עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק JSPS KAKENHI מהאגודה היפנית לקידום המדע (מס' 19K10397 ל- H.K. ומס' 18K09862 ל- I.M).

כל ההליכים והטיפול בבעלי חיים בוצעו בהתאם לכללים ולתקנות של אוניברסיטת טוהוקו.
1. דיסקציה של קלבריה עכבר dmp1-topaz שזה עתה נולד
<ol><li>עבור פרוטוקול זה, השתמש בגורים בני 6\u20127 של עכברי C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. הרדימו עכברים עם שאיפת איזופלורן 5% ולאחר מכן העבירו את הגורים לאתנול 70%.</li>
	<li>העבירו את הגור שעבר המתת חסד לצלחת תרבית לא מטופלת.</li>
	<li>בעזרת מספריים ופינצטה, לתפוס את העור בבסיס הגולגולת ולעשות חתך.</li>
	<li>באמצעות החתך הראשון כנקודת מוצא, לחתוך משני הצדדים הרוחביים של הגולגולת מול האוזניים, להסיר את העור, ולחשוף את calvaria.</li>
	<li>החזיקו את הראש מגשר האף וחתכו את הקלבריה לאורך תפר הלמבדואיד. חותכים לאורך הקצוות הרוחביים של עצמות הקודקוד ומרחיבים אותו כך שיכלול את החלק הקדמי.</li>
	<li>להפריד את calvaria מרקמת המוח הבסיסית. הערה: כדי להבטיח קלבריה גרמית נקייה עם חיבור רקמות רכות מינימלי לא לחתוך עמוק לתוך העצם; לשם השוואה, אדם צריך להיות מסוגל לראות את הצל של המספריים מתחת לעצם.</li>
	<li>מעבירים את הקלבריה לתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4 לאורך כל הפרוטוקול). ודא שהחלק הקעור פונה כלפי מעלה.</li>
</ol>2. שבירה של קלבריה עכבר שזה עתה נולד
<ol><li>מעבירים עד 5 קלבריה לצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של תמיסת קולגנאז 2 מ"ג/מ"ל. יש להשתמש בתמיסת collagenase טרייה שהוכנה ממש לפני השימוש.<ol><li>להכנת תמיסת collagenase טרייה, יש להוסיף אבקת collagenase למאגר בידוד (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM סורביטול,3 mM K 2 HPO4, 1 mM CaCl 2, אלבומין בסרום בקר 1 מ"ג/מ"ל (BSA), 5 מ"ג/מ"ל גלוקוז ו-25 מ"מ HEPES) במינון2מ"ג/מ"ל. ממיסים את אבקת הקולגנאז על מערבל מגנטי.</li>
		<li>הפעל את תמיסת הקולגנאז דרך יחידת מסנן סטרילית של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל ושמור אותה על קרח לאורך כל הפרוטוקול.</li>
	</ol></li>
	<li>לדגור את calvaria ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד כדי לקבל חלק 1.</li>
	<li>השליכו את העיכול של חלק 1, שטפו את הקלבריה עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) והשליכו את השטיפה.</li>
	<li>לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של 5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS, PH 7.4 ב 37 ° C במשך 15 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.</li>
	<li>לאסוף את digest בצינור חרוטי 50 מ"ל. לשטוף את calvaria עם 5 מ"ל של PBS ולהוסיף את פתרון לשטוף לעכל. הערה: בכל נקודה של איסוף העיכול והשטיפה, פיפטה של העצמות בתמיסה שלהם כדי לנתק את התאים מהעצם ולמנוע כפילויות וצברי תאים.</li>
	<li>כדי להשיג חלק 2, צנטריפוגה את העיכול ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה ב-8 מ"ל של α-Minimum Essential Medium (MEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 100 IU/מ"ל פניצילין G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. זרעו על צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ. לדגור על חלק 2 ב 37 ° C תחת 5% CO2.</li>
	<li>לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.</li>
	<li>כדי לאסוף את מקטע 3, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 3 ב 37 ° C תחת 5% CO2. הערה: בשלב זה, העצמות יהפכו קטנות יותר, והן יצטמצמו לרסיסים. כדי להבטיח שאף עצם לא יישאב בטעות לתוך העיכול, מה שמוביל לאובדן תאים בתהליך, השתמשו בפיפטת קצה קטנה לאיסוף העיכול (1000\u2012200 μL פיפטה קצוות).</li>
	<li>לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 ° C במשך 20 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.</li>
	<li>כדי לאסוף את מקטע 4, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 4 ב 37 ° C תחת 5% CO2.</li>
	<li>לדגור את calvaria ב 5 מ"ל של 5 mM EDTA המכיל 1 מ"ג / מ"ל BSA ב PBS (pH 7.4) ב 37 ° C במשך 15 דקות על שייקר ב 300 סל"ד.</li>
	<li>כדי לאסוף את מקטע 5, חזור על שלבים 2.5\u20122.6. לדגור על חלק 5 ב 37 ° C תחת 5% CO2. אוסטיאוציטים יכולים להיות מוכנים למיון באותו יום או בתרבית עד 24 שעות לפני המיון.</li>
</ol>3. הכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי
<ol><li>שאפו את המדיום של כל חלק תא ושטפו בעדינות עם 10 מ"ל PBS פעמיים.</li>
	<li>הוסף 5 מ"ל של 0.5% טריפסין-EDTA ב- PBS ודגור על התאים במשך 5 דקות ב 37 ° C. הוסף 5 מ"ל של 10% FBS α-MEM ופיפטה כדי לנתק את התאים בעדינות. שלב את התאים בכל שבר על ידי סינון דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS ולאסוף על ידי סינון דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 10% FBS α-MEM לכדור. התאם את ריכוז התא לכ- 1 x 107 תאים/מ"ל.</li>
	<li>סנן את התאים בצינור רשת ניילון בגודל 35 מיקרומטר. התאים מוכנים כעת ל- FACS.</li>
	<li>עבור פרוטוקול זה, השתמש בפייה בגודל 100 מיקרומטר. נוזל האיסוף צריך להיות מורכב מ -10% FBS α-MEM. יש לשמור את הדגימה ממוינת בטמפרטורה של 4°C בכל המיון, במידת האפשר.</li>
	<li>לפני המיון, מטב את ה- gating להסרת לכלוכים ותאים על-ידי התאמת אזור הפיזור הצדדי (SSC) ואזור הפיזור הקדמי (FSC). בטל כפילויות על-ידי התאמת רוחב SSC לעומת גובה SSC ואזור FSC לעומת רוחב FSC. יש להשתמש באוסטיאוציטים שליליים של GFP כבקרה להתאמת הפרמטרים של מכשיר המיון.</li>
	<li>לאחר השלמת איסוף התאים, צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. לשטוף תאים עם PBS. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.</li>
	<li>השעה מחדש את התאים והתאם את המספר לפי הצורך באמצעות 10% FBS α-MEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro.">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li><li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+Wnt/&#946;-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis.">Osteocyte Wnt/&#946;-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li><li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models.">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro.">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li><li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines.">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li><li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+(TSI).">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation,+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene.">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li><li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes.">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li><li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression.">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li><li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology.">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li><li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

