocyte cell body and canalicular space around the dendrites containing lacunocanalicular fluid. 3D volumetric fluid geometry is imported into ANSYS software (simulation software) for CFD analysis. ANSYS CFX (CFD software) is used to apply physiological loading on the bone as fluid pressure, and the wall shear stresses on the osteocytes and dendritic processes are determined. The morphology of the LCN affects the shear stress values sensed by the osteocyte cell membrane and cell processes. Therefore, the details of how confocal image-based models are developed can be valuable in understanding osteocyte mechanosensation and can lay the groundwork for future studies in this area.

<meta charset="utf8"></head><body>Osteositlerin Analizi ve Görüntülenmesi

This study outlines the method to visualize and develop three-dimensional (3D) models of osteocytes within the lacunar-canalicular network (LCN) for computational fluid dynamics (CFD) analysis. The generated models using this method help to understand osteocyte mechanosensation in healthy or diseased bones.

Osteositlerin Analizi ve Görüntülenmesi

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

GFP eksprese eden osteositlerin murin kalvarial fraksiyonasyonu yoluyla primer osteositlerin elde edilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Ardışık

Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

İlköğretim Fare Osteoblastlar gelen osteositlere Kültürler Edinme Retinoik Asit Uygulama

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Osteositlerin Analizi ve Görüntülenmesi

Osteositlerin Analizi ve Görüntülenmesi

Osteositlerin Analizi ve Görüntülenmesi

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi