Bu eser NIGMS Grant P50GM107618 tarafından finanse edildi. Yazarlar Zohar B. Weinstein anlayışlı yorum ve el yazması öneriler için teşekkür ederiz.

Not: E. coli bakteri büyümesini engeller herhangi bir küçük molekül için köşegen yöntemi kullanılabilir. Beri bu ilaçların en göze çarpan bir üçlü sinerji göstermek bu protokol için Levofloksasin (LEV), nalidixic asit (NAL) ve penisilin G (PNG) bir örnek olarak kullanılır. İş akışını bu protokolü ve Şekil 6gösterilir. Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. Bakteri ve uyuşturucu taze aliquots her gün kullanın. Biyogüvenlik düzeyleri E. coliiçin uygun deneme gerçekleştirin.
1. hazırlık adımları
<ol><li>25 g LB suyu 1 litre saf su ekleyerek Luria-Bertani (LB) ortam hazırlamak ve karıştırın. Basınçlı kap 15dk ve mağaza oda sıcaklığında autoclaved medya için 121 ° C'de.</li>
	<li>E. coli gliserol stokları steril % 50 gliserol ve bakteri hücreleri OD600 seyreltilmiş eşit miktarda karıştırılarak hazırlamak = 1 LB suyu ve 150 µL aliquots 1.5 mL microcentrifuge tüpler-80 ° C'de dondurmak</li>
	<li>20 mg antibiyotik, LEV, NAL ve PNG dimetil sülfoksit (DMSO) her 1 ml geçiyoruz. LEV çözüm 100 x 0.2 µg/ml LEV çözüm 10 µL DMSO 990 µL ile karıştırılarak sulandırmak. 0.2 mg/mL LEV ve 20 mg/mL NAL ve PNG devam etmeden adımları kullanın.</li>
	<li>Her antibiyotik 1.5 mL microcentrifuge tüpler ve donma-20 ° C'de aliquot 50 µL</li>
	<li>E. coli almak bir 150 µL aliquot üzerinden-80 ° C. Tezcan.</li>
	<li>E. coli gliserol stokunun 100 µL 5 mL LB medya 14 mL kültür tüp içinde de ekleyin.</li>
	<li>Tüpler 37 ° C kuluçka gecede 200 devirde sallamak.</li>
</ol>2. seri seyreltme doz-yanıt deney
<ol><li>-20 ° c LEV, NAL ve PNG ilaçların bir aliquot al, onları çözme ve bu ilaçların seri dilutions için hazırlamak 10 dakika oda sıcaklığında bırak.</li>
	<li>1100 µL LB medya 990 µL karıştırma tarafından LB - %10 sol ve solvent (DMSO) 110 µL hazırlamak.</li>
	<li>LB - %10 LEV LB medya 450 µL karıştırma tarafından 500 µL ve LEV 50 µL hazırlamak.</li>
	<li>Girdap LB - %10 sol için 5 s en yüksek ayarda. LB - %10 sol 20 µL 96-şey Mikroplaka wells ilk dört satırı ekleyin.</li>
	<li>Girdap 5 LEV'i LB - %10 s en yüksek ayarda. İlk satır A. kuyuda LB - %10 LEV 20 µL eklemek</li>
	<li>İki kat seri seyreltme LB - %10 LEV için yukarı ve aşağı beş kez pipetting ikinci de ekleyerek ilk kuyudan 20 µL alarak hazırlamak. Bu iyi, 40 µL (Şekil 7A) ile biter 11 kadar tüm kuyular için sırayla yineleyin.</li>
	<li>Kaldırmak ve bir micropipette kullanarak, içerik 11 den 20 µL atın.</li>
	<li>2.3-2.7 NAL ve PNG Mikroplaka, ikinci ve üçüncü satır sırasıyla kullanarak uyuşturucu için yineleyin.</li>
	<li>Bir iç pozitif kontrol dördüncü satırda tekrar uyuşturucu LEV için 2,3-2.7 adımları yineleyin.</li>
	<li>Bir spektrofotometre kullanarak ölçmek bir 1:10 OD600 seyreltme Kültür (adım 1.5-1.7).</li>
	<li>5 mL LB medyaya için 0.01 OD600 de hücrelerde sulandırmak. Bir rezervuar dökün.</li>
	<li>Çok kanallı bir micropipette kullanarak, seyreltilmiş hücre 80 µL 2.4-2,9 adımda hazırlanan ilaç seri dilutions ekleyin. Her şey son uyuşturucu konsantrasyonlarda Şekil 7Aiçinde gösterilir. Buharlaşma önlemek için plaka mühür.</li>
	<li>16 h 37 ° C'de plaka kuluçkaya</li>
	<li>(Tekrar adımları 1.5-1.7) 3. adımda kullanmak için yeni bir bakteri kültürü başlatın.</li>
</ol>3. doğrusal seyreltme doz-yanıt deney
<ol><li>OD600 absorbans için seri seyreltme doz-yanıt plaka adım 2 plaka okuyucu (Şekil 7A değil) kullanarak ölçmek ve sonuçları için aşağıdaki adımları göre yorumlayabilir.</li>
	<li>Büyüme her şey büyüme her satır için hiçbir ilaç kontrolü büyüme ile bölerek normalize ve OD600uyuşturucu durumda normalleştirme tarafından yüzde büyüme hesaplamak.</li>
	<li>Her ilaç için turuncu Şekil 7A doğrugösterilen ~ %50 Büyüme inhibisyon (IC50), var wells bulun. Bu Wells konsantrasyon "seri IC50" her ilaç için olarak atayın.</li>
	<li>Taze uyuşturucu aliquots tezcan, LB medya ve çözücü (DMSO) 9:1 oranı ve LB-% 10 ilaç LB medya ve uyuşturucu LB medya eklemeden önce ilacın konsantrasyonu her ilacın seri IC50 100 x nerede 9:1 oranında, karıştırarak karışımı ile 1 mL LB - %10 sol hazırlamak , 3.3 adımda seçilen.</li>
	<li>11 konsantrasyonlarda LEV, NAL ve PNG ilaçların sürekli artan dozlarda LB-% 10 ilaç ve Şekil 7Biçinde gösterilen birimleri LB - %10 sol karıştırarak hazırlayın.</li>
	<li>LEV doğrusal olarak artan dozlarda dördüncü satırda bir iç pozitif kontrol hazırlayın.</li>
	<li>1:10 OD600 ölçmek seyreltme kültür adım 2,14 başladı.</li>
	<li>5 mL LB medyaya için 0.01 OD600 de hücrelerde sulandırmak. Bir rezervuar dökün.</li>
	<li>80 µL üstünde-e doğru çok kanallı bir micropipette kullanarak 3.6 adımda hazırlanan ilaç doğrusal dilutions seyreltilmiş hücrelerin ekleyin. Her şey son uyuşturucu konsantrasyonlarda Şekil 7Biçinde gösterilir. Not: Bu ilaç için seri IC50 doz-yanıt de ortada alırsınız. Buharlaşma önlemek için plaka mühür.</li>
	<li>16 h 37 ° C'de plaka kuluçkaya</li>
	<li>(Tekrar adımları 1.5-1.7) 4. adımda kullanmak için iki taze bakteri kültürleri başlatın.</li>
</ol>4. çapraz ilaç etkileşim deney
<ol><li>OD600 absorbans doğrusal seyreltme doz-yanıtından adım 3 (Şekil 7B) için ölçmek.</li>
	<li>Her ilaç için IC50 içinde sonuçlandı ve hazırlamak konsantrasyon ilaç LEV, NAL ve PNG 100 x IC50 konsantrasyonlarda seçin.</li>
	<li>Taze uyuşturucu çözülme, 100 hazırlamak x IC50 her biri için ilaç ve 1:1 ilaç karışımları LEV + NAL, LEV + PNG ve NAL + PNG ve 1 hacimce hazırlamak: 1:1 ilaç karışımı LEV + NAL + PNG hacmen.</li>
	<li>İki tabak Şekil 8' de gösterildiği gibi ilaç etkileşimi deneyler için hazır olun.</li>
	<li>1:10 OD600 ölçmek seyreltme kültürlerin adım 3.11 başladı.</li>
	<li>OD600 hazırlamak iki 10 mL LB medyanın iki kültürler 0,01 dilutions =.</li>
	<li>80 µL hücre kültürü 1 ve 2 plakaları 1 ve 2, sırasıyla ekleyin. Buharlaşma önlemek için plakalarının. Plakalar için 16 h 37 ° C'de kuluçkaya</li>
</ol>5. çapraz ilaç etkileşimi puanları
<ol><li>Ölçü OD600 absorbans çapraz ilaç etkileşimi için adım 4 tabak denemeler yapın.</li>
	<li>Büyüme her şey büyüme uyuşturucu kontrol her satır için de büyüme ile bölerek normalize.</li>
	<li>Her satır için sütun Büyüme inhibisyon gösterilen Şekil 8 turuncu doğru IC50 için en yakın olan bulun. Bu iyi uyuşturucu göreli yoğunlaşmasını dayalı IC50 atayın.</li>
	<li>LEV + NAL, LEV + PNG ve NAL + PNG ve LEV + NAL + PNG doz-yanıt için beklenen IC50 her birlikte tek ilaçların IC50 sayı ortalaması alınarak hesaplamak. Ortalama tam beklenen IC50 hesaplaması için basit bir yaklaşım12' den önce açıklandığı gibi olduğunu unutmayın.</li>
	<li>Kesirli inhibitör konsantrasyon (FIC) puanları her birlikte beklenen IC50 tarafından gözlenen IC50 bölerek hesaplamak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Uyuşturucu kombinasyonları patojenler veya tümörler karşı kurutma antibiyotik boru hattı koşullarda özellikle çekici bir umudu kullanmaktır. Ancak, bu potansiyel en az iki zorluklar engel oluyor. İlk zorluk olası kombinasyon astronomik sayısıdır. Örneğin, 100 antibiyotik arasında 4950 ikili kombinasyonları vardır. Tüm olası kombinasyonlar arasında 100 antibiyotik (2100) yeryüzünde bakteri sayısı aynı büyüklük sırasında üzerinde olan (~ 1030). Nasıl güçlü sinerjik kombinasyonları bu olanakları arasında tahmin çok sayıda hesaplama çalışma konusu olmuştur. İkinci zorluk yüksek sıralı ilaç etkileşimleri ölçümdür. Bir sayısal platform belirli bir 10-uyuşturucu arada bir bazı patojen karşı şiddetle sinerjik önerebilir miyim göz önünde bulundurun. İlaç etkileşimleri sınamak için geleneksel yöntemler doğrulayın veya bu hipotez çürütmek çok pahalı, bu nedenle birçok ilaç arasında sinerji çalışma bilimsel araştırma sınırları dışında olmuştur. Neredeyse 30 yıl önce ilk önerilmiş ve birkaç son sinerji ekranlarında kullanılan köşegen yöntemini sağlar güçlü bir temel için ilk sorun, birçok çift arasında etkileşimin test izin vererek. Bu geleneksel deneyleri bilgilendirici bir örnek yanında ikinci sorunu çözdü ve yüksek sıralı ilaç etkileşimleri çalışma sağlar.
Biz önemlisi bizim Protokolü ilaç etkileşimi ölçülerini doğrusal bir dozaj bile zayıf etkileşimler algılamak için duyarlılık sağlamak için kullandığına dikkat edin. Doğrusal dozaj için doğru konsantrasyon aralığı oluşturma bir iştir. İlk seri bir seyreltme gerçekleştirerek, biz bir doğrusal dozaj için arama alanı hakkında karar vermek. Ancak, protokol 2 kat kullanacak biçimde değiştirilmesi veya etkileşim test için daha yüksek seri dilutions uyuşturucu. Böyle bir değişiklik deneme süresini kısaltmak ve daha fazla etkileşim test izin; Ancak, yalnızca güçlü sinerjik veya antagonistik etkileşim algılamak için duyarlılık olurdu.
Biz açıklanan protokol ikili veya üçlü etkileşimleri ölçümü gösterir. Önemli bir özelliği iletişim kuralının tek ajanlar önyargı plaka varyasyonlar nedeniyle en aza indirmek için kombinasyon, aynı tabakta olmasıdır. Bu nedenle, protokol etkileşimler 7 yönlü kombinasyonları kadar ölçmek için önemsiz modifications tarafından ayarlanabilir. 7 uyuşturucu kombinasyonları birden fazla 96-şey Mikroplaka gerektirecektir ve dikkat edilecek diğer noktalar arası plate çoğaltır gibi doğru veri entegrasyonu sağlamak için alınması gerekir.
Bir önemli köşegen yöntemi her uyuşturucu tahlil faiz fenotip inhibe gerekir kısıtlama kısıtlamasıdır. Bu nedenle, köşegen yöntemi aktif maddeleri ve inert adjuvan arasındaki etkileşimler anlamak için yararlı değildir. Böyle 'güçlendirici' etkileşimleri Bliss veya en yüksek tek ajan modelleri gibi alternatif modeller altında okudu.
DSA'da ilaç etkileşimleri analiz için önemli bir göz "IC50 beklenen." boş modeli bir seçimdir İki ilaç birleştirildiğinde, kasanın'ın etkisi sadece tek ilaç etkileri için karşılaştırılabilir. Üç uyuşturucu birleştirildiğinde, kasanın'ın etkisi tek efektleri veya ikili etkileri için karşılaştırılabilir. Üç uyuşturucu tüm ikili birleşimlerini sinerjik iseniz, örneğin, o zaman bu bu ilaçların bir üçlü sinerji gösterecektir beklenebilir. İkili etkileşimleri beklendiği gibi gelen bir üçlü etkileşimin sapma son zamanlarda "acil etkileşimi"16,17dönüşmüş bulunuyor. Kolaylık olması için ölçüm "boş modeli tek ilaç etkileri tanımlayan etkileşimin Üçlü kombinasyon'ın net," bizim protokolünü açıklar. Ancak, protokolü elde edilen veri, Üçlü kombinasyonun acil etkileşimi hesaplamak için de kullanılabilir. Bizim analizi, beklenen IC50 üçlü kombinasyonu tek ilaç IC50s ortalama tanımlı. Alternatif olarak, beklenen IC50 IC50s ikili kombinasyon (~1.1-1.2) ortalama tanımlanabilir. Gözlenen IC50 bu alternatif beklenen IC50 tarafından bölünmüş, elde edilen FIC yukarıda açıklanan12olarak Üçlü kombinasyon için acil FIC sağlar. Bu dikkate LEV + NAL + PNG acil sinerji sahip gösteren LEV + NAL + PNG ne 3 ilaç arasında ikili etkileşimleri üzerinden beklenir daha fazla sinerjik olduğunu ortaya koymaktadır.

Uyuşturucu kombinasyonları bir fenotip sinerjik ya da antagonist ilaç etkileşimleri, sırasıyla1,2,3için karşılık gelen kurucu ilaçların etkileri göz önüne alındığında şaşırtıcı derecede yüksek veya düşük etkisi sergileyebilirler. Sinerjik kombinasyonları kullanımı doz-yükseltme etkinliğini artırmak için ve doz azaltma yan etkisi yardım için izin verebilir. Kombinasyon tedavileri de birden fazla aksiliklere hücresel makine, böylece olası evrimsel kaçış mekanizmaları direnci4engelleme için geçerli olabilir. Bu nedenle, üç veya daha fazla ilaç bileşimleri rutin patojen veya kanser tedavi5' te kullanılır.
Sinerji ve düşmanlık bir arada bireysel uyuşturucu etkileri göz önüne alındığında beklenen etkisi karşı gözlenen etkisi arasında bir karşılaştırma tarafından tanımlanır. İlaç etkileşimleri modellerinde arasında Loewe additivity en sıkı ve iyi tanımlanmış bir boş modeli ()Şekil 1)6ve inferred sinerji/husumet etkileşim kullanılan ilaç konsantrasyonu bağımsızdır 6 , 7. ancak, Loewe modeli deneysel olarak bile ikili etkileşim sınava maliyetlidir. İlaç etkileşimi deneyleri geleneksel ilaç konsantrasyonu kombinasyonları (dama tahtası tahlil) 2D bir matris oluşturan ()Şekil 2). 5 doz her ilaç için kullanılır, daha sonra 25 kombinasyonları gereklidir, birine karşılık gelen bir Mikroplaka çoğaltıldıktan deneyler yaptı Eğer yarısı. Bu yaklaşım maliyetini sinerji ölçüm Loewe additivity modeli çoklu ilaç kombinasyonunun ()Şekil 3)tarafından yasaklar. Örneğin, 10 yönlü etkileşim sınamak için geleneksel yöntemler gerektirir 100 binden fazla Mikroplaka, deneysel yüksek sıralı sinerji ölçümü sıkı, iyi theorized ve konsantrasyon bağımsız Loewe additivity modeli tarafından engelleme 8.
Mevcut klinik tedaviler uyuşturucu kombinasyonları yalnızca bir kısmını kullanır. Örneğin, standart aktif Tüberküloz tedavisinde üç antibiyotik kombinasyonudur. Orada yaklaşık 20 antibiyotik Mycobacterium tüberküloz (Mtb) tedavisinde kullanılan. 1140 3'lü kombinasyonları arasında 20 uyuşturucu, her biri Mtbkarşı güçlü bir sinerji var için potansiyel vardır. İlaç etkileşimleri arasında birçok ilaç ölçmek için düşük maliyetli bir yöntem yoktur oldu gibi potansiyel olarak hayat kurtaran sinerjik kombinasyonları denenmemiş kalır.
Burada, sadece bir dama tahtası tahlil ()Şekil 4 çapraz örnekleyerek ikili ve üçlü ilaç etkileşimleri ölçmek için basit bir protokol tanımlayan ve Şekil 5). Bir dama tahtası deneme diyagonal örnekleme temel kavramı Berenbaum tarafından 19789seminal işinde teorisini. Ancak, bu yaklaşım yakın zamanda uyuşturucu sinerji ekranlar10,11,12' ye uygulanmıştır. Biz bizim protokolü ile mevcut Escherichia coli (e.coli) ve büyüme fenotip. Ancak, protokol biyolojik türler ve fenotip ilgi bağımsızdır ve bu nedenle yüksek sıralı uyuşturucu sinerji biyolojik diğer bağlamlarda ölçümü için uygulanabilir unutmayın.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

Bir sinerjik uyuşturucu arada bireysel ilaçların etkileri karşılaştırıldığında daha yüksek bir etkinlik var. Dama tahtası deneyleri, nerede uyuşturucu birçok dozlarda birleştirilir, ilaç etkileşimleri, hassas ölçüm sağlar. Ancak, bu deneyleri maliyetlidir ve de birçok ilaç arasında etkileşim ölçmek için ölçek mi. Birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda geleneksel dama tahtası tahlil çapraz bir örnekleme kullanarak ilaç etkileşimi ölçüleri bildirdin. Bu alternatif yöntemi büyük ölçüde ilaç etkileşimi deneyler maliyetini azaltır ve etkileşim ölçüm birleşimleri olan birçok ilaç için sağlar. Burada, biz sadece üç 96-şey Mikroplaka ve standart Laboratuar donanımları kullanarak üç ikili etkileşimleri ve yinelenen, üç antibiyotik arasında beş günde bir üç yönlü etkileşim ölçmek için bir protokol tanımlamak. Levofloksasin + Nalidixic asit + penisilin G üç antibiyotik kombinasyonu sinerjik olduğunu gösteren temsilcisi workshop'larda. Bizim iletişim kuralı etkileşimleri arasında birçok ilaç ve çoklu ilaç sinerji patojenler ve tümörler karşı için verimli ekranlar için izin diğer biyolojik bağlamlarda ölçmek için ölçekler.

Daha önce üç uyuşturucu arasındaki ikili etkileşimler bildirdin: LEV, NAL ve PNG göre küçültülmüş dama tahtası deneyleri, nerede iki ilaç bir 4 x 4 Matriks13,14' te kombine test üzerinde. NAL ve LEV sinerjik iken, PNG hem LEV NAL13,ve14ile uzlaşmaz olduğu bildirildi. Burada, bu ikili etkileşimler doğrulanmadı ve çapraz bir tahlil kullanarak bu üç ilaçlar arasında üç yönlü etkileşim ölçülür. Sonuçlarımız LEV + NAL + PNG sinerjik bir 3-yönlü antibiyotik kombinasyonu olduğunu ispat. Bireysel deneysel işlemin bölümleri sonuçları için şematik gösterimleri Şekil 7 sağ tarafında verildi ve Şekil 8. Burada, mevcut ve Şekil 9' da verilen üç plaka okuma temsilcisi ham sonuçları yorumlamak. Üst plaka okuma seri ve doğrusal seyreltme denemeleri 2 ve 3 numaralı adımları yapılan karşılık gelir. Alt iki plaka okuma, adım 4'te yürütülen yinelenen etkileşim tabaklara.
Şekil 9 ham veriler en iyi büyüme 0,55, ama medyanın kendisi, 0,05 optik yoğunluk var. OD600 itibaren yüksek ilaç konsantrasyonları içinde gözlemlediği gibi gösterir hiçbir büyüme olduğu. Bu nedenle, biz IC50 olarak tanımlar (0.55-0.05)/2 0.25 =. Her doz-yanıt için bu değere en yakın bulunan kuyu turuncu ile gösterilir.
Þekil 9A üst yarısı adım 2, seri doz-yanıt deney sonuçlarını gösterir. LEV IC50 wells mı, 4 ng/mL için karşılık gelen sütun 10 iki çoğaltır. NAL ve PNG IC50 are 3 µg/mL ve 25 µg/mL, anılan sıraya göre. Bu konsantrasyonları Şekil 7Biçinde gösterilen 1 x konsantrasyon karşılık gelir. Şekil 9B alt yarısında adım 3, doğrusal doz-yanıt deneylerin sonuçlarını gösterir. LEV, NAL ve PNG's IC50 0.4 0.8 x ve 1.2 bulundu x, anılan sıraya göre. Bu konsantrasyonları için adım 4 X IC50 1 olarak atanır.
İki REPLICATE deneyler nerede IC50 Kuyu yapımı 9B şekiliçinde gösterilir karşılık gelen iki tabak turuncu ile gösterilir. Plaka 1, 1 x konsantrasyon onların IC50 tüm tek ilaçlar var. İkili veya Üçlü kombinasyon için beklenen IC50 tüm kombinasyonları da 1 x konsantrasyon için beklenen IC50 yapma kurucu uyuşturucu, aritmetik ortalamasının tarafından hesaplanır. Plaka 2, LEV ve PNG onların IC50 1 x konsantrasyon var, ama NAL IC50 1,2 x. Her birleşim için beklenen IC50, bu IC50 değerlerin aritmetik ortalamaları kullanılarak tanımlanır. Örneğin, 1.1 LEV + NAL ve NAL + PNG için beklenen IC50 olur x. İlaç etkileşimi (FIC) her kombinasyonu IC50 beklenen IC50 ile gözlenen plakaları sağ tarafında gösterildiği gibi bölünerek hesaplanır için puan. LEV + PNG ve NAL + PNG muhalif olmakla LEV + NAL ve LEV + NAL + PNG sinerjik, muayene iki tabak FIC puanları gösterir. İki tabak elde FIC puanları, protokol güvenilirliğini destekleyen aynı fikirdeyiz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Şekil 1: Null modeli tanım Loewe additivity ilaç etkileşimi modeli. İki 5 x 5 matrisler üzerinde bir Mikroplaka nerede uyuşturucu A doğrusal bir eksende solda gösterildiği gibi artar ve uyuşturucu en iyi bir konsantrasyon ölçülebilir fenotip (sağ üst) engeller. Bu matrisler ilavesi equipotent uyuşturucu çizgileri her tek ilaç konsantrasyonlarda uyuşturucu A. olarak aynı toplama olduğu ortada gösterilir Hücreler bu "dama tahtası" ilaç konsantrasyonu kombinasyonları üzerinde eklendiğinde, bu hat üzerinde kaydedilen fenotip bağladığı kuyular için eşdeğer olması beklenmektedir. Bu kendi kendine ilaç etkileşimi deneyde (kesikli yeşil çizgi ile gösterilen) bir fenotip tasvir eden isobole additivity boş modeli tanımlama doğrusal olması bekleniyor. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Şekil 2: Loewe additivity ilaç etkileşim modeline göre ikili ilaç etkileşimleri. Şekil1 bir dama tahtası tahlil iki ilaç birleştirildiğinde, gözlenen isophenotypic kontur düz, dışbükey veya içbükey olabilir. Sağda, mümkün isophenotypic kontür (kesik yeşil çizgiler) dama tahtası deneyleri üzerinde üst üste. Uyuşturucu kombinasyonları ile düz isophenotypic kontür vardır Loewe-katkı, kontür Loewe-katkı bir öz-self uyuşturucu müdahalesini farklı değildir olarak tanımı gereği. İsophenotypic dağılımı önemli ölçüde içbükey veya bombeli olduğunda sırasıyla sinerjik veya uzlaşmaz, oluşur. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Şekil 3: Üçlü ilaç etkileşimleri Loewe additivity ilaç etkileşim modeline göre. Dama tahtası tahlil ikili etkileşimleri için benzer, üç-uyuşturucu 3D bir kılavuzda (bir "checkercube"), nerede her uyuşturucu doğrusal bir eksende artırılır birleştirilir. Üç ilaçlar aynı olsa, isophenotypic yüzey additivity üç uyuşturucu kombinasyonları için tanımlama düz olması bekleniyor. Yüzey daha içbükey veya bu Loewe-katkı boş modeli daha bombeli ise, uyuşturucu kombinasyonları sinerjik veya uzlaşmaz, sırasıyla vardır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Şekil 4: ikili ilaç etkileşimleri ölçmek için köşegen yöntemi. Her dama tahtası tahlil için sadece kırmızı dikdörtgenler gösterilen bölgeleri ölçülür. ı ve II doğrusal olarak tek ilaç konsantrasyonu artmaktadır. III iki ilaç 1:1 karışımı ve tek bir ilaç olsaydı gibi doğrusal olarak bu karışımı titrating yaparak değerlendirilir. FIC gözlenen IC50 iki tek ilaç beklenen IC50 tarafından bölünmüş birlikte eşittir. Loewe additivity modeli için beklenen IC50 iki tek ilaç ortalama IC50 tarafından sonuna benzetilir. FIC değeri 1 Loewe-katkı çiftleri için ve daha düşük ya da sinerjik veya antagonistik çiftleri, sırasıyla2,12için 1'den daha yüksek. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Şekil 5: Üçlü ilaç etkileşimleri ölçmek için köşegen yöntemi. Her checkercube tahlil için sadece gösterilen bölgeleri ölçülür. ı, II ve III sürekli tek ilaç konsantrasyonları artan. IV 1 yaparak ölçülür: üç uyuşturucu ve tek bir ilaç sanki gibi doğrusal olarak bu karışımı titrating 1:1 karışımı. Kesirli inhibitör konsantrasyon için gözlenen IC50 3 tek ilaç verilen beklenen IC50 tarafından bölünmüş birlikte eşittir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Şekil 6: iş akışı için burada açıklanan köşegen yöntemi protokol ve her Mikroplaka için kurulum ayrıntılarını. Gün 4'te gösterilen plaka yinelenen içinde yürütülmektedir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Şekil 7: seri ve doğrusal seyreltme doz-yanıt deneyler. Bir ilaç ve karşılık gelen son ilaç konsantrasyonları (A) hazırlık seri seyreltme doz-yanıt. E. coli hücreleri plakasına eklenir; büyüme için ertesi gün kullanımda doğrusal 16 h. seri IC50, turuncu renkte gösterilen her ilaç için seçildikten sonra kaydedilen seyreltme doz-yanıt deneyler. Bir ilaç ve karşılık gelen son ilaç konsantrasyonları (B) hazırlık doğrusal seyreltme doz-yanıt. E. coli hücreleri plakasına eklenir; büyüme 16 h sonra kaydedilir. Her ilaç için ertesi gün'ın kullanılacak seçili IC50s deneyler turuncu renkte gösterilir etkileşim uyuşturucu. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Şekil 8: ilaç etkileşimi deneyler. Etkileşim deneyler hazırlıktır benzer tek ilaç doğrusal doz-yanıt, bunun dışında bir 1:1 veya 1:1:1 karışımı ilaçların iki için kullanılır veya üç doz-yanıt, sırasıyla uyuşturucu. Her doz-yanıt, turuncu, tasvir için IC50s gözlenen FIC puanlarını hesaplamak için kullanılır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Şekil 9: temsilcisi deney sonuçları. Ana metinde sağlanan ayrıntıları ile açıklandığı protokolü kullanılarak elde temsilcisi sonuçları gösterilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Ölçü sinerji arasında pek çok uyuşturucu için köşegen yöntemi

Bu protokol için Loewe additivity tabanlı ilaç etkileşimi ölçümleri yapmak ikili ve üçlü ilaç kombinasyonlarını anlatan.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

diagonal-method-to-measure-synergy-among-any-number-of-drugs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Görüntüleme.  Sabanci University. Bu protokol için Loewe additivity tabanlı ilaç etkileşimi ölçümleri yapmak ikili ve üçlü ilaç kombinasyonlarını anlatan.

Video: Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Işık Parlaklıkları değişiklikler Zebra balığı, Duyarlılık Tedbir Davranış Testi

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biyoloji

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

İnsülin Enjeksiyon ve Yetişkin İnsülin Hassasiyet Tedbir hemolimf Ekstraksiyon Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Büyüme Konileri

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of thermoregulation in birds across a variety of ecological circumstances. However, few studies characterize the contribution of the feathers alone to thermoregulation. Several previous studies have established methods for measuring the insulation value of animal pelts, but they require destructive sampling methods that are problematic for birds, whose feathers are not distributed evenly across the skin. More information is needed about 1) how the contribution of feathers to thermoregulation varies both across and within species and 2) how feather coats may change over space and time. Reported here is a method for rapidly and directly measuring the thermal performance of feather coats and the skin using dried whole skin specimens, without the need to destroy the skin specimen. This method isolates and measures the thermal gradient across a feather coat in a way that measurements of heat loss and metabolic cost in live birds, which use behavioral and physiological strategies to thermoregulate, cannot. The method employs a thermal camera, which allows the rapid collection of quantitative thermal data to measure heat loss from a stable source through the skin. This protocol can easily be applied to various research questions, is applicable to any avian taxa, and does not require destruction of the skin specimen. Finally, it will further the understanding of the importance of passive thermoregulation in birds by simplifying and accelerating the collection of quantitative data.

This protocol describes the quantification of heat transmission through a flat skinned avian specimen using a thermal camera and hot water bath. The method allows obtaining of quantitative, comparative data about the thermal performance of feather coats across species using dried flat skin specimens.

Kuş Tüyü Paltolarla Isı Kaybını Ölçmek İçin Termal Kamera Kullanma

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of ...