Name: osteoclast derivation from mouse bone marrow
Uploaded: 2014-11-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Biz NIH hibe R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, Oak Vakfı ve Pediatrik Rejeneratif Tıp Hagey Laboratuvarı destek için minnettarım.

NOT: Etik deyimi: omurgalı hayvanları da içeren tüm araştırmalar Laboratuvar Hayvan Bakım Stanford İdari Paneli (APLAC) tarafından onaylanan uyarınca protokoller yapıldı. 1. Hazırlık <ol><li> Ticari olarak temin edilebilen yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı, 10 ml, 50 ml konik bir tüp içinde oda sıcaklığına gelmeye (polisükroz ve sodyum Diatrizoate içeren, 1,077 gr / ml&#39;lik bir yoğunluğa ayarlanır) izin verin. </li><li> Akış sitometrik hazırlayın (FACS) 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ve% 2 fetal buzağı serumu (FCS) ile tampon. 50 ml&#39;lik bir şişe almak ve yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı aşama esnasında kullanım için, oda sıcaklığında, bu kısım korumak. </li><li> Izolasyon prosedürü sırasında izole doku ve hücreleri korumak için hazır bir kova buz var. </li></ol> 2. Kültür Medya hazırlayın <ol><li> Bazal ortam hazırlayın: MEM (Minimal Essential Medium), fenol kırmızısı (500 mi), glutamat (1x) olmadan FCS (10x), 10,000 birim / ml penisilinn, (1x). </li><li> 0.22 mikron filtre ile bazal ortamı Filtre. </li><li> Kemik iliği makrofaj indüksiyon ortamı hazırlayın: <ol><li> Aşama 2.1&#39;de üretilmiş olan bazal ortam, 50 ml alın. </li><li> 10 7 M nihai konsantrasyonda prostaglandin E2 (PGE2, Bay 352,465 g / mol) ilave edin. </li><li> 10 ng / ml&#39;de makrofaj-koloni uyarı faktörü (M-CSF) ekleyin. </li><li> Medya uyarıcı kemik iliği makrofaj nihai çözüm filtre etmeyin. </li></ol></li><li> Osteoklast indüksiyon ortamı hazırlayın: <ol><li> Aşama 2.1&#39;de üretilmiş olan bazal ortam, 50 ml alın. </li><li> Ekle 10 7 M nihai konsantrasyonda Prostaglandin E2 (PGE2, Bay 352,465 g / Mol) </li><li> 10 ng / ml&#39;de makrofaj-koloni uyarı faktörü (M-CSF) ekleyin. </li><li> 10 ng / ml&#39;de RANKL ekleyin. </li><li> Osteoklast indüksiyon ortamı nihai çözüm filtre etmeyin. </li></ol></li></ol> 3. Kemik İliği İzolasyonu <ol><li> Bir C57BL / 6 fare öldürülürservikal dislokasyon karbondioksit inhalasyonu yöntemi kullanılarak. NOT: Kemirgenler uygun teknik, donanım ve maddeleri kullanılarak eğitilmiş personel tarafından ötenazi gerekir. </li><li> Pozisyonu bir diseksiyon gemide fare güvenli ve% 70 alkol ile sprey ve. </li><li> Femur, fibula, humerusu ve omurga ayır. <ol><li> Yatar pozisyonda fare ile başlayın. Dikey alt ekstremite boyunca bir kesi yapmak ve yumuşak doku ekleri bölünmesi ile femur ve tibia uzunluğu boyunca diseksiyon ile başlar. Son olarak, iskelet tamamen kemikleri ücretsiz diz ve kalça eklemi kemikleri yerinden. </li><li> Humerus izole etmek için üst ekstremite uzunluğu boyunca bir kesi yapmaya devam edin. Yumuşak doku kapsül eki diseksiyon ile omuz ve dirsek eklemleri de humerus yerinden. </li><li> Fare eğilimli yatıyor böylece nihayet, üzerinde fareyi çevirin. Orta hatta, omurganın uzunluğu boyunca bir cilt kesi yapmak. Paravertebral yumuşak gözlemlemekparavertebral yumuşak doku kütle içinden kesme omurganın kemiksi kenarı boyunca omurga ve insizyon her tarafında dokusu gibi. Bir makas kullanma, boyun üssünde omurga boyunca yatay bir kesim yapmak ve yumuşak doku eki omurgayı kurtararak omurga, kuyruk ekleme hemen yakınına, sonunda. </li></ol></li><li> Kemikler hasat edildikten sonra, buz üzerinde FACS tampon saklayın. </li><li> Kemiklerden kas ve yumuşak doku temizlemek için kağıt mendil kullanın. </li><li> FACS tamponu, 3 ml olan bir havan ve tokmak kullanarak içine temizlenmiş kemikleri yerleştirin. </li><li> Havanda hafifçe kemikleri Crush. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden geçirilmesiyle 50 ml konik tüp içine kan lekeli sıvısı ve transferi kapalı aspirat. </li><li> 5 mi FACS ezilmiş kemiğe tampon ve daha fazla ezmek ekleyin. Yine, bir pipet kullanılarak, sıvıyı çıkarın ve 70 mikron süzgecinden 50 ml&#39;lik konik tüpe aktarın. </li><li> Tipik olarak, kemik TWI ezmekTaze FACS tampon çözeltisi içinde üç kez, sıvı kırmızı leke duruma gelene kadar, bir havan, taze FACS tampon ilave 5 ml ekleyerek, her zaman kullanarak ce. </li><li> Hücre topağı elde etmek için 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de kemik iliği çözeltisi santrifüjleyin. </li></ol> Kemik İliği Hücrelerinin 4. dereceli ayırma <ol><li> FACS tamponu, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon aspire (oda sıcaklığında muhafaza edilen). </li><li> Ticari olarak temin edilebilen yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı (RT) 10 ml içeren 50 ml&#39;lik konik bir tüp. </li><li> Yoğunluk gradyan hücre ayırma medya üzerine kemik iliği çözüm Katman. Yavaş yavaş elektrikli pipet kullanarak bunu. Açı pipet konik tüpün üstüne yakın iç yüzeyine karşı ucu ve yaklaşık 30 ° konik tüp eğin. Yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı rahatsız etmeyecek şekilde pipet üzerinde yavaş hız ayarını kullanarak, yavaşça kemik iliği çözüm sınırdışı. NOT: Sonuçta orada olacakİki çözümleri (hücresel çözüm ve yoğunluk gradyan hücre ayırma medya çözümü) arasında açık bir tanımı olabilir. </li><li> Bir RT santrifüj kullanılarak, 15 dakika boyunca 200 x g&#39;de dengeli bir santrifüjde yoğunluk gradyan hücre ayırma ortamı ve hücre çözeltisi santrifüj. Buna ek olarak, yoğunluk gradyanlı bir hücre ayırma ortamı gradyanı kullanılarak, yeterli faz ayrımını sağlamak için santrifüj üzerine hızlanma ve yavaşlama çıkarın. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, söz konusu kemik iliği hücreleri içeren parçalı orta tabaka aspire. </li><li> Yeni bir konik tüp içine bu hücreleri aktarın. Hücreleri yıkamak için (buz üzerinde tutulur), ek FACS tampon 20 ml ilave edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle 200 x g&#39;de santrifüjleyin bir hücre tanesinin elde edildi. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak hücre sayımı için izin vermek için ortam uyarıcı makrofaj 1 ml nihai hücre topağı tekrar. </li></ol> 5. Hücre Sayım <ol><li> Hücre çözeltisine 10 ul alın ve karıştırıntripan mavisi 10 ul. Yük elde edilen karışımı 10 ul bir hemositometrede üzerine püskürtüldüğü ve çözeltinin ml&#39;si başına hücre sayısı elde edilir. </li></ol> 6. Hücre Kültürleme <ol><li> 24 oyuklu plakanın her oyuğuna makrofaj uyarıcı ortam 2 ml yerleştirin. </li><li> Her kuyuya 200.000 hücreleri ekleyin. NOT: Bizim tecrübelerimize göre, hücre-kaplama yoğunluk osteoklastlann vitro kültürlenmesinde yeterli için en önemli gerekliliklerden biridir. </li><li> Yavaşça, 37 ° C&#39;de normal bir inkübatör plaka yeri ve çalkalayın. </li><li> 3 gün boyunca ortamı değiştirmek etmeyin. </li><li> Makrofaj uyarıcı medyada 3 gün sonra, osteoklast medya ortamı değiştirmek. </li><li> Bundan sonra, noktası, büyük, çok çekirdekli osteoklastlar kültür plaka üzerinde görünür olmalıdır hangi 5-7 gün, günlük ortamı değiştirmek. </li></ol> 7. Boyama ile Tartratın Dirençli Asit Fosfataz (TRAP) <ol><li> In vitro cul 5-7 gün sonraTüre, iyi kültürden ortamı aspire. </li><li> 1x PBS ile üç kez hafifçe kuyuları yıkayın. </li><li> % 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyerek hücreleri düzeltmek ve 4 ° C&#39;de 1 saat bekletin. </li><li> Bu süre boyunca, 37 ° C&#39;ye kadar ön ısıtma ile (ticari olarak temin edilebilir), TRAP leke hazırlar. </li><li> Paraformaldehid içinde 1 saat sonra, paraformaldehid aspire ve 1 x PBS ile hafifçe 3 kez yıkayın. </li><li> Plakanın her oyuğuna önceden ısıtılmış TRAP leke 1 ml ilave edilir lekelenmesine. </li><li> Işıktan korunan, 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde plaka koyun. </li><li> 1 saat sonra, TRAP leke aspire. </li><li> Önceden ısıtılmış deiyonize su ile gözler 3 kez yıkayın. </li><li> 1-2 dakika Gill&#39;ın Hematoksilin (DİKKAT) ile kuyu Counterstain. </li><li> Parlak bir alan mikroskobu kullanarak görüntü osteoklastlar. </li><li> Leke yeterli bir renk yoğunluğu kadar deiyonize su ile kuyu yıkayın çekirdekler blu görünür tipik zaman, elde edilirör. </li></ol> 8. Osteoklast Rezorpsiyon Deneyi <ol><li> Kemik alt-tabaka ya da bir inorganik kristal şeklinde kalsiyum fosfat kaplama ya ile önceden kaplanmış olan bir ticari olarak temin edilebilir 24 oyuklu polistiren kültür kaplarına kullanın. </li><li> Her bir kuyuya makrofaj uyarıcı ortam 2 ml yerleştirin. </li><li> Her bir oyuğa aşama 2 sonunda elde edilen 200,000 yeni izole edilmiş kemik iliği hücreleri ekleyin. </li><li> Yavaşça 3 gün boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde konulmadan önce, plakayı çalkalayın. </li><li> 3. günde, osteoklast farklılaşma medya ortamı değiştirmek. </li><li> 5-7 gün osteoklast farklılaşma medya ile günlük medya değişiklikleri gerçekleştirin. </li></ol> Osteoclast Resorpsiyon Faaliyet 9. Quantification <ol><li> Aşağıda açıklandığı gibi, mineralize alt-tabaka üzerinde osteoklast farklılaştırma ortamı içinde in vitro kültürü 5-7 gün sonra, resorpti oluşturmak osteoklastların yeteneğini değerlendirmek için, mineralli yüzeyini analizçukurları, osteoklastik aktivitenin bir göstergesi. </li><li> Erimesi tahlil plaka aspire medya ve her iyi% 10 çamaşır suyu çözeltisi 100 ul ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile hücreleri inkübe edin. </li><li> Damıtılmış su ile gözler 3 kez yıkayın. </li><li> Kalan suyu aspire ve plaka fazla suyu silkeleyin ve 3-5 saat kurumaya bırakın. </li><li> Piyasada mevcut Von Kossa boyama kiti ile plaka Counterstain un-rezorbe alt tabakanın kolay görünüm için izin. </li><li> Rezorbe yüzeyinin temsili parçaların görüntülerini çekmek için parlak bir alan mikroskobu kullanın. </li><li> Görüntü analiz yazılımı kullanılarak, osteoklastik kemik erimesini aktivitesinin ölçümü için izin vermek için rezorbe yüzeyinin yüzdesi hesaplanır. </li></ol>

<ol>
	<li>Sims, N. A., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+activities+of+bone+formation+and+resorption:+a+multitude+of+signals+within+the+basic+multicellular+unit.">Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit.</a> BoneKEy reports. 3, 481 (2014).</li><li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+cell+lineage+in+bone+using+a+chimaera+of+chick+and+quial+embryonic+tissue.">Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue.</a> Nature. 258, 325-327 (1975).</li><li>Walker, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+resorption+restored+in+osteopetrotic+mice+by+transplants+of+normal+bone+marrow+and+spleen+cells.">Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells.</a> Science. 190, 784-785 (1975).</li><li>Burger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+formation+of+osteoclasts+from+long-term+cultures+of+bone+marrow+mononuclear+phagocytes.">In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).</li><li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+where+comes+the+osteoclast.">From where comes the osteoclast.</a> The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bench+to+bedside:+elucidation+of+the+OPG-RANK-RANKL+pathway+and+the+development+of+denosumab.">Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab.</a> Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).</li><li>Brown, J. E., Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Denosumab+in+patients+with+cancer-a+surgical+strike+against+the+osteoclast.">Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).</li><li>Khosla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+the+OPG/RANKL/RANK+system.">Minireview: the OPG/RANKL/RANK system.</a> Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).</li><li>Boyle, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+MAPK+kinases+MKK3+and+MKK6+in+osteoclastogenesis+and+bone+loss.">Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss.</a> PloS one. 9, (2014).</li><li>Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand+and+osteoprotegerin+in+bone+cell+biology.">Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology.</a> Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).</li><li>Teramachi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IL-6+Expression+in+Osteoclasts+is+Necessary+but+not+Sufficient+for+the+Development+of+Paget's+Disease+of+Bone.">Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).</li><li>Catalfamo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+induced+and+intrinsic+alterations+in+type+2+diabetes-derived+osteoclast+function.">Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function.</a> Oral diseases. 19, 303-312 (2013).</li><li>Schueler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+injection+of+human+multiple+myeloma+cells+in+NOD/SCID+IL-2Rgamma(null)+mice+mimics+human+myeloma+and+serves+as+a+valuable+tool+for+the+development+of+anticancer+strategies.">Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL-Based+Osteoclastogenic+Assays+from+Murine+Bone+Marrow+Cells.">RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).</li><li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+Marrow-Derived+Macrophages+(BMM):+Isolation+and+Applications.">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH protocols. , (2008).</li><li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblasts+provide+a+suitable+microenvironment+for+the+action+of+receptor+activator+of+nuclear+factor-kappaB+ligand.">Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand.</a> Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).</li><li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE/RANKL.">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+osteoclast+development+and+function.">Genetic regulation of osteoclast development and function.</a> Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).</li><li>Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+disruptors+and+bone+metabolism.">Endocrine disruptors and bone metabolism.</a> Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).</li><li>Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+estrogen+and+androgen+receptors+in+bone+health+and+disease.">The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease.</a> Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).</li><li>Martin, T. J., Udagawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+osteoclast+function.">Hormonal regulation of osteoclast function.</a> Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts.">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130, 811-823 (2007).</li><li>Bellido, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+interleukin-6,+osteoclastogenesis,+and+bone+mass+by+androgens.+The+role+of+the+androgen+receptor.">Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor.</a> The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).</li><li>Roato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+among+cells+of+bone,+immune+system,+and+solid+tumors+leads+to+bone+metastases.">Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases.</a> Clinica., &amp; developmental immunology. 2013, (2013).</li><li>Autio, K. A., Morris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+bone+physiology+for+the+treatment+of+metastatic+prostate+cancer.">Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer.</a> Clinical advances in hematolog., &amp; oncology. 11, 134-143 (2013).</li><li>Sottnik, J. L., Keller, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+targeting+osteoclastic+activity+in+prostate+cancer+bone+metastases.">Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases.</a> Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).</li></ol>

Yazarların hiçbiri beyan açıklanmasını veya çıkar çatışması vardır.

Kolayca in vitro osteoklastlann sayıda izole ve yetiştirmek için bir yetenek kemik biyoloji ve osteoklast-aracılı hastalıkların anlayışı ilerletmek için yardımcı sorumlu olmuştur. Son zamanlarda osteoklast formasyonu, farklılaşma ve canlılık 16-18 başlıca düzenleyicisi olarak tespit edilmiştir zaman, bu yol RANKL ayırdedilebilmesidir. Kemik iliği osteoclastların in vitro kültürü ekim yoğunluğu büyük ölçüde bağımlı olan bizim deneyim oldu. Biz kemik iliği kaynaklı hücreler kaplama zaman osteoklastlan vermek üzere, bu protokolün başarısızlığı optimal ekim yoğunluğu nedeni genellikle olduğu görülmektedir. Bu nedenle, bu protokolde, bu, 24 çukurlu plaka başına 200,000 hücre tohum önerilir. Ayrıca, bu teknik ile yüksek bir başarı elde etmek için, tam da osteoklast indüksiyon ortamını hazırlamak için tavsiye edildiği gibidir ve s ortamı değiştirmek için tarif edildiği gibiame kez her gün, ilk 3 gün sonra, bir kültür plakaları rahatsız gerekmez olduğunda. Bu osteoklast indüksiyon ortamı faktörlerin sabit bir konsantrasyonu sağlayabilir. Buna ek olarak, özel reaktiflerin kullanımı da çok çekirdekli osteoklast çok sayıda kültür için büyük potansiyele olanak sağladığını bulmuşlardır. Bu teknik bir hızlanma ve yavaşlama parametreleri ve özel reaktiflerin tedarik değiştirebilir hangi bir RT santrifüj, kullanılabilirliği ile sınırlıdır. Aksi takdirde biz yaş ve genetik arka plan, farklı farelerin bir dizi, çok başarılı oldu hangi ile çok basit protokol, (örneğin, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, Lep db - / -). Bu teknik in vitro osteoklastlar üretmek ve mineralize matris emmek üzere yeteneklerini belirlemek için güvenilir bir yöntem sunuyor. Bu protokol kullanılarak, bu vitr içinde çok çekirdekli osteoklastlar çok sayıda izole edilmesi mümkündüro genellikle bir hafta içinde. Bizim deneyim osteoklast izolasyon ve in vitro kültürde sıklıkla osteoklastlan 9,12,14 yetiştirmek için bir yetersizlik ile sonuçlanan, osteoklast üretimi açısından son derece değişken sonuçların daha önce yayınlanmış teknikleri sonuçlarını kullanarak olmasıdır. Osteoklast fonksiyonu karmaşıktır ve kemik erimesi osteoblastlar ve osteoklastlar 19 arasındaki çapraz konuşma, lokal düzeyde aracılık ettiği bir derece organize bir süreçtir. Kemik denge lokal kontrolüne ek olarak, kanıtlar ortaya çıkan osteoklast aktivite, bağışıklık, nöronal ve diğer sistematik faktörlere 20-24 ile ilişkili faktörler tarafından sistemik tabi olduğunu göstermektedir. Osteoklast biyoloji anlayışı kemiğe 25-27 kanser metastaz düzenlemedeki rolleri kemik yeniden şekillenmesi arasında değişen süreçlere farklı bir rol de dahil olmak üzere, hızla ilerlemeye devam ettikçe, bu protokol araştırmacılar oluşur sağlayacakşayet in vitro osteoklastların büyük miktarlarda izole eder.

Kemik remodeling dinamik ve kemik erimesinin 1 ile kemik oluşumu birleştirmesini kapsar. Bu sıkı düzenlenmiş süreç normal homeostasisin sırasında iskeleti korunmasından sorumlu olup, yaralanma ve hastalığa karşı. Osteoklastlar kemik organik ve inorganik matris hem rezorbe yeteneğine sahip olan benzersiz sonunda, çok çekirdekli hücrelerdir. Osteoklastlar kemik iliği 2-5&#39;in monosit / makrofaj elde edilir. Osteoklast fonksiyonuna veya oluşumundaki anormallikler osteoporoz gibi yaygın durumlar dahil olmak üzere klinik durumlar, çeşitli neden olabilir. In vitro osteoklastlan oluşturmak için yeteneği kemik biyoloji 6 anlayışımızda önemli ilerlemeler sağladı. Bunun bir sonucu olarak, yeni terapötik maddeler, 7 önemli morbidite ve mortalite sorumlu olan osteoklast ile ilgili hastalıkların tedavisi için ortaya çıkmaktadır </s&gt; kadar. Kemik kütlesi ve gücü homeostatik bakım kemik oluşturan osteoblast ve kemik osteoklastı 8,9 uyumlu eylem gerektirir. Kemik homeostazı burada osteoklast aktivitesi, kemik kütlesi ve yoğunluğu 10 patojenik kaybına yol açar artış, menopoz sonrası osteoporoz da dahil olmak üzere bir dizi hastalık, değiştirilir. İnsan hastalığı, transgenik fare modelleri artmasıyla, insan kemik hastalığı 11-13 osteoklastların rolünü deşifre için daha fazla olanak vardır. Birçok varyasyon 9,12,14 anlatılmış olan osteoklast kültür teknikleri için çeşitli protokoller, literatürde yer almaktadır. Xing ve arkadaşları, fare kemik iliği hücrelerinden osteoclastogenic deneylerinin açıklamasında, aşağıda tarif edilen protokole benzer bir metodoloji tarif eder. Ancak uzun kemik hasat sonrası kemik iliği hücreleri çıkarmak için, Xing vd. Α-MEM tam ortam ile ilik boşluğu yıkayın14. Catalfamo, osteoklast fonksiyonuna hipergliseminin etkisini inceleyen ve hücreler, kemik iliği yıkama ile harekete geçirilen bir yöntem olup, en yapışmayan hücreler 12 atılır etmektedir, 24 saat boyunca kültürlenir tarif da Boyle ve diğerleri tarafından kullanılan bir tekniktir . 9 Bunlar daha önce yayınlanan protokolleri tek bir kemiğin iki ucunu kesmek gerekir aynı zamanda, bir iğne batması ve değerli kemik iliği kaybı riski tanıtır kemik iliği, sıkıcı bir uygulama, kızarma uygulamasını zorunlu kılmaktadır. Biz tarif protokolü, Weischenfeldt ve diğerleri tarafından tarif makrofaj izolasyon yöntemine benzer osteoklastlar izole etmek için bir havan ve tokmak kullanımını uygular. 15 Bizim deneyim, ancak, genellikle elde edilen, osteoklast üretimi açısından değişik sonuçlar, daha önce yayınlanmış teknikleri sonuçlarını kullanarak bu osteoklast izolasyonu ve in vitro kültür içindebir yetersizlik osteoklastlan yetiştirmek için. Bu nedenle, varlığında, ilk olarak makrofajlar ve daha sonra osteoklastlar oluşturan kaplama hücrelerinin% 70-80 yaklaşık verim ile in vitro olarak çok çekirdekli osteoklastlar çok sayıda üretmek üzere fare kemik iliği tutarlı izolasyonu sağlayan bir protokol tasarladılar osteoklast indüksiyon medya.

<table><tbody><tr><td>MEM, no glutamine, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF, recombinant mouse</td><td>Gibco</td><td>PMC2044</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; expressed)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>462-TEC-010</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr></tbody></table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Osteoklastlar kemik iliği monosit / makrofaj türetilen çok özel hücreler bulunmaktadır. Kemiğin organik ve inorganik matrisler hem emmek üzere onların sağlıyor bu iskeletin yeniden modellenmesini düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı anlamına gelir. Birlikte, osteoblastlar ve osteoklastlar kemik erimesini ve sağlık ve hastalık sırasında normal iskeleti korumak için birlikte hareket eden kemik oluşumunu hem içeren dinamik bağlantı işlemi için sorumludur. Vücutta ana kemik-rezorbe hücre olarak, osteoclast farklılaşmasında ve işlev değişikliklerin vücudun derin etkilere neden olabilir. Değiştirilmiş osteoklast fonksiyonuna bağlı hastalıklar, daha yaygın olarak, aşırı osteoklastik kemik erimesi oluşumunu kırılma yatkınlık olan osteoporoz, patolojileri gözlenen nedeniyle hematopoez için kemik iliği boşluk oluşturmak için başarısızlık öldürücü yenidoğan hastalığın şiddeti değişebilir. ent &quot;&gt; in vitro yüksek sayılarda osteoklastlan izole etmek için bir yeteneği kemik yeniden çevriminin anlaşılması önemli gelişmeler için izin verdi ve bu hastalıklar ile mücadele yeni tedavi stratejilerinin keşif için yol açmıştır. Burada, izole edilmesi ve osteoklastların sayıda verecek fare kemik iliğinden osteoclastların yetiştirmek için bir protokol açıklar.

<html> Bu yöntemin amacı, kolay bir hafta içinde, tipik olarak, in vitro olarak, osteoklastların sayıda izole edildi. Osteoklastların sayıda başarıyla izolasyonu, tartrat-dirençli asit fosfataz lekeleme (Şekil 1A) kullanılarak teyit edilmiştir. Büyük osteoklastlar çok çekirdekli (genellikle ≥ 3 çekirdekleri) ile büyük mor hücreler olarak görülür. Bu protokolü kullanarak, osteoklast ortalama olarak 30 kadar çekirdeklerin (Şekil 1B) ile osteoklastlan izole etmek yaygındır. Bir mineralize yüzey kullanarak, in vitro osteoklast kemik erimesini aktivitesini değerlendirmek altın standart yöntem olarak kabul edilir. Bu yöntemi kullanarak, oluşmuş mineralize yüzeyinin yüzdesi, ya da &quot;rezorpsiyon çukurları&quot; osteoklast kemik erimesini kapasitesinin belirlenmesi (Şekil 2) sağlar. _upload / 52.056 / 52056fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Osteoklast indükleyici koşullar altında kültür içinde 10 gün sonra kültür, kemik iliği Şekil 1. (A) &#39;Tartrate dirençli asit fosfataz boyama. 10X büyütmede Aydınlık alan mikrograf pozitif (mor boyama) TUZAK birden çok büyük, çok-çekirdekli osteoklastlar göstermektedir. Büyük, çok çekirdekli osteoklast bir örneği, bir kırmızı bir kesikli çizgi ile gösterilmiştir. (B), parlak saha mikrografını bir geniş, çok çekirdekli, TRAP pozitif osteoklast gösteren 10X bir büyütmede gösterilmiştir. Bir çok çekirdekli osteoklast içinde bir çekirdek bir örnek kırmızı okla gösterilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52056/52056fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52056/52056fig2highres.jpg" width="500" /><br/&gt; 10X büyütmede Şekil 2. Parlak alan mikrograf osteoklastik rezorpsiyon aktivitesi tarafından oluşturulan erimesi çukurları gösteriyor. Mineralize matris görünüm için izin Von Kossa boyası ile boyandı. Siyah çizgiler matrisi rezorbe alanların örneği ana hatlarıyla kesik. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52056/52056fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow at JoVE.com

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

osteoclast-derivation-from-mouse-bone-marrow

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

24.0K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine.  Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. 

Video: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Kanser Araştırmaları

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Gelişim Biyolojisi

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Yalıtım, kültür ve kemik iliği Stromal hücreler ve Osteoklast ataları fareler gelen farklılaşma

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murin Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon ve Kemik İliği İzolasyonu

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Biyolojik uyumluluğu Biyomalzeme kemik rejenerasyon için profil sayfası

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Biyomühendislik

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a single-cell suspension for further use in embryoid body induction. Following mesodermal induction, embryoid bodies undergo hematopoietic differentiation, producing a floating hematopoietic cell population. Subsequently, the harvested hematopoietic cells undergo a macrophage colony-stimulating factor maturation step and, finally, osteoclast differentiation. After osteoclast differentiation, osteoclasts are characterized by staining for TRAP in conjunction with a methyl green nuclear stain. Osteoclasts are observed as multinucleated, TRAP+ polykaryons. Their identification can be further supported by Cathepsin K staining. Bone and mineral resorption assays allow for functional characterization, confirming the identity of bona fide osteoclasts. This protocol demonstrates a robust and versatile method to differentiate human osteoclasts from iPSCs and allows for easy adoption in applications requiring large quantities of functional human osteoclasts. Applications in the areas of bone research, cancer research, tissue engineering, and endoprosthesis research could be envisioned.

This protocol presents the differentiation of human osteoclasts from induced pluripotent stem cells (iPSCs) and describes methods for the characterization of osteoclasts and osteoclast precursors.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>İntramembranöz Kemik Onarım Çalışmaları için Geliştirilmiş Kemik İliği Yaralanması Modeli

Improved Methodology for Studying Postnatal Osteogenesis via Intramembranous Ossification in a Murine Bone Marrow Injury Model

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage template, the process of intramembranous ossification involves the direct conversion of skeletal stem and progenitor cells (SSPCs) into bone-forming osteoblasts. There are limited surgical methods to model this process in experimental mice. Here, we have improved upon a bone marrow injury model in mice to facilitate the study of bone repair via intramembranous ossification and to assess postnatal regulators of osteogenesis. This method is highly reproducible and user-friendly, and it allows temporal assessment of new bone formation in a short period (3-7 days post-injury) using micro-computed tomography (&#181;CT) and frozen section histology. Furthermore, the contributions of SSPCs and mature osteoblasts can be readily assessed using a combination of fluorescent reporter mice and this intramembranous bone marrow injury model. In clinical contexts, intramembranous bone formation is relevant for healing critical size defects, stabilized fractures, cortical defects, trauma from tumor resections, and joint replacements.

<meta charset="utf8"></head><body>Bir Murin Kemik İliği Yaralanması Modelinde İntramembranöz Ossifikasyon Yoluyla Postnatal Osteogenezi İncelemek için Geliştirilmiş Metodoloji

The murine bone marrow injury model is a useful tool for studying postnatal osteogenesis through intramembranous ossification. This simplified surgical protocol describes the bone marrow ablation procedure for downstream assessment of new bone formation and cellular responses following injury.

Bir Murin Kemik İliği Yaralanması Modelinde İntramembranöz Ossifikasyon Yoluyla Postnatal Osteogenezi İncelemek için Geliştirilmiş Metodoloji

Long bone injuries heal through either endochondral or intramembranous bone formation pathways. Unlike the endochondral pathway that requires a cartilage ...