האוסטיאוציטים המבודדים הראשונים היו מקלבריה עוף7 שבודד באמצעות (OB7.3) או הגרסה העופית של PHEX; עם זאת, שיטה זו מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים מעשיים, כמו נוגדנים ספציפיים אוסטיאוציטים כי הם גם ספציפיים specie צריך להיות מיוצר. החוקרים השתמשו בשינוי שונה של התהליך האנזימטי הרציף כדי לקבל אוסטיאוציטים מעצמות ארוכות של עכברים וחולדות; הטוהר המדווח של תרבויות אלה נקבע על כ-70%9. פיתוח מודל עכבר ה-cre איפשר הנדסת אוסטיאוציטים, המבטאים GFP על פני השטח שלהם. מודל עכבר זה, יחד עם FACS, שימש להשגת תרביות טהורות של אוסטיאוציטים ראשוניים20.
אנו משמיטים את השימוש בשברים 1 ובשברים 6\u20128 מכיוון שכמויות קטנות של אוסטיאוציטים יורדות בשברים אלה. שימוש בשברים 2\u20125 נותן את התשואה הטובה ביותר האפשרית של אוסטיאוציטים על פני זמן העיבוד הקצר ביותר; זה מגביל את זמן הטיפול של אוסטיאוציטים ופועל למניעת מוות תאי או שינוי אפשרי באיתות התא כתוצאה מהלחץ שהתא נתון בו במהלך השבירה. אנו גם תרבית אוסטיאוציטים במשך 24 שעות לפני המיון, אשר כברירת מחדל, אינו כולל תאים מתרחיפים שאינם דבקים (תאים hematopoietic) במהלך הכנת המיון. זה ממזער זיהום על ידי תאים hematopoietic המבטאים GFP22. זרימת העבודה המסופקת בפרוטוקול זה מנצלת את שיטות23 שפורסמו בעבר ומקצרת את הזמן מהסוג המאפשר התאוששות אוסטיאוציטים יעילה ומהירה עם זיהום מינימלי.
שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים השגת קלבריה גרמית נקייה וחיתוך רקמות רכות מהמוח או מרקמת החיבור המחוברת לעצם כדי להגביל את הזיהום של תאים דבקים (פיברובלסטים ותאים עצביים). כמו כן, צנרת התאים בשלבים הכוללים קבלה ושטיפה של העיכול היא קריטית, שכן אגרגטים וכפילים של תאים נקראים כפסולת במהלך המיון ויתרמו לתפוקה נמוכה של אוסטיאוציטים.
ניתן למיין אוסטיאוציטים ללא תרבית מוקדמת. עם זאת, משמעות הדבר היא כי מספר גבוה יותר של תאים צריך להיות ממוין, להגדיל את הזמן של הסוג ולהגדיל את הסיכוי של זיהום hematopoietic. ניתן למתן זאת על ידי החלת דלדול תאים המטופויטיים לפני המיון. עם זאת, זה מס ולא מומלץ לניתוח מעבדה שגרתי אצווה22. בעיות עלולות להתעורר בעת מיון עקב נוכחות של צברי תאים גדולים וכפילים סותמים את זרימת הנוזל של מכונת המיון. בפרוטוקול שלנו, זה לא היה בעיה, אבל זה יכול להיפתר על ידי הפחתת תוכן FBS של מאגר מיון (פחות מ -10%).
פרוטוקול זה אינו מגיע ללא מגבלות. שיטה זו משתמשת באוסטיאוציטים של עכברים, שאינם דומים לחלוטין לאוסטיאוציטים אנושיים. זה מגביל את הרחבת התוצאות המתקבלות על ידי חקר אוסטיאוציטים מורין לתוצאות קליניות משמעותיות. פרוטוקולים לבידוד אוסטיאוציטים אנושיים תוארו24, והחוקרים מעודדים להשתמש במיני התאים המשרתים בצורה הטובה ביותר את מטרותיהם. בדומה לפרוטוקולים אחרים, כמויות האוסטיאוציטים המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה מוגבלות, ומספר רב של עכברים נדרשים לאנליזה בקנה מידה גדול, אולם על ידי הפחתת הזמן הדרוש להכנת ומיון אוסטיאוציטים, ניתן לרכוש כמויות גדולות יותר של תאים במסגרת זמן אחת.
אוסטיאוציטים המתקבלים בתהליך זה יכולים לשמש לתרבית נוספת ולתרבות משותפת, ניתוח ביטוי גנים, ניתוח במורד הזרם של הפעלת / עיכוב המצע, חיטוט מולקולרי ויישומי צביעה. תאים ראשוניים יכולים לשמש גם לבניית מודל תלת-ממדי של מטריצת אוסטיאוציטים הדומה לסביבה האוסטיאוציטית הטבעית לחקר מכנוטרנסדוקציה ומכנוסנסינג.

אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים מאבות אוסטאובלסטיים שהוטמעו במטריצה המופרשת שלהם1. הם התאים הנפוצים ביותר ומאריכי החיים ביותר בקרב אוכלוסיות תאי עצם. הם שוכנים בתוך לאקונה ויש להם מורפולוגיה סטלטלית אופיינית עם דנדריטים המשתרעים דרך ערוצים הנקראים canaliculi ויוצרים רשת נרחבת של תקשורת וחילופי חילוף חומרים עם סביבתם ומשטח העצם2. אוסטיאוציטים כוריאוגרפים הן אוסטאובלסטים והן אוסטאוקלסטים תפקידים בעיצוב מחדש של העצם, הם התאים המכנו-סנסוריים העיקריים המעניקים הסתגלות לעומס מכני3, מעורבים בהומאוסטזיס פוספט4 ובמינרליזציה של מטריצת עצם5, ויחד עם המערכת הלאקונקנאליקולרית, הם פועלים כאיבר אנדוקריני המאותת לרקמות מרוחקות6.
אוסטיאוציטים ממוקמים בתוך מטריצה מינרלית, המגבילה את הנגישות והופכת את בידודם למאתגר, ובכך מעכבת חקירה חוץ גופית. אחת משיטות הבידוד הראשונות תיארה אוסטיאוציטים מבודדים מקלבריה עוף באמצעות נוגדן חד-שבטי ספציפי לאוסטאוציטים (OB7.3)7 אשר מאוחר יותר נודע כגרסה העופות של PHEX (גן מווסת PHosphate עם הומולוגיה לאנדופפטידאזות על כרומוזום X)8. חוקרים אחרים השתמשו בעיכול רציף של חולדה 9 או עכבר 10 עצמות ארוכות כדי להשיג שברים עשירים באוסטיאוציטים שבהם דווח על טוהר אוסטיאוציטים בסביבות70%9. מגבלות הליך זה כוללות את הטוהר התת-אופטימלי של תרביות מזוהמות בסוגי תאים אחרים מלבד אוסטיאוציטים, וכי אוסטיאוציטים עלולים להיות מגודלים על ידי תאים אחרים בתרבית מכיוון שאוסטיאוציטים איבדו את היכולת להתחלק. אתגרים אלה מגבילים את השימושיות של תרבויות ארוכות טווח.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחו קווי תאים אוסטיאוציטים שונים. קו התאים MLO-Y411 וקו התאים MLO-A512 הם בעיקר קווי התאים הנחקרים ביותר אשר שימושיים לחקר אוסטיאוציטים בשלב מוקדם; עם זאת, הם פחות שימושיים לחקר איתות אוסטיאוציטים בוגר מכיוון שהם מבטאים רמות נמוכות של סקלרוסטין ו- FGF2313, שניהם סמני אוסטיאוציטים בוגרים. קווי תאים אחרים, כולל IDG-SW3 14 ו- Ocy45415, מבטאים רמות גבוהות של סקלרוסטין ו- FGF23 ושימושיים בחקר שלב האוסטיאוציטים המאוחר. קווי תאים מתגלים ככלי מחקר שימושי; עם זאת, הם אינם באים ללא מגבלות מכיוון שהם אינם מייצגים באופן מלא את הביולוגיה של התא הראשוני. קווי תאים שונים מייצגים שלבים התפתחותיים שונים של ספקטרום הבשלות של אוסטיאוציטים, וקווי תאים אינם מייצגים את ההטרוגניות של אוסטיאוציטים ראשוניים16,17.
כדי להשיג תרביות טהורות של אוסטיאוציטים ראשוניים, החוקרים ניצלו את מודל עכבר CRE שבו מקדם dmp1 של 8-kb משמש להנעת ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באוסטיאוציטים18,19. עכברים טרנסגניים כפולים (pOB-Col 2.3- GFP-cyan ו- DMP1-GFP-topaz) על ידי Paic et al.19 ועכברים טרנסגניים dmp1-topaz על ידי Nakashima et al.20 שימשו להשגת אוכלוסיות אוסטיאוציטים. שבו הם השתמשו בעיכול רציף ו- FACS של אוסטיאוציטים המבטאים GFP כדי לרכוש תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים 19,20. כיוון ה-cre בעכבר הכתב Ai9 של 10 קילו-בתים dmp1, המפעיל את חלבון tdTomato, הוכח כקיים באוסטיאוציטים, אוסטאובלסטים, שרירים ותאים בתוך מח העצם. למקדם dmp1 של 8 קילובייט הייתה תבנית ביטוי זהה, אך רק חלק מהאוסטאובלסטים ותאי מח העצם ביטאו את החלבון, מה שמצביע על כך שמקדם dmp1 של 8 קילובייט הוא ספציפי יותר21. למרות זאת, יש לפרש בזהירות את התוצאות המתקבלות באמצעות מקדם dmp1 8-kb, ופרופילי ביטוי גנים צריכים להתבצע באופן שגרתי באמצעות סמנים ספציפיים לאוסטאובלסטים לעומת אוסטאובלסטים כדי להבטיח שהאוכלוסייה המתקבלת היא בעלת טוהר גבוה מספיק.
סמני אוסטאוקלסט OSCAR ו- Dcstamp נמצאו באוכלוסיות אוסטיאוציטים לא מדולדלים לעומת אוכלוסיות אוסטיאוציטים מדולדלות, ממצא זה הוביל את המחברים למסקנה כי תקצירים המתקבלים משברים של 8-kb dmp1-topaz קלבריה יילודים ומיון GFP מזוהמים בתאים המטופויטיים. ניתן היה למתן את הזיהום בתאים המטופויטיים על ידי הידוק שער המיון של GFP, מאחר שלתאים המטופויטיים חיוביים ל-GFP הייתה עוצמת GFP נמוכה באופן סביר מאשר לתאים מזנכימליים חיוביים ל-GFP (אוסטיאוציטים)22.
השיטות לחקר אוסטיאוציטים במבחנה תרמו לעושר המידע האחרון על ביולוגיה של אוסטיאוציטים. עם זאת, בידוד אוסטיאוציטים נותר הליך עתיר עבודה וארוך עם תפוקת תאים נמוכה. השיטה המתוארת של עיכול עצם באמצעות collagenase ו EDTA לעתים קרובות עד חלק 823, לוקח כמה שעות שבהן כדאיות אוסטיאוציטים הוא מס. חוקרים דיווחו על שימוש בשברים (2\u20125) למיון תאים 20, והראו כי פרופיל הביטוי של גנים הקשורים לאוסטיאוציטים לעומת אלה של אוסטאובלסטים מאשר את ההצלחה של בידוד אוכלוסיות אוסטיאוציטים טהורים20. במאמר זה נתאר את תהליך קבלת השברים (2\u20125), ונשווה את תפוקת האוסטיאוציטים מכל שבר החל משבריב 1 עד 8 כדי לקבוע את חזרתם של אוסטיאוציטים בכל שבר. אנו מתארים גם את הדיסקציה של קלבריה עכבר dmp1-topaz שזה עתה נולד ועיכול קלווריאלי באמצעות collagenase וחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), כמו גם הכנת תאים עבור FACS.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Data aquisition and analysis</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &amp;mu;m nylon mesh.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td>034-22363</td><td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td></td><td></td><td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Millex Sterile Filter Unit</td><td>Merck Millipore, Ireland</td><td>SLGV033RS</td><td>0.22&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Nylon cell strainer</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, USA</td><td></td><td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td></td><td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &amp;mu;g/ml streptomycin</td></tr></tbody></table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

האוסטאוציט, שבעבר נחשב לתושב פסיבי של העצם בהתחשב בתפקוד מאחורי הקלעים של חישת עומס מכני, מובא כעת לאור הזרקורים והוכח שיש לו פונקציות עיקריות רבות כמו שינוי פעיל של המטריצה החוץ תאית ויצירת איבר אנדוקריני עם המערכת הלאקונקנאליקולרית התוחמת אותו ושולח הודעות לאתרים מרוחקים. הודות לשיטות שאפשרו לבחון את האוסטיאוציטים במבחנה מבידוד אוסטיאוציטים ראשוניים לשורות תאים דמויי אוסטיאוציטים, אוסטיאוציטים חווים כעת עניין מהדהד ונחשול של ידע על מבנה ותפקוד. היבטים רבים של הביולוגיה של אוסטיאוציטים ואינטראקציה עם רכיבים מולקולריים אחרים עדיין לא התגלו. בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את הבידוד היעיל של אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה של עכבר ילודים dmp1-topaz, המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באוסטיאוציטים, באמצעות שבירת תאים ולאחר מכן רכישת תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים על ידי FACS.

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את התהליך של קבלת תרביות של אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה של עכבר ילודים dmp1-topaz באמצעות תהליך שבר באמצעות collagenase כדי לפרק את מטריצת הקולגן ו- EDTA עבור כלציית סידן, ולאחר מכן תאים מוכנים ל- FACS כדי להפריד אוסטיאוציטים מאוכלוסיות תאים אחרות.
שיטות להשגת אוסטיאוציטים ראשוניים מקלבריה עכברית ילודים מתארות לעתים קרובות את השימוש בשברים (1\u20128) למיון23. כדי לבחון את יעילותה של שיטה זו, השווינו את תפוקת האוסטיאוציטים שהתקבלו מקלבריה אחת של עכבר dmp1-topaz, החל משברים 1 עד 8. שברים 1\u20128 מוינו בנפרד כדי לקבוע את אחוז ותפוקת האוסטיאוציטים מכל שבר. לאחר המיון, תרבנו אוסטיאוציטים במשך 24 שעות על צלחת של 96 בארות כדי להשוות את צפיפות תאי הזרעים. צפיפות האוסטיאוציטים בשברים 2-u20125 מוצגת כגבוהה יותר מזו של שבר 1, וצפיפות האוסטיאוציטים מתחילה לרדת במידה ניכרת בשברים 6, 7 ו-8 (איור 1A).
אף על פי שאחוז האוסטיאוציטים המתקבל בין כל השברים אינו מובהק סטטיסטית (איור 1B), צפיפות האוסטיאוציטים שונה באופן דרמטי. חוקרים20 דיווחו על שימוש בשברים 2\u20125 לבידוד אוסטיאוציטים באמצעות FACS, ואנו מראים באיור 1 ששימוש בשברים 2\u20125 מייעל את התהליך לקבלת אוסטיאוציטים ומקצר את זמן המיון.
איור 2 מראה את מספר התאים ואסטרטגיית ה-gating שתורגלו כדי לבודד תאים חיוביים ל-GFP מתאים שליליים ל-GFP, שבהם תאים שהתקבלו באמצעות שבירה של קלבריה עכברית שלילית ל-GFP שימשו כביקורת. אוסטיאוציטים שהתקבלו בשיטה זו נותחו לביטוי גנים של Dmp1 ו- SOST, שהם סמני אוסטיאוציטים ידועים. ביטויי mRNA של Dmp1 ו-SOST גבוהים יותר אצל אוסטיאוציטים בהשוואה למקטע 2 שלפני המיון, שידוע כפרק אוסטאובלסט גבוה (איור 3A). איור 3B מראה את המורפולוגיה של אוסטיאוציטים חיוביים ל-GFP השומרים על צורה מהממת עם דנדריטים המשתרעים מגוף התא בתרבית במשך 24 שעות על צלחת תרבית פלסטיק לאחר המיון.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61513/61513fig01.jpg"> איור 1: יעילות של שבר אוסטיאוציטים. (A) תמונות מיקרוסקופיות של צפיפות האוסטיאוציטים משברים 1\u20128 שנזרעו על לוח בן 96 בארות שנלכדו לאחר 24 שעות מאותו סוג. לשברים 2\u20125 צפיפות תאים גבוהה יותר מאשר לשברים 1 ו-6\u20128. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) אחוז האוסטיאוציטים המתקבלים משברים 1\u20128 כפי שנמדד על ידי תוכנת ציטומטר הזרימה. התוצאות נגזרות משלושה ניסויים מייצגים נפרדים. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61513/61513fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61513/61513fig02.jpg"> איור 2: בידוד של אוסטיאוציטים חיוביים ל-GFP באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. הלוח העליון מייצג תאים שבודדו מ-C57Bl/6J littermate calvaria שלילי ל-GFP כבקרת סף GFP. הפאנל התחתון מייצג את מספר התאים ובקרת ה-gating הנהוגה לבידוד אוסטיאוציטים חיוביים ל-GFP מתאים שליליים ל-GFP במקטע 2 המתקבל מקלבריה עכברית dmp1-topaz. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61513/61513fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61513/61513fig03.jpg"> איור 3: אפיון אוסטאוציטים לאחר מיון. (A) ביטוי mRNA יחסי של Dmp1 ו-SOST של תאי שבר 2 בתרבית במשך 24 שעות ואוסטיאוציטים בתרבית במשך 24 שעות לאחר המיון. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. הבדלים סטטיסטיים זוהו באמצעות מבחן t של התלמיד: * p < 0.05, **p < 0.01. (B) תמונה מיקרוסקופית של אוסטאוציטים השומרים על דנדריטים המשתרעים החוצה מגוף התא בתרבית במשך 24 שעות לאחר המיון. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61513/61513fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes at JoVE.com

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

פרוטוקול זה מתאר דיסקציה של קלבריה עכברית dmp1-topaz בילוד ובידוד של אוסטיאוציטים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באמצעות עיכול ושבירה של תאים, בנוסף להכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).

השגת אוסטיאוציטים ראשוניים באמצעות שבר קלוואריאלי מוריני של אוסטיאוציטים המבטאים GFP

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

2.0K Views.  Tohoku University Graduate School of Dentistry. פרוטוקול זה מתאר דיסקציה של קלבריה עכברית dmp1-topaz בילוד ובידוד של אוסטיאוציטים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק באמצעות עיכול ושבירה של תאים, בנוסף להכנת אוסטיאוציטים למיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).

Video: Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Developmental Biology

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medicine

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, are responsible for the mechanosensory function of bone tissue. Studies employing histology, mathematical modeling, cell culture, and ex vivo bone organ cultures have greatly advanced the understanding of osteocyte mechanobiology. However, the fundamental question of how osteocytes respond to and encode mechanical information at the molecular level in vivo is not well understood. Intracellular calcium concentration fluctuations in osteocytes offer a useful target for learning more about acute bone mechanotransduction mechanisms. Here, we report a method for studying osteocyte mechanobiology in vivo, combining a mouse strain with a fluorescently genetically encoded calcium indicator expressed in osteocytes with an in vivo loading and imaging system to directly detect osteocyte calcium levels during loading. This is achieved with a three-point bending device that can deliver well-defined mechanical loads to the third metatarsal of living mice while simultaneously monitoring fluorescently indicated calcium responses of osteocytes using two-photon microscopy. This technique allows for direct in vivo observation of osteocyte calcium signaling events in response to whole bone loading and is useful in the endeavor to reveal mechanisms in osteocyte mechanobiology.

The current article describes performing an intravital imaging approach to observe mechanically induced calcium signaling of embedded osteocytes in vivo in real-time in response to tissue-level mechanical loading of the mouse third metatarsal.

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, ...

Bioengineering

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Neuroscience

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

<meta charset="utf8"></head><body>מידול תלת ממדי של אוסטיאוציטים לניתוח CFD לחקר מכנוסנסציה בעצם

Analysis and Imaging of Osteocytes

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological pathways in a process known as mechanotransduction. Confocal image-derived models of osteocyte networks are a valuable tool for conducting Computational Fluid Dynamics&#160;(CFD) analysis to evaluate shear stresses on the osteocyte membrane, which cannot be determined by direct measurement. Computational modeling using these high-resolution images of the microstructural architecture of bone was used to numerically simulate the mechanical loading exerted on bone and understand the load-induced stimulation of osteocytes.
This study elaborates on the methods to develop 3D single osteocyte models using confocal microscope images of the Lacunar-Canalicular Network&#160;(LCN) to perform CFD analysis utilizing various computational modeling software. Prior to confocal microscopy, the mouse bones are sectioned and stained with Fluorescein isothiocyanate (FITC) dye to label the LCN. At 100x resolution, Z-stack images are collected using a confocal microscope and imported into MIMICS software (3D image-based processing software) to construct a surface model of the LCN and osteocyte-dendritic processes.
These surfaces are then subtracted using a Boolean operation in 3-Matic software (3D data optimization software) to model the lacunar fluidic space around the osteocyte cell body and canalicular space around the dendrites containing lacunocanalicular fluid. 3D volumetric fluid geometry is imported into ANSYS software (simulation software) for CFD analysis. ANSYS CFX (CFD software) is used to apply physiological loading on the bone as fluid pressure, and the wall shear stresses on the osteocytes and dendritic processes are determined. The morphology of the LCN affects the shear stress values sensed by the osteocyte cell membrane and cell processes. Therefore, the details of how confocal image-based models are developed can be valuable in understanding osteocyte mechanosensation and can lay the groundwork for future studies in this area.

<meta charset="utf8"></head><body>ניתוח והדמיה של אוסטיאוציטים

This study outlines the method to visualize and develop three-dimensional (3D) models of osteocytes within the lacunar-canalicular network (LCN) for computational fluid dynamics (CFD) analysis. The generated models using this method help to understand osteocyte mechanosensation in healthy or diseased bones.

ניתוח והדמיה של אוסטיאוציטים

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological ...

השגת אוסטיאוציטים ראשוניים באמצעות שבר קלוואריאלי מוריני של אוסטיאוציטים המבטאים GFP

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

עוקב

התמיינות ואפיון אוסטאוקלסטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

ניתוח והדמיה של אוסטיאוציטים

ניתוח והדמיה של אוסטיאוציטים

ניתוח והדמיה של אוסטיאוציטים