이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (H.K.에 No. 19K10397, I.M.에 No. 18K09862)의 JSPS KAKENHI 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

모든 동물 시술과 동물 관리는 도호쿠 대학의 규칙과 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 신생아 dmp1-topaz 마우스 calvaria의 해부
<ol><li>이 프로토콜의 경우 C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J 마우스의 6-1일 된 새끼를 사용합니다. 5% 이소플루란 흡입으로 마우스를 안락사시킨 다음 새끼를 70% 에탄올로 옮깁니다.</li>
	<li>안락사된 강아지를 처리되지 않은 배양 접시에 옮깁니다.</li>
	<li>가위와 핀셋을 사용하여 두개골 바닥의 피부를 잡고 절개하십시오.</li>
	<li>첫 번째 절개를 시작점으로 하여 귀 앞쪽 두개골의 양쪽 측면을 절단하고 피부를 제거하고 두개골을 노출시킵니다.</li>
	<li>비강 다리에서 머리를 잡고 lambdoid 봉합사를 따라 calvaria를 자릅니다. 정수리 뼈의 측면 가장자리를 따라 자르고 정면 부분을 포함하도록 확장합니다.</li>
	<li>밑에있는 뇌 조직에서 calvaria를 분리하십시오. 알림: 최소한의 연조직 부착으로 깨끗한 뼈 두개골을 보장하려면 뼈 깊숙이 자르지 마십시오. 참고로 뼈 아래 가위의 그림자를 볼 수 있어야 합니다.</li>
	<li>calvaria를 인산염 완충 식염수(PBS, 프로토콜 전반에 걸쳐 pH 7.4)로 옮깁니다. 오목한 부분이 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오.</li>
</ol>2. 신생아 마우스 calvaria의 분획
<ol><li>5 mL의 2 mg/mL 콜라게나제 용액이 들어 있는 50 mL 원뿔형 튜브에 최대 5개의 calvariae를 옮깁니다. 사용 직전에 준비된 신선한 콜라게나제 용액을 사용하십시오.<ol><li>신선한 콜라게나제 용액을 제조하기 위해, 콜라게나제 분말을 2 mg/mL의 분리 완충액(70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM 소르비톨,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl2, 1 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 5 mg/mL 포도당 및 25 mM HEPES)에 첨가한다. 콜라게나제 분말을 자석 교반기에 녹입니다.</li>
		<li>0.22μm 멸균 필터 장치를 통해 콜라게나제 용액을 50mL 튜브에 넣고 프로토콜 내내 얼음 위에 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>칼바리아를 37°C에서 300rpm의 진탕기 상에서 20분 동안 인큐베이션하여 분획 1을 얻었다.</li>
	<li>분획 1의 분해물을 버리고, 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 칼바리아를 세척한 후 세척액을 폐기합니다.</li>
	<li>300rpm의 진탕기에서 15분 동안 37°C에서 PH 7.4의 PBS, PH 7.4에 1mg/mL BSA를 포함하는 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 5mL에 칼바리아를 배양합니다.</li>
	<li>50mL 원뿔형 튜브에 다이제스트를 수집합니다. 5mL의 PBS로 calvaria를 세척하고 세척 용액을 소화제에 첨가하십시오. 참고: 소화제를 수집하고 세척하는 각 지점에서 용액에 뼈를 피펫팅하여 뼈에서 세포를 분리하고 이중선 및 세포 응집체를 방지합니다.</li>
	<li>분획 2를 얻기 위해, 분해물을 4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 10% 소 태아 혈청(FBS), 100IU/mL 페니실린 G 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 함유한 8mL의 α-최소 필수 배지(MEM)에 펠릿을 다시 현탁합니다. 10cm 배양 접시에 씨앗을 뿌린다. 분획 2를 5%CO2 하에 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>칼바리아를 37°C에서 300 rpm의 진탕기 상에서 20분 동안 37°C에서 5 mL의 콜라게나제 용액에 인큐베이션한다.</li>
