Bu çalışma Teksas Kemik Hastalıkları Programı Ödülü, Caroline Wiess Hukuk Fonu Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIAMS tarafından R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 to D.P.  BCM Optik Görüntüleme ve Vital Mikroskopi Çekirdeği'ndeki M.E. Dickinson ve T.J. Vadakkan'a ve NIH (AI036211, CA125123 ve DK056338) fonlarıyla BCM İleri Teknoloji Çekirdeklerine teşekkür ederiz.
.

Tüm fareler patojen içermeyen koşullarda muhafaza edildi ve tüm prosedürler Baylor College of Medicine'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Fare hazırlığı
<ol><li>Cross Mx1-Cre17 ve Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 fare (Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı) αSMA-GFP fareleri ile (burada Drs tarafından sağlanmıştır). Ivo Kalajzic ve Henry Kronenberg) Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretmek için (Şekil 2A).</li>
	<li>Mx1-Cre indüksiyonu için, farelere 10 gün boyunca her gün 25 mg / kg pIpC enjekte edin.</li>
	<li>Vahşi tip C57BL/6 farelerden (WT-BMT)19'dan 1 x 106 bütün kemik iliği mononükleer hücrelerinin intravenöz naklinden 1 gün önce 9,5 Gy ile fareleri ışınlayın.</li>
	<li>6 ila 8 haftalık iyileşmeden sonra, fareleri aşağıda açıklanan periosteal hücre göç protokolünün in vivo görüntülemesine tabi edin. NOT: Mx1-Cre farelerinin ışınlanması ve WT-BMT, bir yaralanmaya yanıt verebilen endojen Mx1 etiketli hematopoetik hücreleri ortadan kaldırmak için gereklidir. Işınlama sonrası altı ila sekiz hafta, konağın hematopoetik hücre sayısı% <5'tedir ve böylece görüntülemeye hazırdır19.</li>
</ol>2. Fare tutma ve görüntüleme montajı
<ol><li>50 mL konik tüp ile bir fare kısıtlaması oluşturun (Şekil 1A).<ol>
<li>Sivri makas kullanarak konikin dibinden bir delik açın. Alt delikten konilerin üstüne kesin (kesilen taraf kısıtlamanın üst kısmı olacaktır).</li>
		<li>Önceki kesime paralel olarak yaklaşık 4-5 cm uzunluğunda ve kısıtlamanın üstünden yarıya kadar (~2 cm) bir kesim yapın. Konik bu bölümü çıkarın ve kenarları pürüzsüzleştirin gerekliydi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ayarlanabilir bir açı plakası, 0,5" optik direk ve 0,5" post, 0,1875" Hex (Şekil 1B ve Malzeme Masası) için dik açılı bir kelepçe kullanarak konik bir tüp görüntüleme montajı oluşturun.<ol>
<li>Açı plakasını 35° açıya ayarlayın. Açı plakasının sol tarafında, optik direği plakanın arkasından ikinci deliğe vidalayın.</li>
		<li>Ayarlanabilir plakanın sağ tarafına, yaylı 0,1875" Hex kilitlemeli 0,25" başparmak vidasını önden ikinci deliğe ve plakadaki son deliklere yerleştirin. Dik açılı kelepçe, konik fare kısıtlamasını yerinde sabitlemek için optik direkle birlikte kullanılacaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ameliyat öncesi cerrahi prosedür
<ol><li>Fare anestezisi<ol>
<li>Ağrı yönetimi için, deri altından fareye ameliyattan 30-60 dakika önce sürekli salınımlı buprenorfin (1 mg / kg BW) enjekte edin.</li>
		<li>37.5 mg/mL ketamin, 1.9 mg/mL ksil ile 0.37 mg/mL asepromazin içeren kemirgen III CCM kombinasyonu (combo III) anestezi kullanarak fareleri uyuşturmak. Fareler için uygun dozaj, 1 kg vücut ağırlığı başına 0,75-1,50 mL'dir. Doz 30-45 dakika sürecektir.</li>
		<li>Fare uyuşturuldıktan sonra, göz dehidrasyonunu önlemek için steril bir pamuklu çubukla gözlere oftalmik merhem uygulayın.</li>
		<li>Uzun süreli görüntüleme için (>45 dk), uygun anestezi derinliğini korumak için anesteziyi tekrar uygulayarak aşağıdaki gibi uygulayabilirsiniz.<ol>
<li>Planlanan görüntüleme süresi boyunca anesteziyi korumak için yeterli miktarda kombo III ile 1 mL şırıngın hazırlayın (30 dakikalık ek sedasyon başına 0,75 mL/kg BW). Şırıngaya 12" tüplü 25 G kelebek iğne infüzyon seti takın ve anesteziyi boru ve iğneden geçirin.</li>
			<li>Kelebek iğnesini intraperitoneally yerleştirin, sonra iğneyi yerine bantleyin. NOT: Ek kombo III görüntüleme sırasında bu şekilde uygulanacaktır, böylece hayvanı hareket ettirmeye veya görüş düzlemini bozmaya gerek yoktur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İşlem boyunca 37°C'de tutulan bir ısıtma yastığı ile termal destek sağlayın. Uzun süreli görüntüleme için (>1 saat) ek sıvı desteği gerekecektir.  Ek sıvılar I.P.'ye görüntüleme sırasında ek Combo III veya deri altından 33 mL/kg salin (0.9 NaCl) sağlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare kısıtlaması ve cerrahi bölgenin hazırlanması<ol>
<li>Başın üstünden mümkün olduğunca fazla saç çıkarmak için makas kullanın. Ameliyat bölgesinde kalan saçları çıkarmak için tıraş edilen bölgeye epilatör krem uygulayın.</li>
		<li>Farenin parmak sıkışmalarına yanıt vermeyerek tamamen uyuşturulmasını sağlayın. 15 dakika sonra, fare tam olarak uyuşturulmazsa, ikinci bir daha küçük kombo III dozu (<0.75 mL / kg BW) kullanın.</li>
		<li>Fareyi önce kısıtlama kuyruğuna yerleştirin, burnun konik kenarına hafifçe sarkacak şekilde yeterince geriye doğru kaydırarak yerleştirin.</li>
		<li>Tıbbi bant kullanarak ön pençeleri konik tüpün altına bantleyin.</li>
		<li>Konik tüpü fare ile 35° açıyla ayarlanmış ve dik açılı kelepçe kullanılarak sabit bir görüntüleme yuvasına yerleştirin (Şekil 1C).</li>
		<li>Fare görüntüleme yuvasında güvenli hale geldikten sonra, cerrahi bölgeyi betadin ovma ve% 70 izopropil alkolün alternatif önlükleriyle 3x temizleyin. Yine, hayvanın tamamen sakinleştirilerek uyuşturuldığını kontrol edin.</li>
		<li>Fareyi temiz bir emici ped için hareket ettirin ve büyük bir steril alan oluşturmak için farenin üzerine bir örtü yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cerrahi prosedür
<ol><li>Açma kesiği<ol>
<li>İnce uçlu tokmaklar kullanarak, cildi hemen sağ kulağa medial alın. Mikrodiseksiyon makası ile, kümesler tarafından tutulan cildi kesin. NOT: Yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak kesiğin başlatılması, işlemden sonra dikiş için daha uygun yuvarlak bir kesi oluşturur.</li>
		<li>sol kulağa doğru ilk kesiden başlayarak enine bir kesi yapın (<1 cm).  İlk kesiden başlayarak hayvanın burnuna doğru başka bir kesi yapın (sağ gözün yanından ~ 2-3 mm).</li>
		<li>Cildi periosteumdan ayıran bağ dokusunu nazikçe kesmek için önseçimleri ve makası kullanarak cildi periosteumdan ayırın.</li>
		<li>Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, cilt kapağının üstüne biraz oftalmik merhem uygulayın.  Deri kapağını yavaşça alın ve sol gözün üzerine katlayın. Sagittal ve koronal dikişlerin kesişimi açıkça ortaya açılmalıdır (Şekil 1E). NOT: Oftalmik merhem cilt kapağını yerinde tutmak için kullanılır.</li>
		<li>Herhangi bir kan ve artık saç alanını temizlemek için açık yüzeyi steril PBS ile yıkayın. NOT: Gerekirse, kızardıktan sonra kalan tüyleri çıkarmak için ince uçlu tokalar kullanın, ancak periosteuma zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikro çatlak<ol>
<li>Calvaria üzerinde mikro çatlaklar oluşturmak için, 29 G insülin şırıngasının pistonunun pistonunun çıkarılmasının ve şırınganın arka ucunun 300-400 uL işareti civarında kesilmesi. NOT: Bu adım, yaralanmayı üretirken diseksiyon kapsamı altında manevra yapmayı kolaylaştırır.</li>
		<li>Bir eğimin ucunu (bir ila iki iğne genişliği) koronal dikişten buruna doğru ve sagittal sütür sağ kısmına bir ila iki iğne genişliği yerleştirin (Şekil 1E).</li>
		<li>Şırıngarı saat yönünde hafifçe döndürün, sonra saat yönünün tersine birkaç kez döndürün. NOT: Genç farelerde, dairesel bir mikro çatlak oluşturmak için çok az miktarda aşağı doğru basınca ihtiyaç vardır. Kanamaya neden olacağı ve görüntülemeye müdahale edeceği için iğnenin beyne nüfuz etmesine izin vermemeye dikkat edin.</li>
		<li>Mikro çatlak ~0,4 mm'ye genişletmek için 27 G'lık bir iğne kullanın. Kemik parçaları mikro çatlakta kalırsa, bölgeyi PBS ile yıkayın. Kemik parçaları hala mikro çatlakta kalırsa, 29 G iğnesini kullanarak hafifçe dışarı çıkarabilirsiniz.</li>
		<li>Sagittal dikişin sol tarafında bir yaralanma oluşturmak için 4.2.1–4.2.4 adımlarını tekrarlayın. NOT: Bu noktada iki seçenek vardır: 1) derhal CCL5 tedavisine (bölüm 4.3) ve görüntülemeye (bölüm 5) geçin; veya 2) bölüm 6'daki ameliyat sonrası işlemleri takiben cerrahi bölgeyi kapatın. 24 saat sonra fareyi tekrar uyuşturun, cerrahi görüşü yeniden açın, yaralanmayı CCL5 (bölüm 4.3) ile tedavi edin ve intravital görüntüleme (bölüm 5) ve ameliyat sonrası bakım (bölüm 6) gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CCL5 tedavisi<ol>
<li>RANTES (100 ng/mL) stoğundan, bodrum membran matrisi (Malzeme Masası) kullanarak 10 ng/mL'lik bir çözüm yapın. Matrisi sıvı halde tutmak için bu çözeltiyi buzda tutun.</li>
		<li>Her yaralanmayı 2-20 μL pipet kullanarak 2 μL CCL5 (10 ng/μL) ile tedavi edin (bu pipet ucu viskoz bir sıvı kullanırken daha etkili olan daha büyük bir çapa sahiptir). Matrisin katılaşmasına izin verin.</li>
		<li>Matris katılaştıktan sonra, dokunun susuz kalmamasını sağlamak için calvaria'yı deri kapağı ile hafifçe örtün. Görüntülemeden önce 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. İntravital görüntüleme
<ol><li>Mikroskop ayarları<ol>
<li>Çoktoğraf lazeri açın (femtosaniye titanyum-safir lazer). Dalga boyunun 880 nm olarak ayarlanması ve kemiğin ikinci harmonik nesil (SHG) görüntüleme (440 nm) için gücü ayarlayın.</li>
		<li>GFP ve tdTomato ifade hücrelerinin çıkarılması için sırasıyla 488 nm ve 561 nm katı hal lazerlerini açın.</li>
		<li>İkinci harmonik üretim (405–455 nm algılama) ve GFP (505–550 nm algılama) sinyalleri için PMT (fotomultiplier tüp) dedektörlerini açın. Domates (590–620 nm algılama) sinyali için HyD 3 dedektörünü açın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montaj<ol>
<li>Fareyi dürbüne taşımadan önce, farenin başının arkasına hafifçe basarak calvaria'nın görsel düzlemini kontrol edin. Düzlem düzlem değilse, fare kısıtlamasını yavaşça sola veya sağa döndürerek konumu ayarlayın. NOT: Bu, yeterli görüntü kalitesini sağlamak için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Tüm kalvaria ve cilt kapağını örtmek ve dokunun kurumasını önlemek için suya (w/v) steril% 2 metilselüloz uygulayın.</li>
		<li>Fareyi XYZ eksenli motorlu mikroskop aşamasına yerleştirin (Şekil 1G). Epifluoresan ışığı kullanarak, fareyi 1) mikroskop ve 2) koronal ve sagittal dikişlerin kesişimi sahnenin ortalanmış referans noktası olacak şekilde hizalayın.</li>
		<li>Cam kapağı görüntüleme alanına yerleştirin ve hizalamayı iki kez kontrol edin (Şekil 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntüleme<ol>
<li>Calvaria'yı taramak için düşük büyütme lensi (NA = 0,95 ile 25x su daldırma hedefi) kullanın. Sagittal ve koronal dikiş kesişiminin referans görüntüsünü alın.</li>
		<li>Hücrelerden gelen SHG ve floresan sinyallerini kullanarak, her yaralanma görüşünü bulun ve XYZ koordinatlarının yanı sıra sagittal ve koronal dikişlerden uzaklıkları kaydedin (Şekil 2B).</li>
		<li>Uzun süreli görüntüleme için koronal veya sagittal dikişlerde bir konum seçin. Görüntüleme sırasında referanstan bu alanın ayrıntılı bir Z yığını görüntüsünü alın. NOT: Dikişler bilinen bir P-SSC nişini temsil ettiği için, hücrelerin calvaria yaralanmasına yanıt olarak göç edeceği yer burasıdır.</li>
		<li>En az 1 saat boyunca her 1 dakikada bir görüntü kaydetmek için zaman atlamalı yazılım ayarlarını kullanın. Anlık görüntüler arasındaki süre içinde, geçerli görünüm alanını ilk görüş alanıyla karşılaştırın. Farklılarsa, görüş alanının hangi yönde ayarlanması gerektiğini belirlemek için Z yığını görüntüsünü kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Ameliyat sonrası hayvan bakımı
<ol><li>Görüntülemeden sonra, metilselülozu çıkarmak için maruz kalan calvaria'yı steril PBS ile durulayın.</li>
	<li>Kesiği kapatmak için, cilt kapağını calvaria üzerine hafifçe yerleştirin. Artık oftalmik merhemleri çıkarmak ve kesi bölgesini kurutmak için steril pamuklu çubuklar kullanın.</li>
	<li>Bağlı bir C-1 ters kesme iğnesi ile monofilament naylon 5-0 boyutlu nonabsorbable dikişler kullanarak cerrahi bölgeyi kapatın. Kapalı kesiye üçlü antibiyotik merhem uygulamak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. NOT: Yüksek kaliteli dikiş teknikleri ve minimum kanama ile yara izi azalır.</li>
	<li>Fareyi sıcak bir yüzeyde temiz bir kafese yerleştirin ve sternal reumbency elde edilene kadar her 15 dakikada bir kontrol edin.</li>
	<li>Ameliyat sonrası 72 saat sürekli salınımlı buprenorfin ikinci bir doz uygulamak.</li>
	<li>Dikişler çıkarılana kadar (~1 hafta) huddling davranışı, fırfırlı kürk ve/veya ambülasyon eksikliği için günlük olarak izleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture.">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li><li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration.">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li><li>Roberts, S. J., van Gastel, N., Carmeliet, G., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+the+periosteum+for+skeletal+regeneration:+the+stem+cell+that+lies+beneath.">Uncovering the periosteum for skeletal regeneration: the stem cell that lies beneath.</a> Bone. 70, 10-18 (2015).</li><li>Duchamp de Lageneste, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteum+contains+skeletal+stem+cells+with+high+bone+regenerative+potential+controlled+by+Periostin.">Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin.</a> Nature Communications. 9 (1), 773 (2018).</li><li>Olivos-Meza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+of+periosteum+with+TGF-beta1+in+situ+enhances+the+quality+of+osteochondral+tissue+regenerated+from+transplanted+periosteal+grafts+in+adult+rabbits.">Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18 (9), 1183-1191 (2010).</li><li>Debnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+periosteal+stem+cell+mediating+intramembranous+bone+formation.">Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation.</a> Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).</li><li>Ransom, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axin2-expressing+cells+execute+regeneration+after+skeletal+injury.">Axin2-expressing cells execute regeneration after skeletal injury.</a> Scientific Reports. 6, 36524 (2016).</li><li>Ouyang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prx1+and+3.2kb+Col1a1+promoters+target+distinct+bone+cell+populations+in+transgenic+mice.">Prx1 and 3.2kb Col1a1 promoters target distinct bone cell populations in transgenic mice.</a> Bone. 58, 136-145 (2013).</li><li>Wilk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+Calvarial+Skeletal+Stem+Cells+Expressing+PRX1+Reside+Exclusively+in+the+Calvarial+Sutures+and+Are+Required+for+Bone+Regeneration.">Postnatal Calvarial Skeletal Stem Cells Expressing PRX1 Reside Exclusively in the Calvarial Sutures and Are Required for Bone Regeneration.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 933-946 (2017).</li><li>Ortinau, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Functionally+Distinct+Mx1+alphaSMA++Periosteal+Skeletal+Stem+Cells.">Identification of Functionally Distinct Mx1+alphaSMA+ Periosteal Skeletal Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 784-796 (2019).</li><li>Deveza, L., Ortinau, L., Lei, K., Park, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+gene+expression+identifies+distinct+molecular+signatures+of+bone+marrow-+and+periosteal-skeletal+stem/progenitor+cells.">Comparative analysis of gene expression identifies distinct molecular signatures of bone marrow- and periosteal-skeletal stem/progenitor cells.</a> PLoS One. 13 (1), 0190909 (2018).</li><li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+during+fracture+repair:+The+cellular+picture.">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 19 (5), 459-466 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+identifies+osteogenic+progenitors+for+bone+formation+and+fracture+repair.">Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 782-796 (2017).</li><li>Zhou, B. O., Yue, R., Murphy, M. M., Peyer, J. G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin-receptor-expressing+mesenchymal+stromal+cells+represent+the+main+source+of+bone+formed+by+adult+bone+marrow.">Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 154-168 (2014).</li><li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells.">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li><li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+mice.">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).</li><li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+marrow+MSCs+are+dynamic,+fate-restricted+participants+in+bone+maintenance+and+regeneration.">Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 259-272 (2012).</li><li>Nitzsche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+MSC+Adhesion+Cascade-Insights+into+Homing+and+Transendothelial+Migration.">Concise Review: MSC Adhesion Cascade-Insights into Homing and Transendothelial Migration.</a> Stem Cells. 35 (6), 1446-1460 (2017).</li><li>Adler, J., Pagakis, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+image+distortions+due+to+temperature-related+microscope+stage+drift.">Reducing image distortions due to temperature-related microscope stage drift.</a> Journal of Microscopy. 210, 131-137 (2003).</li><li>Roberts, S. J., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anabolic+Strategies+to+Augment+Bone+Fracture+Healing.">Anabolic Strategies to Augment Bone Fracture Healing.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (3), 289-298 (2018).</li></ol>

L.C.O. ve D.P., "Kemik Onarımında Periosteal İskelet Kök Hücreleri" (BAYM) başlıklı bekleyen bir patenti açıkladılar. P0264US. P1). Geri kalan yazarlar rakip çıkar beyan etmemektedir.

Kemik iyileşmesi sırasında periosteal hücreler, bir yaralanma callusu içinde yeni farklılaşmış kondrositlerin ve osteoblastların ana kaynağıdır3. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6'da osteojenik/kondrojenik SSC'ler de tanımlanmıştır. Endojen P-SSC fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek teknik olarak zordur. Genellikle, SSC'lerin göçmen dinamikleri in vitro olarak değerlendirilir ve karşılık gelen in vivo sistemlerinin yorumlanmasını zorlaştırır. Canlı hayvan intravital mikroskopislerindeki son gelişmeler ve ek muhabir farelerin (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) üretimi nedeniyle, bireysel hücrelerin in vivo takibi artık mümkündür. Böylece, bu yöntem CCL5 kaynaklı P-SSC'lerin gerçek zamanlı olarak in vivo kaydedilini sağlar.
Bu yöntemle ilişkili görüntüleme tutarlılığını etkileyebilecek birkaç teknik zorluk vardır. Bu yöntemle ilgili önemli bir teknik zorluk, Z ekseni görüş düzlemini korumaktır. Z ekseni kayması (Z-drift), sabit ve canlı örneklerin uzun süreli görüntülenmesinde yaygın bir konudur ve büyük ölçüde görüntüleme ortamındaki sıcaklık değişikliklerine atfedilir.  Bu yapı tamamen karşı koyamasa da, sahneyi, objektif lensleri ve destekleyici yapıları kaplamak Z-drift21'i azaltmaya yardımcı olur.
Ayrıca, zaman atlamalı görüntülemeden önce görüntüleme konumunun Z yığını serisini elde etmek, görüntü alımları arasında başvurulabilecek Z ekseninin bir referansını oluşturacaktır (yani, görüntüler genellikle her 30-60 s'de bir alınır, bu da gerekirse Z ekseninde ayarlamalar için zaman sağlar). Bir diğer teknik zorluk da calvaria dikişlerinden aynı boyut, şekil ve mesafede tutarlı bir mikro çatlak yapmaktır. Koronal ve sagittal dikişlerden uzaklık kritiktir, çünkü calvaria dikişleri sessiz SSC'ler için bir niştir10. Mikro çatlak değişkenliğini azaltmak için en iyi yöntem, bu tekniği son analize dahil olmayan farelerde uygulamaktır.
Sınırlamalara rağmen, bu yöntem bir kemik hasarına in vivo bireysel hücresel yanıtı değerlendirmek için benzersiz bir sistem sağlar. Kırık onarımı birden fazla hücre tipini içeren son derece karmaşık bir süreç olduğundan, tam olarak anlaşılamayan birkaç yön vardır. Bunlardan biri, P-SSC'lerin bir yaralanmaya karşı erken göçmen tepkisini içerir. CCR5/CCL5, P-SSC'lerin bir yaralanmaya alındığı benzersiz bir mekanizma olsa da, ek sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin kırık iyileşmesinde önemli bir rol oynaması mümkündür. Daha önce, çeşitli sitokinler ve büyüme faktörleri ile kırıkların tedavisi, genel kırık iyileşmesinde oldukça değişken sonuçlarla sonuçlanmıştır22. Bu görüntüleme yöntemi, potansiyel ilaç/sitokin/büyüme faktörü tedavilerinin bireysel hücresel yanıtlar üzerindeki fizyolojik etkilerini belirlemek için benzersiz bir platform sağlar. Son olarak, belirli bir tedavinin kırık iyileşmesini artırıcısını destekleyebilecek in vivo mekanistik veriler sağlar.

Kırık onarımı embriyonik iskelet gelişimi ve tadilattan farklı dinamik, çok hücreli bir süreçtir. Bu süreçte, hasarlı dokudan gelen yaralanma sinyallerinin indüksiyonunu, kırıkların genel stabilitesi ve sabitlenmesi için kritik öneme sahip olan iskelet sapı/progenitör hücrelerinin hızlı bir şekilde işe alınması, çoğalması ve daha sonra farklılaşması takip eder1. Özellikle, kırık iyileşmesinin erken aşamaları, esas olarak periosteal yerleşik hücrelere atfedilen yumuşak nasır oluşumunu gerektirir2. Kemikler yaralandığında, periosteal hücrelerin bir alt kümesi hızla yanıt verir ve callus3 içindeki yeni farklılaşan kıkırdak aralarına ve osteoblastlara katkıda bulunur ve periosteum içinde belirgin bir iskelet sapı / progenitör hücre popülasyonunun varlığını bu işe bular. Bu nedenle periosteumda yerleşik iskelet kök hücrelerinin (SSC) tanımlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu dejeneratif kemik hastalıkları ve kemik defektleri için umut verici bir terapötik yaklaşım oluşturmaktadır4.
SSC'lerin kemik iliği de dahil olmak üzere birden fazla doku bölgesinde bulunduğu düşünülmektedir. Kemik iliğine benzer şekilde periosteum4,5,6'da osteojenik/kondrojenik SSC'ler de tanımlanmıştır.  Bu periosteal SSC'ler (P-SSC'ler) fetal kemik gelişimi sırasında erken mezenkimal soy belirteçleri (örneğin Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 ve Axin2-CreER8) ile etiketlenebilir4,7,8,9,10. Bu tek genetik soy izleme modellerinin önemli bir sınırlaması, etiketli hücre popülasyonlarında önemli bir heterojenlik olmasıdır. Ayrıca, etiketli SSC'leri progeny in vivo'larından ayırt edemezler. Bu sınırlamayı gidermek için, yakın zamanda kemik iliği SSC'lerinden (BM-SSC'ler)11'den P-SSC'leri belirgin bir şekilde görselleştirmek için çift muhabir fare (Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) geliştirdik. Bu model ile P-SSC'lerin Mx1+αSMA+ çift etiketleme ile işaretlendiği, daha farklılaştırılmış Mx1+ hücrelerinin ise kemik iliği, endosteal ve periosteal yüzeyler ile kortikal ve trabeküler kemiklerde bulunduğu tespit edilmiştir11,12.
Çoklu sitokinler ve büyüme faktörlerinin kemik tadilatını ve onarımını düzenlediği bilinmektedir ve kritik segment kusurlarında iskelet onarımının arttırıcısı için test edilmiştir1,13. Bununla birlikte, kemik bölmesinin fiziksel bariyerinin bozulmasıyla ortaya çıkan yaralanma modellerinin hücresel karmaşıklığı nedeniyle, bu moleküllerin endojen P-SSC göçü ve iyileşme sırasında aktivasyon üzerindeki doğrudan etkileri belirsizdir. SSC'lerin fonksiyonel özellikleri ve göçmen dinamikleri genellikle diğer hücre popülasyonlarında göçü teşvik ettiği bilinen sitokinler veya büyüme faktörleri ile birlikte bir transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak değerlendirilir. Bu nedenle, bu in vitro deneylerden elde edilen sonuçların ilgili in vivo sistemlerinde uygulanması için yorumlanması zordur. Şu anda, iskelet sapı / progenitör hücre göçünün in vivo değerlendirmesi tipik olarak gerçek zamanlı olarak gözlenmez; aksine, kırık sonrası sabit zaman noktalarında ölçülür5,7,14,15,16.
Bu yöntemin bir sınırlaması, geçişin tek hücre düzeyinde değerlendirilmemesidir; bunun yerine, hücre popülasyonlarındaki değişikliklerle ölçülür. Canlı hayvan intravital mikroskopislerindeki son gelişmeler ve ek muhabir farelerin üretimi nedeniyle, bireysel hücrelerin in vivo takibi artık mümkündür. Canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanarak, Mx1/Tomato/αSMA-GFP farelerinde 24-48 saat yaralanma sonrası kemik hasarında P-SSC'lerin kalvaria dikiş nişinden kemik yaralanmasına belirgin göçünü gözlemledik.
CCL5/CCR5 yakın zamanda erken yaralanma yanıtı sırasında işe alım ve aktivasyon P-SSC'lerini etkileyen düzenleyici bir mekanizma olarak tanımlandı. İlginçtir ki, gerçek zamanlı olarak bir yaralanmaya yanıt olarak önemli bir P-SSC göçü tespit edilmemiştir. Bununla birlikte, CCL5 ile bir yaralanmanın tedavisi, gerçek zamanlı olarak yakalanabilen sağlam, yönlü olarak farklı bir P-SSC göçü üretir. Bu nedenle, bu protokolün amacı, CCL5 ile tedaviden sonra P-SSC'lerin in vivo geçişini gerçek zamanlı olarak kaydetmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; optical post</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G needle</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>29G insulin syringe</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicol tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>For mouse restraint</td></tr><tr><td>Adjustable angle plate</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadine surgical scrub</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/mL Sustained Release</td></tr><tr><td>Combo III</td><td>Obtained from staff veterinarian</td><td>N/A</td><td>37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 premium superslip</td></tr><tr><td>Fine tip forcepts</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>Medical tape</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3&quot; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td></tr><tr><td>Methocellulose</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>Anaheim automation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Nonabsorbable sutures</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td></tr><tr><td>Opthalmic ointment</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &amp;micro;g/50 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Right-angle clamp for &amp;frac12;&amp;rdquo; post, 3/16&amp;rdquo; Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Spring-loaded 3/16&amp;rdquo; Hex-locking &amp;frac14;&amp;rdquo; thumbscrew</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Sterile cotton swabs</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Sterile DPBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment</td><td>Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer blood collection set</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G butterfly needle infusion set with 12&quot; tubing</td></tr></tbody></table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

Periosteal iskelet kök hücreleri (P-SSC' ler) ömür boyu kemik bakımı ve onarımı için gereklidir, bu da onları kırık iyileşmesini artırmak için tedavilerin geliştirilmesi için ideal bir odak noktası haline getirir.  Periosteal hücreler, kırık iyileşmesi için yeni kondrositler ve osteoblastlar sağlamak için hızla bir yaralanmaya göç eder. Geleneksel olarak, bir sitokinin hücre göçünü teşvik etme etkinliği sadece transwell veya scratch tahlil yapılarak in vitro olarak gerçeklenmiştir. Multifotoni ekscitasyonu kullanılarak intravital mikroskopideki gelişmelerle, yakın zamanda 1) P-SSC'lerin göçmen geni CCR5 ve 2) CCL5 olarak bilinen CCR5 ligand ile tedavinin kırık iyileşmesini ve CCL5'e yanıt olarak P-SSC'lerin göçini iyileştirdiği keşfedilmiştir. Bu sonuçlar gerçek zamanlı olarak yakalandı. Burada açıklanan, CCL5 ile tedavi edildikten sonra kalvarial dikiş iskelet kök hücresi (SSC) nişinden yaralanmaya doğru P-SSC geçişini görselleştirmek için bir protokoldür. Protokol, bir fare kısıtlaması ve görüntüleme montajının yapımını, fare kalvarisinin cerrahi olarak hazırlanmasını, bir calvaria kusurunun indüksiyonunu ve zaman atlamalı görüntülemenin kazanılmasını detaylandırıyor.

İskelet atalarının göçmen veya dolaşım potansiyeline sahip olduğu önerilmiştir20. Son zamanlarda, Mx1-Cre +Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) muhabir fareleri üretildi ve P-SSC'ler Mx1+α SMA+ çift etiketleme ile işaretlendi (Şekil 2A,B). Mx1+α SMA+ P-SSC'lerin önemli göçü 24-48 saat yaralanma sonrası 24-48 saat içinde dikiş mezenkiminin dışında meydana geldi11.  Ayrıca bir calvaria kusuru sonra gerçek zamanlı 24 saat içinde in vivo P-SSC göç tespit olasılığı oldu. Görüntülemenin 1 saat içinde Mx1+αSMA+ P-SSC'lerin çok az veya hiç geçişi gözlendi (Şekil 2C).
Mx1+α SMA+ P-SSC'ler CCR511 olarak bilinen CCL5 reseptörü benzersiz bir şekilde ifade eder. Bu nedenle, bir calvaria defektinin tedavisi 24 saat sonra CCL5 indüklenen yönlü belirgin göç ile koronal dikişten uzaklaşıp yaralanma görüşüne doğru (Şekil 2D, E). Görüntülemeden 1 saat sonra, Mx1+αSMA+ P-SSC'lerden biri yaralanmaya doğru yaklaşık 50 μm göç etti (Şekil 2E). Diğer Mx1+αSMA+ P-SSC'lerin de CCL5 tedavisine yanıt olarak ancak daha az ölçüde göç ettiği gözlendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61162/61162fig1.jpg"> Şekil 1: Fare calvaria in vivo görüntüleme için kurulum. Canlı görüntüleme sırasında kullanılan fare kısıtlaması (A) ve görüntüleme yuvasının (B) temsili görüntüleri. (C) Fareyi emniyete alın ve görüntüleme yuvasına sabitlenin. (D) Fare calvaria yapısının şematik gösterimi, frontal (FS), koronal (CS), sagittal (SS) ve lambdoid (LS) dikişlerini tanımlar. (E) Calvaria mikro çatlak yaralanmalarının temsili yerleşimi. (F) Optimal iyileşme ve ileride görüntüleme için ameliyat sonrası cerrahi dikiş yerleşimi. Mikroskop aşamasında (G) ve coverlip yerleşiminde (H) montaj yerleşiminin temsili görüntüleri. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61162/61162fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61162/61162fig2.jpg"> Şekil 2: Mx1+αSMA+ P-SSC geçişinin gerçek zamanlı in vivo görüntülemesi. (A) Mx1/Tomato/αSMA-GFP çift muhabir farelerinin hazırlanması şeması.  Farelere 10 gün boyunca her gün 25 mg/kg pIpC ile intraperitoneally enjekte edildi (1). Mx1/Tomato/αSMA-GFP fareleri, WT C57BL/6 farelerden 1 x 106 bütün kemik iliği mononükleer hücrelerinin intravenöz naklinden 1 gün önce 9,5 Gy (2) ile ölümcül bir şekilde ışınlandı (3).  6-8 haftalık iyileşmeden sonra (konağın hematopoetik hücreleri% 5'ten az olduğunda), fareler kemik yaralanması deneylerine maruz kaldı. Mx1+ (Domates+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+ (Domates+GFP+) ve kemik (mavi). (B) Mx1/Tomato/αSMA-GFP faresinin sagittal (SS) ve koronal (CS) dikişleri ile ilgili olarak temsili bir calvaria yaralanması (beyaz daire) ve görüntüleme (beyaz kare) konumlarının maksimum Z-projeksiyonu.  Noktalı çizgiler calvaria dikişlerini temsil eder. (C) Mx1+α SMA+ P-SSC yanıtının in vivo görüntülemesi yaralanma sonrası 24 saat. Ölçek çubuğu = 25 μm. (D) Yaralanma sonrası 24 saat, yaralanma görmede CCL5 uygulandı ve in vivo görüntüleme 1 saat sonra koronal dikiş (CS) ile ilgili olarak yapıldı. Beyaz kare, (E) olarak gösterilen hücre geçiş görüntülerinin konumunu temsil eder. Ölçek çubuğu = 75 μm.  (E) Kemik (mavi) yüzeyindeki Mx1+α SMA+ P-SSC'lerin yaralanma görüşüne (sağ üst) doğru geçişi. Ölçek çubuğu = 25 μm. (C,D,E)'de, sayılar görüntüleme zamanını gösterir. Sarı ok yaralanma yerinin yönünü gösterir. Yıldız işareti, Mx1+α SMA+ P-SSC'nin göçmen yolunu gösterir. Görüntü, üç ila beş fareden elde edilen sonuçları temsil ediyor. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61162/61162fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice at JoVE.com

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.

Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K Görüntüleme.  Baylor College of Medicine. Bu protokol, canlı hayvan intravital mikroskopisi kullanılarak CCL5 aracılı periosteal iskelet kök hücre göçünün gerçek zamanlı olarak saptanmasıdır.

Video: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Gelişim Biyolojisi

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Nörobilim

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Tıp

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Biyoloji

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Farelerde Periosteal İskelet Kök Hücrelerinin CCL5 Kaynaklı Göçünün Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler