We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

Bu protokol ve video daha ayrıntılı 4 yazılım paketi açıklayan orijinal kağıda bir arkadaşı, yanı sıra Danuser Lab web sitesinde yazılım indirme ile birlikte Teknik Rapor olarak hizmet içindir. Okuyucular yazılımını kullanarak ilgili ek sorular varsa dikkatle bu belgeleri inceleyecek teşvik edilmektedir. 1. öncesinde Görüntü Analizi <ol><li> TIFF (Tagged Image File Format) görüntü dosyaları bir dizi halinde her zaman atlamalı film dönüştürün. Birden fazla büyüme konileri / hücreleri belirli bir film varsa, ilk hasat her büyüme konisinin / hücre kendi resim dizisini oluşturmak için. Not: Bu gerekli değildir, her bölge-faiz (ROI) plusTipTracker içinde seçilebilir gibi. Ancak, daha küçük görüntü boyutlarını kullanarak hesaplama işleme hızını artırır, böylece görüntüde belirgin boşluk varsa, bu adım önerilir. </li><li> Kendi her TIFF serisi kaydetMATLAB erişmek için ayarlanmış bir yol içindeki &quot;resim&quot; olarak adlandırılan klasör (&quot;images&quot; harf duyarlı olduğunu unutmayın). &quot;Geçerli Klasör&quot; penceresinde ilgili dosya dizini, yeni bir yol eklemek gezinmek için, dizin simgesine sağ tıklayın ve &quot;Yol Ekle - Seçilmiş Klasörler ve Alt-Klasörler&quot; seçeneğini seçin. Bu plusTipTracker yazılım klasörü yanı sıra, Path ilave edilmesi önemlidir. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Not: görüntü analizinde ilk adım, EB1-GFP kuyrukluyıldızların tespit parça halinde kuyruklu yıldızlar bağlantı ve mikrotübül dinamikleri parametrelerinin belirlenmesidir. Bu komut &quot;plusTipGetTracks&quot; 4 ile elde edilir. <ol><li> Analizi, açık MATLAB uygulamaya başlamak ve komut penceresi içine &quot;plusTipGetTracks&quot; yazın. Bu yeni bir iletişim kutusu görünmesine neden olur. </li><li> &quot;Up Yeni Projeler Set&quot; üzerine tıklayın ve bir (veya mor seçine) Uygun &quot;görüntüleri&quot; klasörünü (veya &quot;görüntü&quot; klasörler) içeren dizinleri seçerek önceki TIFF görüntü serisi. Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, bir dosya dizin (roi_1) (&quot;resimler&quot; tutan aynı klasörde) oluşturulur gelecekteki veri dosyalarını içerecek. Not: &quot;Set Up Yeni Projeler&quot; adım, ayrı bir oturum sırasında, vaktinden tamamlanabilir. </li><li> &quot;Son nokta üzerinde sağ tıklayın, bir çokgen seçin ve &#39;Mask oluşturun&#39; üzerine tıklayın&quot;: Yeni bir pencere açılacaktır. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Seçilen görüntü serisinin ilk görüntü ekrana gelecektir. Tıklayın ve büyüme konisinin bütününü kapsayan bir çokgen oluşturmak için fareyi kullanın. Çift poligonu kapatmak için fareyi tıklayın. </li><li> Poligon kapatıldı edildikten sonra, bir iletişim kutusu belirir: &quot;Başka bir ROI seçmek istiyor musunuz?&quot; Görüntü &quot;Evet&quot; seçeneğini analiz için başka bir büyüme konisi varsa; aksi halde sseçilen &quot;Hayır&quot;. </li><li> Hemen analiz edilecek projeleri seçin. &quot;Projeleri Seç&quot; tıklayın ve analiz etmek klasörü (roi_X) seçin. </li><li> Bir listSelectGUI ekranı görünecektir. Ekranın sol tarafında proje (ler) seçin ve ekranın sağ tarafında bunları üzerinde taşımak. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Proje listesi kaydetmek ve &quot;Kaydet&quot; butonuna tıklayın için bir konum seçin. </li><li> &quot;Algılama&quot;, &quot;İzleme&quot; ve &quot;Post-Processing&quot; seçeneğini seçin. Bu seçimler yapıldıktan sonra, iletişim kutusunun sağ tarafında yapılandırılabilir olacak. Her seçeneği yapılandırın. <ol><li> Bu parametreler MT parça halinde tespit kuyruklu yıldızlar bağlamak için kullanılır. Takibi için bu kontrol parametrelerini seçmek için Ayrıntıları sayfalarında yazılım paketi indir eşlik Teknik Rapor PDF 9-10 dahil edilir; problemlerle karşılaşıldığında dikkatli eğer bu raporu okudum. EB1 Xenop olarak GFP kuyrukluyıldızları izleme amaçları içinBizi büyüme konileri, kullanmak laevis&#39;den aşağıdaki Takip Ayarlar: Arama Radius Aralığı (piksel) 5-12, Minimum Alt Parça Uzunluğu (kare) 3; Maksimum Boşluk Uzunluğu (kare) 8; Maksimum Çekme Faktörü 0.8, Max açısı İleri 50, Max açı Geriye 10, dalgalanma Radius 2.5. Bu ayarlar, Şekil 1 &#39;de gösterilmektedir. </li></ol> Not: Max Küçülme Factor &quot;geri boşluklar&quot; olarak tespit &quot;geri boşluklar&quot; sayısını azaltmak için ayarlanır parça bağlantılarda kalabalık koşulları ve olası hataları verilen, büyüme konilerinin bağlamında analiz etmek yararlı değildir. Büyüme konisi MTS büyümeleri ve çekinti ilave olarak, sık sık küçük translokasyon sergilemektedir ve bu kontrol ayarları artan bağlanma adımı sırasında bu artan hareket etmesini sağlar Buna ek olarak, her iki Çok İleri açı olarak Dalgalanma yarıçapı nispeten yüksek bir değere ayarlanmaktadır. <ol><li> İstediğiniz belirli görüntü alma ayarlarına bağlı Post-Processing Ayarlar doldurun. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Ayarları düzenlendikten sonra, &quot;Başlat&quot; üzerine tıklayın. Yazılım seçilmiştir hangisi ayarları çalışacaktır. Bu seçilen projeler ve bunların boyutları sayısına bağlı olarak, saat dakika sürebilir. Komutanlığı Pencere her fonksiyon için kalan tahmini süresini gösterir. PlusTipGetTracks adım tamamlandığında, Command Window &quot;bitirdi!&quot; Görüntüleyecektir Not: mikron (MT dinamikleri belirli parametreleri artık bu yazılım tarafından hesaplanmıştır uzun bir listesi (detaylar için Referans 4), ancak büyüme konileri MT dinamiklerinin analizi için, incelemek için en yararlı parametreler MT büyüme izleme hızı vardır / dakika), saniyede büyüme parça ömrü (), ve mikron büyüme hat uzunluğu (). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Not: Şimdi mikrotübül parçaları tanımlanmış olduğundan, fonksiyon &quot;plustipSeeTracks&quot; iz görselleştirme 4 için kullanılır. Bu fonksiyon,mekansal MT dinamikleri haritalar ve hız filmler dahil görselleştirme için çoklu çıktıları sağlar, ancak burada, odak büyüme konisinin resimlerin üzerine bindirilir MT parçalarını göstermek için &quot;Track Filmler&quot; kullanarak yanlızca yapabilirsiniz. PlusTipGetTracks bir anda birden fazla film analiz ederken, plusTipSeeTracks bir seferde sadece tek bir film analiz edebilirsiniz. <ol><li> Komut penceresine &quot;plusTipSeeTracks&quot; yazın. </li><li> Iletişim kutusu yüklendikten sonra, &quot;Select Project&quot; üzerine tıklayın. Görselleştirmek ve &quot;Klasörü Seç&quot; butonuna tıklayın projeyi içeren ana dizini seçin. Yeni bir pencere açılacaktır: &quot;görselleştirmek istediğiniz projeyi seçin&quot;. Görselleştirmek ve &quot;Tamam&quot; tıklayın dosyayı seçin. </li><li> Sonra, &quot;Select Kayıtlı ROI&quot; üzerine tıklayın. Önceki adımda seçilen biri olarak aynı roi_X klasöre gidin ve &quot;roiYX&quot; adlı dosyayı seçin. </li><li> W belirtmek için &quot;Çıkış Dizin Seç&quot; tıklayınBurada MATLAB parça görselleştirme dosyaları kaydeder. Not: Biz verilerin geri kalanını içeren aynı klasörü kullanmanızı öneririz. </li><li> Seç &quot;Parça Film Yap&quot; ve ekran + TIP kuyruklu hesaplanan parça plusTipGetTracks tüm görüntüleyen görünecektir. Bu adım dosyasındaki &quot;allTracks_X_X_X&quot; in, bir film formatında izlenen zaman serisi kaydeder. Bir AVI olarak film kaydetmek için bir seçenek aksi varsayılan biçim bir Quicktime.mov dosyası olarak, orada. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Not: Bu son fonksiyon analizi ve MT yol parametrelerinin karşılaştırılması için filmler grupları oluşturmak için kullanılır. <ol><li> Komut penceresine &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; yazın. Elle karşılaştırmak için gruplarını seçmek için, ilk &quot;hiyerarşi Auto grubu&quot; de-seçin. Sonra, &quot;Select projeler&quot; üzerine tıklayın. Tüm roi_X klasörleri içeren ana dizinleri gidinanaliz etmek. </li><li> Bir listSelectGUI ekranı görünecektir. Ekranın sol taraftan gruplar içerir ve ekranın sağ tarafına onları taşımak için tüm projelerinin seçin. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Proje listesi kaydetmek ve &quot;Kaydet&quot; butonuna tıklayın için bir konum seçin. </li><li> Bir pencere çıkacaktır: &quot;listeden birinci grubu seçiniz&quot;. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. ListSelectGUI penceresi tekrar gösterecektir. Bu kez, bir araya toplanmış olmalıdır ilk gruba karşılık sadece bu dosyaları seçin. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> Ardından, grup adını girin ve &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Buna göre cevap ve grupları seçmeye devam &quot;başka bir grup seçin?&quot;: Bir pencere açılacaktır. Bir pencere çıkacaktır: &quot;grup listesini kaydetmek için bir konum seçin&quot;. Konuma gidin ve &quot;Kaydet&quot; butonuna tıklayın. </li><li> Çıkış klasörler nerede olacak seçmek için &quot;Select Output Directory&quot; üzerine tıklayınsaklanır. </li><li> Yapmak için grup analizi hangi tür seçin - MT parça yapılmalıdır her grup veya hücre analizi başına toplanmış olup olmadığını. Önerilen istatistiksel testler zaten belirlenir. Analizinde tüm parçaları dahil etmek de-seçin &quot;filminin başında / sonunda parça çıkarın&quot;. Aksi halde, seçilen bu kutuyu sahip film başladığı ve bittiği gibi sürecinde herhangi MT büyüme şarkıları kaldırır. </li><li> Grup Analizi Seçim yapıldıktan sonra, &quot;gruplarını karşılaştırma&quot; seçeneğini seçin. </li></ol>

<ol>
	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality:+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli.">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li><li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plusTipTracker:+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics.">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li><li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis.">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232 (2012).</li><li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics.">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li><li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis.">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li><li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells.">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413 (2012).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li><li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+'plus-end-tracking+proteins':+The+end+is+just+the+beginning.">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li><li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubule+growth.">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li><li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules.">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1.">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells.">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li><li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker hızlı ve otomatik olarak, bir hücre ya da büyüme konisinin hemen hemen tüm görünür EB1-GFP kuyrukluyıldızların tespit parça halinde kuyruklu yıldızlar bağlantı ve MT parametreleri hesaplamak için basit bir grafik kullanıcı arabirimi sağlar. Diğer yayınlar (. Örneğin, Marx ve ark büyüme konileri 18 etiketlendi EB1 dinamikleri de kullanılan kantitatif analiz) yazılımları benzer tipte tasarımı bildirdi. Ama bu yazılım özgürce, açık kaynak tasarlama konusunda uzmanlaşmış Danuser Lab web sitesinden, indirilebilir anahtar hücre biyolojik topluma yararlı bir yazılım olduğu gibi, erişim kolaylığı benzersiz görünmektedir. MATLAB erişim gerekli iken, bir yazılımı kullanmak için bu bilgisayar uygulama ile tamamen aşina olması gerekmez. Ancak, kullanım kolaylığı için ele alınması gereken birkaç nokta vardır. Her şeyden önce, Sof kullanırken ortaya en yaygın konulardan biriİlk kez tware ve bilgisayar uygulama dosyası yolu ile ilgilidir. Bu hata (&quot;. Cd kullanarak Hata - bir dize formatPath hata ... içermelidir Argüman&quot; istemi ile) oluşursa, o zaman en kolay çözüm &quot;görüntü&quot; ile tüm bu plusTipTracker yazılımı yanı sıra dizin sağlamak için altdizinler aynı &quot;MATLAB&quot; dosya yolu hem de vardır. Bu &quot;Program Files&quot; dizinine değilse bu &quot;Program Files&quot; adında boşluk bir sorun olabileceği öne sürülmüştür gibi, en iyisidir. Bu konuyla ilgili olarak, bu plusTipTracker ilk plusTipGetTracks analizi hesaplanırken kullanılmıştır dosya yolunu kaydeder ve bu veri erişilen ve yazılımın başka bir bileşen tarafından istihdam edildiğinde gibi, bu dosya yolu muhafaza edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Fonksiyonlar plusTipGetTracks, plusTipSeeTracks ve plusTipGroupAnalysis tüm c çalışırken, böylece orijinal kaydedilen dosya yolunu kullanın veBelirli bir film için tüm bu fonksiyonlar, başka yolu dosyaları taşıdıktan sonra, bir hata neden olur. Takip plusTipGetTracks adımında başarısız olduğunda analiz sırasında meydana başka bir ortak hatadır. Resim serisi bir çerçeve saptanabilir kuyrukluyıldızların içeriyorsa bu ortaya çıkar. Bu tamamen analizini durdurmak ve post-processing meydana gelecektir. Devam etmek için analiz bu sorunu aşmak ve izin için kolay bir düzeltme, yanlış herhangi bir gerçek parça ile bağlantılı olmayacak bir alanda görüntü üzerinde sahte bir kuyruklu yıldız yaratmaktır. Ardışık kare az sayıda mevcut olmayan herhangi bir kuyrukluyıldız nihai analize filtre edileceği gibi, son parça parametreleri etkilemez. Ortaya çıkabilecek bir diğer husus hatalı bir kuyruklu yıldız tespitidir. Bu genellikle adım 2.3 bölge-faiz seçim geliştirerek sabit olabilir. Bu aw hücrenin etrafında yakından ilgi bölge çizmek değil çizmek önemlidirdaha Ider bölge gereklidir. Yazılım kuyruklu yıldız tespiti sırasında kullanılan arka plan belirlemek için bu bölgeyi kullanır. Kuyrukluyıldız tespiti yine varsayılan ayarları ile birlikte alt-optimal ise, ayarları (adım 2.7 sırasında) plusTipGetTracks pencerede ayarlanabilir. Herhangi bir analizden sonra, o plusTipSeeTracks kullanarak, göz tarafından otomatik parça bağlantıları doğrulamak için kritik öneme sahiptir. Takip ayarları yanlış pozitif veya yanlış negatif kuyruklu bağlantıların sayısını azaltmak için değiştirilmesi gerekebilir. Orijinal plusTipTracker belgelerine 4&#39;ün yanı sıra ayarlarını optimize ilgili ayrıntılar için yazılım indirme eşlik Teknik Rapor PDF görmek. El izleme ile karşılaştırıldığında bu yazılımın performansı, daha önce nöronal olmayan hücrelerin 4 test edilmiştir. Büyüme konisi MTS, MT büyüme ve büzülmeye ek olarak, her yöne 17 sık translokasyonları sergileyen gibi büyüme koni, ancak biraz daha farklı bir sorun teşkil etmektedir. Bir issubüyük bir endişe bulunmamıştır E büyüme konisi sıkıca paketlenmiş MTlerin izleme güçlükleri 17 poz olup olmadığıdır. MTS yalnızca bir alt kümesi çözme ve bireysel EB1-GFP kuyrukluyıldızların sorunlu değildi izleme, uçları üzerinde EB1-GFP ile, büyüme fazında bulunmaktadır. Ancak unutulmamalıdır ki özellikle diğer omurgalı büyüme konilerinin göre, göreceli olarak geniş bir büyüme konisi boyutta (yaklaşık 10 mikron) arasında seçilen Xenopus laevis büyüme konileri ikinci Bu önceki çalışmalar. Bu büyük büyüme konileri kullanarak daha doğru EB1-GFP kuyrukluyıldız analizi sağlar. Xenopus laevis büyüme konisi EB1-GFP parçalarını analiz için bu yazılımın kullanımını ve doğruluğunu değerlendirmek için, biz özdeş bir veri serisi el takibi ile plusTipTracker kullanarak deneyim karşılaştırıldığında (veriler gösterilmemiştir). Süresi, el-iz sürdü EB1-GFP kuyrukluyıldızların 39 kuyruklu parça (ortalama büyüme konisi 1 dakika time-lapse SERI içindees her çerçeve arasında 2 saniye) ile yazılım iki dakika ile karşılaştırıldığında, iki saat fazla olmuştur. Iki yöntem ile elde parametreler (el-izleme için dakika başına 7.0 mikron karşı izleme Automated için dakikada 7.4 mikron) MT büyüme hızı için benzerdi. Ancak, büyüme ömrü ve uzunluğu, yazılım analizi (yaklaşık yarım zaman ve mesafeye göre) anlamlı olarak daha kısa parçalar yol açar. Bir kuyruklu yıldız ve odak dışı zamanla giderse bu yazılım tarafından bölünmüş olan büyüme parça kaynaklanmaktadır. Insan gözünün kolaylıkla aynı kuyrukluyıldız olduğunu tespit iken, yazılım değil. Bir çoklu şartları karşılaştırmak için yazılımı kullanılarak bu sorun olsa sorunlu değildir. Özdeş izleme parametreleri tüm koşullar için kullanılan (ve kuyrukluyıldızların birden koşullarında aynı oranda ve odak çıkmak olduğunu varsayarak) olduğundan, daha sonra göreceli yaşam süreleri ve uzunlukları hala karşılaştırma için oldukça yararlı ölçümlerdir. Otomatik analiz hatası sıçan gelinceES, bu görüntülerin kalitesi büyük ölçüde bağlıdır. Yüksek sinyal-gürültü filmlerde, misjoined veya yanlış parça yüzde tek haneli olduğu. Hatta (bireysel kuyrukluyıldızların hala gözle açıkça görülebilir, ancak arka plan gürültü büyüktür) düşük kaliteli filmlerde, hata oranları hala yazılımını kullanarak kaydedilen önemli zaman değer olduğunu (% 5-15) yeterince düşük hata maliyetleri. Bu, özellikle büyüme konilerinin analiz yüzlerce (koşul başına 60-8 büyüme konileri bir önceki çalışmada 17 analiz edildi) böyledir. Bu yazılım sadece bu EB1-GFP gibi büyüyen MT uçlarına bağlanan + İPUCU kuyrukluyıldızların tespiti için tasarlanmış dikkat etmek önemlidir. Bağlantı ve izleme algoritmaları kuyrukluyıldızların yalnızca MT küçülen bağlanan bir floresan etiketli + TIP dinamiklerini analiz etmek için bu yazılımı kullanarak, MTS polimerize mevcut olduğunu beklediklerini verilen yanlış bilgilere yol açacaktır büyüyen uçlarında ek biterHesaplanan MT büyüme hızları ile ilgili. Diğer tek-parçacık izleme yazılımı ile karşılaştırıldığında bu yazılımın eşsiz özelliklerinden biri, bu sadece polimerizasyon parametreleri, ama aynı zamanda çekme parametreleri hesaplamak için hesap bilinen MT davranışlar içine almasıdır. Bu yeni aynı yörünge doğrudan arkasında kurdu biriyle kayboldu bir EB1-GFP kuyrukluyıldız bağlayarak bu yapar (bu backgap veya bgap parça) denir. Bu algoritma HeLa hücreleri 4 gibi bazı hücre tipleri için iyi çalışıyor büyüme konileri MT dinamiklerini analiz ederken, o daha az etkili bir özelliktir. MT sık büyüme konisi aynı yolları (genellikle F-aktin demetleri boyunca takip) boyunca birbirini takip izler, ve bu yüzden bgap bağlantıları doğru olup olmadığını söylemek imkânsızdır çünkü. Bu nedenle, bu büyüme konisi bgap veri çıkışları kullanılması tavsiye edilmez. Bu küçük uyarılar ve sorunlara rağmenplusTipTracker kullanırken dikkate alınması (ve çoğu herhangi bir otomatik görüntü işleme programı) gereken, bu yazılım zaman görece kısa bir miktarda EB1-GFP kuyruklu binlerce analiz etmek için çok yararlı bir araç olabilir.

Bu yöntemin amacı, kantitatif mikrotübül (MT) ile ilgili bilgi, artı sona izleme proteini (+ uç) büyüme konileri canlı dinamikleri elde etmektir. MT + ipuçları MTS 9,10 artı uçları lokalize bir protein grubudur. Onlar polimerizasyon, felakete ve kurtarma oranları dahil olmak üzere MT dinamik istikrarsızlık 11, parametrelerini düzenlemek için fonksiyonları bir dizi yapmak. MT dinamiklerini analiz etmek için bir iyi kullanılan bir yöntem büyüyen MT spesifik olarak bağlanan artı-biter 1,12 + TIP EB1, davranışlarını takip etmektir. EB1 büyüyen MT birkaç diğer proteinleri işe bilinen artı-biter MT büyüme ve afet frekansı 15,16 hem teşvik, 13,14, ve son zamanlarda MT olgunlaşma faktörü 15 olarak kurulmuştur edilir. Büyüme konilerinin içindeki MT dinamikleri pek çok çalışma EB1 localizati gibi, zaman içinde 1-3 EB1-GFP dinamikleri değişiklikleri ölçmek için el-izleme yöntemlerini kullanmışlardırMT ile artı uçları MT polimerizasyonu için bir markör olarak kullanılabilir. MT büyüme için bir vekil olarak EB1-GFP kuyrukluyıldızların incelenmesi için bir anahtar yararı MT dinamikleri bile önemli MT örtüşme bölgelerinde ölçülebilir olmasıdır. El-izleme EB1-GFP kuyrukluyıldızların yöntemi MT yararlı açılımlar sağlamıştır iken, zaman alıcı ve önyargılı olabilir, 1-3 davranışları. Önemli bilgileri kaçırabilir Ayrıca, anormal büyüme gibi koni davranışlar olasılıkla (el-izleme olduğunda genellikle gerekli) MTS sadece küçük bir alt kümesini analiz sitosköletal dinamikleri dakika vardiya, sonucudur. Böylece, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin kazanılmasından sonra, yazılım paketi, plusTipTracker 4 kullanarak küresel MT dinamiği parametreleri ölçmek. Danuser Lab geliştirilen bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamikleri karakterize çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bu, bize bir açık-kaynaker-dostu, floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz içerir MATLAB tabanlı bir paket. MT dinamikleri belirli parametreler bu yazılım tarafından hesaplanan uzun bir listesi (detaylar için Referans 4), ancak büyüme konileri MT dinamiklerinin analizi için, en yararlı parametreler (mikron / dakika) MT büyüme izleme hızı vardır, büyüme parça (saniye olarak) ömür boyu, ve (mikron) büyüme hat uzunluğu. Yazılım (&quot;Software&quot; altında) Danuser Lab web sitesinden doğrudan indirilebilir. Danuser Lab şu anda orijinal, stand-alone yazılım mevcut kalacak bir yazılım paketi olarak adlandırılan u-track 2.0, içine dahil edilmiştir + TIP izleme analizi için yeni bir arabirimi destekler iken. İki program arasındaki temel algoritmalar arayüzü ve analiz çıkışların tek bir farkla, (en azından 2014 gibi) aynıdır. Biraz MATLAB ve / veya hesaplama analizleri tecrübeleri acemi kullanıcı içinence, plusTipTracker otomatik istatistiksel parametre çıkışlar dahil olmak üzere daha kullanıcı dostu özelliklere sahiptir. Burada, biz kültürlü Xenopus laevis büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri görüntüleri analiz etmek için adımları açıklar. Bu protokol MT dinamikleri 17 inceleyen bir son kağıt kullanılmıştır. Ayrıca Lowery ve ark bakın. 2.012 5 EB1-GFP ifade kültürleme büyüme konileri ilişkin ayrıntılı talimatlar için. Bu kağıt öncelikle büyüme konisi EB1-GFP dinamikleri incelenerek odaklanırken, aynı protokol diğer hücre tipleri 17 için kullanılabilir. Tüm hücre tipleri için, çerçeveler arasındaki zaman aralığının en uygun + TIP takip 0.5-2 saniye arasında olmalıdır. Çerçeveler arasındaki kadar 4 saniyelik bir zaman aralığı mümkündür, ancak bu ek izleme hataları zaman aralığı sonuçları artmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

Mikrotubul (MT) artı-son-izleme proteinler (+ TIPler) MTS büyüyen artı uçlarına lokalize ve MT dinamiklerini 1,2 düzenler. MT dinamiklerini analiz etmek için en iyi bilinen ve + yaygın kullanılan ipuçları biri büyüyen tüm MT artı uçları bağlanır Sonu Binding Protein, EB1, ve böylece, MT polimerizasyonu 1 için bir göstergedir. Büyüme konilerinin içindeki EB1 davranışı bir çok çalışmalar bireysel MTlerin 1-3 analiz zaman tüketen ve önyargılı bilgisayar destekli, el-izleme yöntemlerini kullandık. Bizim yaklaşımımız, yüksek çözünürlüklü, kültürlü embriyonik büyüme konileri 5 etiketlendi EB1 canlı görüntülerin satın Aşağıdaki yazılım paketi, plusTipTracker kullanarak 4 MT dinamikleri küresel parametrelerini ölçmek için olduğunu. Bu yazılım floresan etiketli + ipuçları filmler için otomatik algılama, izleme, görselleştirme ve analiz birleştiren bir MATLAB tabanlı, açık kaynak, kullanıcı-dostu paketidir. Burada, biz plusTipT kullanmak için protokol mevcutkültürlü Xenopus laevis büyüme konisi floresan etiketli + TIP kuyrukluyıldızların analizi için racker. Bununla birlikte, bu yazılım, çeşitli hücre tipleri 6-8 MT dinamiğini karakterize etmek için kullanılabilir.