	<li>분수 3을 구하려면 2.5-6단계를 반복합니다. 분획 3을 5%CO2 하에 37°C에서 배양한다. 알림: 이 시점에서 뼈는 작아지고 조각으로 축소됩니다. 뼈가 실수로 분해물로 흡인되어 공정에서 세포 손실이 발생하지 않도록 하려면 분해물을 수집할 때 작은 팁 피펫(1000\u2012200 μL 피펫 팁)을 사용하십시오.</li>
	<li>칼바리아를 37°C에서 300 rpm의 진탕기 상에서 20분 동안 37°C에서 5 mL의 콜라게나제 용액에 인큐베이션한다.</li>
	<li>분수 4를 수집하려면 2.5-6단계를 반복합니다. 분획 4를 5%CO2 하에 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>300rpm의 진탕기에서 15분 동안 37°C에서 PBS(pH 7.4) 중 1mg/mL BSA를 포함하는 5mM EDTA 5mL에서 칼바리아를 배양합니다.</li>
	<li>분수 5를 수집하려면 2.5-6단계를 반복합니다. 분획 5를 5%CO2 하에 37°C에서 배양한다. Osteocytes는 같은 날 분류를 위해 준비하거나 분류 전에 최대 24시간 동안 배양할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 형광 활성화 세포 분류를 위한 골세포의 제조
<ol><li>각 세포 분획의 배지를 흡인하고 PBS 10mL로 부드럽게 세척합니다.</li>
	<li>PBS에 0.5% Trypsin-EDTA 5mL를 넣고 37°C에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 5mL의 10% FBS α-MEM과 피펫을 추가하여 세포를 부드럽게 분리합니다. 40μm 세포 여과기를 통해 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브에 체로 쳐서 각 분획의 세포를 결합합니다.</li>
	<li>10mL의 PBS로 세포를 세척하고 40μm 세포 여과기를 통해 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 체로 쳐서 수집합니다. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 흡인하고 펠릿에 10% FBS α-MEM을 추가합니다. 세포 농도를 약 1 x 107 cells/mL로 조정합니다.</li>
	<li>35μm 나일론 메쉬 캡 튜브에서 세포를 여과합니다. 이제 셀이 FACS에 대한 준비가 되었습니다.</li>
	<li>이 프로토콜의 경우 100μm 크기의 노즐을 사용합니다. 수집 유체는 10% FBS α-MEM으로 구성되어야 합니다. 교반 중에 분류되는 샘플을 유지하고 가능하면 분류 내내 4°C에서 유지합니다.</li>
	<li>정렬하기 전에 측면 산란(SSC) 영역과 전방 산란(FSC) 영역을 조정하여 아티팩트와 셀을 제거하도록 게이팅을 최적화합니다. SSC-너비 대 SSC-높이 및 FSC-영역 대 FSC-너비를 조정하여 이중선을 제거합니다. GFP 음성 골세포는 분류 기기의 매개변수를 조정하기 위한 대조군으로 사용해야 합니다.</li>
	<li>세포 수집이 완료된 후, 세포를 4°C에서 300 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. PBS로 세포를 세척하십시오. 세포를 4°C에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>셀을 다시 일시 중단하고 10% FBS α-MEM을 사용하여 원하는 대로 숫자를 조정합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. 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P., Varma, S., Gottesman, M. 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Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

최초로 분리된 골세포는 닭 calvaria7 (OB7.3) 또는 PHEX의 조류 변이체를 사용하여 분리하였다; 그러나, 이 방법은 또한 종 특이적인 골세포 특이적 항체가 제조되어야 하기 때문에 실행 가능한 항체의 가용성에 의해 제한됩니다. 연구자들은 마우스와 쥐의 긴 뼈에서 골 세포를 얻기 위해 순차적 효소 과정의 다른 변형을 사용했습니다. 보고된 이러한 배양물의 순도는 약 70%로 설정되었습니다9. cre 마우스 모델의 개발은 표면에 GFP를 발현하는 관절 세포를 조작할 수 있게 해주었습니다. 이 마우스 모델은 FACS와 함께 1차 골세포20의 순수 배양물을 얻는 데 사용되었습니다.
분수 1과 분수 6의 사용은 생략했는데, 이 분획에서 소량의 골세포가 떨어져 나가기 때문입니다. 분획 2\u20125를 사용하면 최단 처리 시간 동안 최상의 골세포 수율을 얻을 수 있습니다. 이것은 골세포의 처리 시간을 제한하고 분획 중에 세포가 받는 스트레스의 결과로 세포 사멸 또는 세포 신호 전달의 가능한 변화를 방지하는 데 작용합니다. 또한 24시간 사전 분류를 위해 골세포를 배양하며, 기본적으로 분류 준비 중에 비부착성 현탁 세포(조혈 세포)를 제외합니다. 이것은 GFP22를 발현하는 조혈 세포에 의한 오염을 최소화합니다. 이 프로토콜에서 제공되는 워크플로우는 이전에 공개된 방법(23 )을 활용하고 정렬 시간을 단축하여 오염을 최소화하면서 효율적이고 빠른 골세포 회수를 가능하게 합니다.
프로토콜의 중요한 단계에는 깨끗한 뼈 종아리를 얻고 부착 세포(섬유아세포 및 신경 세포)의 오염을 제한하기 위해 뼈에 부착된 뇌 또는 결합 조직에서 연조직을 다듬는 것이 포함됩니다. 또한, 세포 응집체와 이중체는 분류 중에 폐기물로 읽혀지고 골세포의 낮은 수율에 기여하기 때문에 소화물을 얻고 세척하는 단계를 포함하여 세포를 피펫팅하는 것이 중요합니다.
Osteocytes는 사전 배양 없이 분류할 수 있습니다. 그러나 이는 더 많은 수의 세포를 분류해야 하므로 분류 시간이 증가하고 조혈 오염 가능성이 증가한다는 것을 의미합니다. 이는 조혈 세포 고갈 사전 분류를 적용함으로써 완화될 수 있다. 그러나 이는 부담이 되며 일상적인 및 배치 실험실 분석에는 권장되지 않습니다22. 큰 세포 응집체의 존재로 인해 분류하는 동안 문제가 발생할 수 있으며 분류 기계의 유체 흐름을 막는 이중선이 있습니다. 우리 프로토콜에서는 이것이 문제가 되지 않았지만, 정렬 버퍼의 FBS 함량을 줄임으로써 해결할 수 있습니다(10% 미만).
이 프로토콜은 제한이 없습니다. 이 방법은 인간 골 세포와 완전히 유사하지 않은 마우스 골 세포를 사용합니다. 이것은 쥐 골세포를 연구하여 얻은 결과를 의미 있는 임상 결과로 확장하는 것을 제한합니다. 인간 골세포 분리를 위한 프로토콜이 기술되어 있으며24, 연구자들은 그들의 목표에 가장 잘 부합하는 세포 종을 사용하도록 권장된다. 다른 프로토콜과 마찬가지로 이 프로토콜을 사용하여 얻은 골세포의 양은 제한되어 있으며 대규모 분석에는 많은 수의 마우스가 필요하지만 파조직을 준비하고 분류하는 데 필요한 시간을 줄임으로써 단일 시간 프레임에서 더 많은 양의 세포를 얻을 수 있습니다.
이 과정을 통해 얻은 골세포는 추가 배양 및 공동 배양, 유전자 발현 분석, 기질 활성화/억제의 다운스트림 분석, 분자 프로빙 및 염색 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 일차 세포는 또한 기계 형질도입 및 기계 감지 연구를 위해 천연 골세포 환경과 유사한 3D 골세포 기질 모델을 구성하는 데 사용할 수 있습니다.

Osteocytes는 분비된 기질1에 묻힌 조골세포 전구체로부터 말단적으로 분화된 세포입니다. 그들은 뼈 세포 집단 중에서 가장 풍부하고 가장 오래 사는 세포입니다. 그들은 lacunae 내에 거주하며 주변 환경 및 뼈 표면과의 광범위한 통신 및 대사 교환 네트워크를 형성하는 canaliculi라는 채널을 통해 확장되는 수상 돌기와 함께 특징적인 별 모양 형태를 가지고 있습니다2. 골세포는 뼈 리모델링에서 조골세포와 파골세포 역할을 모두 수행하며,기계적 부하에 대한 적응을 부여하는 주요 기계감각 세포이며3, 인산염 항상성(phosphate homeostasis)4 및 골기질 광물화(bone matrix mineralization)5에 관여하며, 열수관(lacunocanalicular) 시스템과 함께 먼 조직에 신호를 보내는 내분비 기관으로 작용한다6.
Osteocytes는 광물화된 매트릭스 내에 위치하여 접근성을 제한하고 분리를 어렵게 만들어 체외 조사를 방해합니다. 첫 번째 분리 방법 중 하나는 나중에 PHEX(X 염색체의 엔도펩티다아제와 상동성을 갖는 PHosphate-regulating gene)8의 조류 변이체로 알려진 골세포 특이적 단클론 항체(OB7.3)를 사용하여 닭 두개골에서 골세포를 분리하는 것이었습니다. 다른 연구자들은 쥐9 또는 마우스 10 긴 뼈의 순차적 소화를 사용하여 골세포 순도가 약70 %인 것으로 보고된 골세포가 풍부한 분획을 얻었습니다9. 이 절차의 한계에는 골세포 이외의 다른 세포 유형으로 오염된 배양물의 최적이 아닌 순도와 골세포가 분열하는 능력을 상실했기 때문에 배양 중인 다른 세포에 의해 골세포가 잠재적으로 과도하게 자랄 수 있다는 것이 포함됩니다. 이러한 문제는 장기 문화의 유용성을 제한합니다.
이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 골세포 세포주가 개발되었습니다. MLO-Y4 세포주11 및 MLO-A5 세포주12는 특히 초기 단계 골세포 연구에 유용한 가장 널리 연구된 세포주입니다. 그러나 이들은 성숙한 골세포 마커인 sclerostin과 FGF2313의 낮은 수준을 발현하기 때문에 성숙한 골세포 신호 전달을 연구하는 데 덜 유용하다. IDG-SW314 및 Ocy45415를 포함하는 다른 세포주는 높은 수준의 스클레로스틴 및 FGF23을 발현하며 후기 골세포 단계를 연구하는 데 유용합니다. 세포주는 유용한 연구 도구임이 입증되었습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 일차 세포의 생물학을 완전히 나타내지 않기 때문에 제한없이 오지 않습니다. 상이한 세포주는 골세포 성숙 스펙트럼의 상이한 발달 단계를 나타내며, 세포주는 원발성 골세포의 이질성을 나타내지 못한다16,17.
일차 골세포의 순수 배양을 얻기 위해, 연구자들은 8kb dmp1 프로모터가 골세포에서 녹색 형광 단백질(GFP) 발현을 유도하는 데 사용되는 cre 마우스 모델을 활용했다18,19. Paic et al.19에 의한 이중 형질전환 마우스(pOB-Col 2.3-GFP-cyan 및 DMP1-GFP-topaz)와 Nakashima et al.20에 의한 dmp1-topaz 형질전환 마우스를 사용하여 골세포 개체군을 얻었습니다. 그들은 1차 골세포의 배양물을 획득하기 위해 GFP를 발현하는 골세포의 순차적 소화 및 FACS를 사용했습니다19,20. tdTomato 단백질을 활성화시키는 10kb dmp1 리포터 마우스 Ai9에서 cre의 방향은 골수, 조골세포, 근육 및 골수 내 세포에 존재하는 것으로 나타났습니다. 8-kb dmp1 프로모터는 동일한 발현 패턴을 가졌지만, 조골세포와 골수 세포의 일부만이 단백질을 발현하였으며, 이는 8-kb dmp1 프로모터가 더 특이적임을 나타낸다21. 그럼에도 불구하고, 8kb dmp1 프로모터를 사용하여 얻은 결과는 주의해서 해석되어야 하며, 유전자 발현 프로파일은 얻어진 집단이 충분히 높은 순도를 갖도록 하기 위해 골세포 대 조골세포 특이적 마커를 사용하여 일상적으로 수행되어야 합니다.
파골세포 마커 OSCAR 및 Ddcamp는 조혈되지 않은 고갈 대 고갈된 골세포 집단에서 발견되었으며, 이 발견으로 인해 저자는 8kb dmp1-topaz 신생아 calvaria 및 GFP 분류의 분획에서 얻은 소화가 조혈 세포로 오염되어 있다고 결론지었습니다. GFP 양성 조혈 세포는 GFP 양성 중간엽 세포(골세포)보다 GFP 강도가 상당히 낮기 때문에 조혈 세포의 오염은 GFP 분류 게이트를 조임으로써 완화될 수 있었습니다22.
시험관 내에서 골세포를 연구하는 방법은 골세포 생물학에 대한 최근의 풍부한 정보에 기여했습니다. 그러나 골세포 분리는 세포 수율이 낮은 노동 집약적이고 긴 절차로 남아 있습니다. 콜라게나제와 EDTA를 사용하여 종종 분획 823까지 뼈 소화의 설명 된 방법은 골 세포 생존력에 세금이 부과되는 몇 시간이 걸립니다. 연구자들은 세포 분류를 위해 분획(fractions)(2\u20125)을 사용했다고 보고했으며20, 조골세포와 관련된 유전자의 발현 프로필과 조골세포의 유전자 발현 프로필이 순수한 골세포 개체군을 분리하는 데 성공했음을 확인해준다는 것을 보여주었다20. 이 기사에서는 분획(2\u20125)을 얻는 과정을 설명하고 분획 1부터 8까지 시작하는 각 분획의 골세포 수율을 비교하여 각 분획에서 골세포의 반환을 결정합니다. 우리는 또한 신생아 dmp1-topaz 마우스 calvaria의 해부와 collagenase 및 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 사용한 calvarial 소화뿐만 아니라 FACS를위한 세포의 준비에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Data aquisition and analysis</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &amp;mu;m nylon mesh.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td>034-22363</td><td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td></td><td></td><td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Millex Sterile Filter Unit</td><td>Merck Millipore, Ireland</td><td>SLGV033RS</td><td>0.22&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Nylon cell strainer</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, USA</td><td></td><td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td></td><td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &amp;mu;g/ml streptomycin</td></tr></tbody></table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

한때 기계적 부하를 감지하는 무대 뒤 기능을 감안할 때 뼈의 수동적 거주자로 생각되었던 골 세포는 이제 주목을 받고 있으며 세포 외 기질을 능동적으로 수정하고 내분비 기관을 형성하는 것과 같은 여러 주요 기능을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 시험관 내에서 분리된 일차 골세포에서 골세포 유사 세포주로 골세포를 테스트할 수 있게 된 방법 덕분에 골세포는 이제 구조와 기능에 대한 엄청난 관심과 지식의 급증을 경험하고 있습니다. 골세포 생물학의 많은 측면과 다른 분자 구성 요소와의 상호 작용은 아직 발견되지 않았습니다. 이 프로토콜에서 우리는 세포 분획 및 이후 FACS에 의한 1차 골세포의 배양을 통해 골세포에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 dmp1-topaz 신생아 마우스 calvaria에서 1차 골세포의 효율적인 분리를 자세히 설명합니다.

이 프로토콜의 목적은 칼슘 킬레이트화를 위해 콜라겐 매트릭스 및 EDTA를 분해하기 위해 콜라게나제를 사용하는 분획 과정을 통해 dmp1-topaz 신생아 마우스 종아리에서 1차 골세포의 배양을 얻는 과정을 입증하는 것이며, 그 후 세포는 다른 세포 집단에서 골세포를 분리하기 위해 FACS를 위해 준비됩니다.
신생아 마우스 calvaria에서 일차 골세포를 얻는 방법은 종종 분류를 위한 분획(1\u20128)의 사용을 설명한다23. 이 방법의 효율성을 테스트하기 위해 분획 1에서 8까지 시작하여 하나의 dmp1-topaz 마우스 calvaria에서 얻은 골세포의 수율을 비교했습니다. 분획 1-20128을 개별적으로 분류하여 각 분획에서 골세포의 백분율과 수율을 결정했습니다. 분류 후, 우리는 파종된 세포의 밀도를 비교하기 위해 96웰 플레이트에서 24시간 동안 골세포를 배양했습니다. 분획 2-0125의 골세포 밀도는 분획 1의 밀도보다 높은 것으로 나타났으며, 분획 6, 7 및 8에서 골세포 밀도가 현저하게 감소하기 시작합니다(그림 1A).
모든 분획 중에서 얻어진 골세포의 비율은 통계적으로 유의하지 않지만(그림 1B), 골세포의 밀도는 크게 다릅니다. 연구자들(20 )은 FACS를 통해 골세포를 분리하기 위해 분획 2-2를 사용한다고 보고했으며, 그림 1 에서 분획 2-2를 사용하면 골세포를 얻는 과정이 최적화되고 정렬 시간이 단축된다는 것을 알 수 있습니다.
그림 2 는 GFP 음성 마우스 calvaria의 분획을 통해 얻은 세포를 대조군으로 사용한 GFP 음성 세포에서 GFP 양성을 분리하기 위해 실행한 세포 수 및 게이팅 전략을 보여줍니다. 이 방법을 통해 얻어진 골세포는 공지된 골세포 마커인 Dmp1 및 SOST의 유전자 발현을 분석하였다. Dmp1 및 SOST mRNA 발현은 높은 조골세포 분획으로 알려진 사전 분류 분획 2와 비교할 때 골세포에서 더 높습니다(그림 3A). 도 3B 는 플라스틱 배양 접시 위에서 24시간 동안 배양된 세포체로부터 뻗어 나온 수상돌기와 함께 별 모양을 유지하는 GFP 양성 골세포의 형태를 나타낸 것이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61513/61513fig01.jpg"> 그림 1: 골세포 분획의 효율. (A) 24시간 후에 캡처된 96웰 플레이트에 파종된 분획 1-20128의 골세포 밀도의 현미경 이미지. 분획 2-55는 분획 1 및 6-6보다 세포 밀도가 높습니다. 스케일 바 = 100 μm. (B) 유세포 분석기 소프트웨어로 측정한 분획 1-0128에서 얻은 골세포의 백분율. 결과는 세 가지 개별 대표 실험에서 파생됩니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61513/61513fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61513/61513fig02.jpg"> 그림 2: 형광 활성화 세포 분류를 통한 GFP 양성 골세포 분리. 상단 패널은 GFP 역치 대조군으로서 GFP 음성 C57Bl/6J littermate calvaria에서 분리된 세포를 나타냅니다. 하단 패널은 dmp1-topaz mouse calvaria에서 얻은 분획 2에서 GFP 음성 세포로부터 GFP 양성 골세포를 분리하기 위해 실행된 세포 수 및 게이팅 대조군을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61513/61513fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61513/61513fig03.jpg"> 그림 3: 정렬 후 골세포 특성화. (A) 분류 후 24시간 동안 배양된 분획 2 세포 및 24시간 동안 배양된 골세포의 Dmp1 및 SOST의 상대적 mRNA 발현. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 통계적 차이는 스튜던트 t-검정을 사용하여 검출하였다: *p < 0.05, **p < 0.01. (B) 정렬 후 24시간 동안 배양된 세포체에서 바깥쪽으로 뻗어 있는 수상돌기를 유지하는 골세포의 현미경 이미지. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61513/61513fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 골세포 준비 외에도 신생아 dmp1-topaz 마우스 두개골의 해부와 세포 소화 및 분획을 통해 녹색 형광 단백질을 발현하는 골세포의 분리를 설명합니다.

GFP 발현 골세포의 쥐 두개골 분획을 통한 1차 골세포 획득

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

2.0K 조회수.  Tohoku University Graduate School of Dentistry. 이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 골세포 준비 외에도 신생아 dmp1-topaz 마우스 두개골의 해부와 세포 소화 및 분획을 통해 녹색 형광 단백질을 발현하는 골세포의 분리를 설명합니다.

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

연구

발생학

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

순차<em&gt; 생체 내</em&gt; 골절 치료시 골 형성 줄기 / 전구 세포의 이미징

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

의학

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, are responsible for the mechanosensory function of bone tissue. Studies employing histology, mathematical modeling, cell culture, and ex vivo bone organ cultures have greatly advanced the understanding of osteocyte mechanobiology. However, the fundamental question of how osteocytes respond to and encode mechanical information at the molecular level in vivo is not well understood. Intracellular calcium concentration fluctuations in osteocytes offer a useful target for learning more about acute bone mechanotransduction mechanisms. Here, we report a method for studying osteocyte mechanobiology in vivo, combining a mouse strain with a fluorescently genetically encoded calcium indicator expressed in osteocytes with an in vivo loading and imaging system to directly detect osteocyte calcium levels during loading. This is achieved with a three-point bending device that can deliver well-defined mechanical loads to the third metatarsal of living mice while simultaneously monitoring fluorescently indicated calcium responses of osteocytes using two-photon microscopy. This technique allows for direct in vivo observation of osteocyte calcium signaling events in response to whole bone loading and is useful in the endeavor to reveal mechanisms in osteocyte mechanobiology.

The current article describes performing an intravital imaging approach to observe mechanically induced calcium signaling of embedded osteocytes in vivo in real-time in response to tissue-level mechanical loading of the mouse third metatarsal.

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, ...

생체공학

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

기본 마우스 조골 세포에서 골 세포 배양을 구하는 레티노 산의 적용

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

생물학

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

<meta charset="utf8"></head><body>뼈의 기계감각을 연구하기 위한 CFD 분석을 위한 골세포의 3D 모델링

Analysis and Imaging of Osteocytes

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological pathways in a process known as mechanotransduction. Confocal image-derived models of osteocyte networks are a valuable tool for conducting Computational Fluid Dynamics&#160;(CFD) analysis to evaluate shear stresses on the osteocyte membrane, which cannot be determined by direct measurement. Computational modeling using these high-resolution images of the microstructural architecture of bone was used to numerically simulate the mechanical loading exerted on bone and understand the load-induced stimulation of osteocytes.
This study elaborates on the methods to develop 3D single osteocyte models using confocal microscope images of the Lacunar-Canalicular Network&#160;(LCN) to perform CFD analysis utilizing various computational modeling software. Prior to confocal microscopy, the mouse bones are sectioned and stained with Fluorescein isothiocyanate (FITC) dye to label the LCN. At 100x resolution, Z-stack images are collected using a confocal microscope and imported into MIMICS software (3D image-based processing software) to construct a surface model of the LCN and osteocyte-dendritic processes.
These surfaces are then subtracted using a Boolean operation in 3-Matic software (3D data optimization software) to model the lacunar fluidic space around the osteocyte cell body and canalicular space around the dendrites containing lacunocanalicular fluid. 3D volumetric fluid geometry is imported into ANSYS software (simulation software) for CFD analysis. ANSYS CFX (CFD software) is used to apply physiological loading on the bone as fluid pressure, and the wall shear stresses on the osteocytes and dendritic processes are determined. The morphology of the LCN affects the shear stress values sensed by the osteocyte cell membrane and cell processes. Therefore, the details of how confocal image-based models are developed can be valuable in understanding osteocyte mechanosensation and can lay the groundwork for future studies in this area.

<meta charset="utf8"></head><body>골세포(osteocyte)의 분석 및 이미징

This study outlines the method to visualize and develop three-dimensional (3D) models of osteocytes within the lacunar-canalicular network (LCN) for computational fluid dynamics (CFD) analysis. The generated models using this method help to understand osteocyte mechanosensation in healthy or diseased bones.

골세포(osteocyte)의 분석 및 이미징

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

GFP 발현 골세포의 쥐 두개골 분획을 통한 1차 골세포 획득

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절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

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쥐에 있는 Periosteal 골격 줄기 세포의 CCL5 유도된 이동의 실시간 화상 진찰

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

기본 마우스 조골 세포에서 골 세포 배양을 구하는 레티노 산의 적용

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

골세포(osteocyte)의 분석 및 이미징

골세포(osteocyte)의 분석 및 이미징

골세포(osteocyte)의 분석 및 이미징

마우스 골수에서 파골 세포의 유도