Burada anlatılan canlı hücrelerin + TIP dinamiklerini ölçmek birkaç bilgi dosyaları sağlayacak bu yazılımı kullanarak. Bu fonksiyon plusTipGetTracks (Şekil 1 &#39;de gösterilen örnek ayarlar kullanılarak) parçaları tanımlar ve ardından + TIP parçaları ile ilgili parametreleri içerir. Yazılım elde ettiği bilgileri görüntülemek için, adım 2.2 oluşturulan roi_X dizine gidin. &quot;Ustalık&quot; klasörü tespit kuyrukluyıldızların gösteren görüntülerin bir dizi olan, &quot;overlayImages&quot; içerir. Kuyruklu algılama doğruluğunu gösterebilen görüntü analiz yazılımı kullanarak bu görüntüleri incelenmesi. &quot;Meta&quot; klasörünün de detaylı &quot;projData&quot; dosyası dahil + TIP kuyrukluyıldız istatistiklerine ilişkin bilgiler, yanı sıra &quot;İstatistikler&quot; dosyasını içerir. &quot;Stats&quot; dosyasını görüntülemek için, bir elektronik tablo uygulaması açık bir çalışma içine sürükleyin. Bu dosya hesaplamak içeriyorHer film (Şekil 2) d mikrotübül parametreleri. Yukarıda belirtildiği gibi, MT dinamikleri spesifik parametrelerle uzun bir liste MT büyüme iz hızı (mikron / dakika), (saniye) büyüme parça ömrü ve büyüme hat uzunluğu dahil, (ayrıntılar için Referans 4) Bu yazılım tarafından hesaplanır (mikron). Işlevi plusTipSeeTracks dosyayı &quot;allTracks_X_X_X&quot; (Şekil 3) açılarak gözden geçirilebilir izlenen kuyruklu, bir film kaydeder. Fonksiyon plusTipGroupAnalysis gruplar halinde birden fazla bireysel veri setleri birleştirir ve klasörleri her grup içindeki grupları ve bireysel parametreleri karşılaştırmak için histogramlar, arsa, ve elektronik tablolar dahil olmak üzere grup parametre veri içeren (hangi analiz seçilir alan bağlı adında Percell veya pooledData) oluşturur (Şekil 4). <img alt="Şekil 1" fo:content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52138 / 52138fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Xenopus laevis büyüme konisi EB1-GFP kuyrukluyıldızların için kullanılan Şekil 1. PlusTipGetTracks ayarları. Bu rakam EB1-GFP analizi için kullanılan olabilir &quot;Algılama&quot;, &quot;İzleme&quot; ve &quot;Post-Processing&quot; adımlar için özel ayarları gösterir Xenopus laevis büyüme konisi kuyrukluyıldızların. PlusTipTracker paket içinde mevcut plusTipParamSweepGUI aracı, diğer organizma modellerine ve / veya hücre tipi 7 için izleme ayarlarının optimize etmek için kullanılabilir. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig2highres.jpg" width="500" /> PlusTipGetTracks analizinden elde MT parametrelerinin Şekil 2. Screenshot. &quot;Meta&quot; klasörü, çalışan plusTipGetTracks tarafından oluşturulan, + TIP c ile ilgili bilgiler içerirOMET istatistikleri. Bir elektronik tablo uygulaması &quot;Stats&quot; dosyasını sürükleyerek, mikrotübül dinamikleri parametreler incelenebilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig3highres.jpg" width="600" /> PlusTipSeeTracks analizinden elde MT parça film Şekil 3. Ekran Görüntüsü. PlusTipSeeTracks mikrotübül parça görselleştirme sağlar, ama aynı zamanda kullanıcı plusTipGetTracks alınan verilerin geçerliliğini görmek için izin vererek bir doğrulama aracı olarak da hizmet veriyor. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52138/52138fig4highres.jpg" width="500" /> PlusTipGroupAnalysis elde edilen MT parametreleri Şekil 4. Ekran Görüntüsü. PlusTipGroupAnalysis karşılaştırarak gruplar ve betwee bireysel parametreler için kullanıcıya basit bir yöntem sunuyorBirden fazla bireysel veri setleri birleştirerek ve bir elektronik tablo uygulamasında muayene edilebilir istatistik çıktı, üreterek her grup içinde n.

Watch this Scientific Journal Video about Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones at JoVE.com

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

MATLAB tabanlı, açık kaynak yazılım paketi, plusTipTracker, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için floresan etiketli + ipuçları görüntü serilerini analiz etmek için kullanılabilir.

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Büyüme Konileri

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

using-plustiptracker-software-to-measure-microtubule-dynamics-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K Görüntüleme.  Boston College.  MATLAB tabanlı, açık kaynak yazılım paketi, plusTipTracker, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için floresan etiketli + ipuçları görüntü serilerini analiz etmek için kullanılabilir. 

Video: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Biyoloji

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Üretimi<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Yumurta Mikrotubul ilişkili RNA&#39;lar tanımak ayıklar

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Yüz Nakli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyolar

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Diseksiyonu<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Sinir Crest için<em&gt; In vitro</em&gt; Eksplantasyon Kültür veya<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantasyon

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Içinde Mikrotubul Dynamics Tedbir plusTipTracker Yazılım Kullanma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Xenopus laevis Dişiler Yumurta Alınması

Xenopus laevis Yumurta hazırlanması ve Fraksiyonu ayıklar.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Doku belirlenmesi Hayvan Cap Nakli (ACT) Testi Xenopus laevis

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis

Üretimi

Yüz Nakli

Diseksiyonu

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis