Diese Arbeit wurde von NIGMS Grant P50GM107618 finanziert. Die Autoren danken für die hilfreichen Kommentare und Anregungen zum Manuskript Zohar B. Weinstein.

Hinweis: Jedes kleines Molekül, das Wachstum von E. Coli Bakterien hemmt die Diagonale Methode einsetzbar. In diesem Protokoll, Levofloxacin (LEV), wird Nalidixic Säure (NAL) und Penicillin G (PNG) als Beispiel verwendet, da diese Medikamente eine auffallende Dreiwege Synergie zeigen. Der Workflow dieses Protokolls wird als Abbildung 6dargestellt. Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur. Verwenden Sie frische Aliquote von Bakterien und Drogen jeden Tag. Führen Sie das Experiment unter Biosafety Niveaus geeignet für E. Coli.
1. vorbereitende Schritte
<ol><li>Bereiten Sie Luria-Bertani (LB) Medien zu, indem Sie 1 L destilliertes Wasser 25 g LB Brühe hinzufügen und mischen. Autoklaven bei 121 ° C für 15 min und autoklaviert Medien bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie E. Coli Glycerin Bestände durch Mischen gleiche Volumina von sterilen 50 % Glycerin und Bakterienzellen verdünnt auf OD600 = 1 in LB Brühe und Einfrieren 150 µL-Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei-80 ° C.</li>
	<li>20 mg Antibiotika, LEV, NAL und PNG in 1 mL jedes Dimethyl Sulfoxid (DMSO) auflösen. Verdünnen Sie LEV Lösung 100 X 0,2 µg/ml durch das Mischen von 10 µL LEV-Lösung mit 990 µL von DMSO. Verwenden Sie 0,2 mg/mL LEV und 20 mg/mL NAL und PNG in den Schritten fortfahren.</li>
	<li>Aliquoten 50 µL jedes Antibiotikum 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Einfrieren bei-20 ° C.</li>
	<li>Nehmen Sie eine 150 µL aliquoten von E. Coli von-80 ° C. Tauwetter.</li>
	<li>100 µL der E. Coli -Glycerin-Lager in 5 mL LB Medien in einem 14 mL Kultur Rohr hinzufügen.</li>
	<li>Schütteln Sie die Rohre in einem Inkubator 37 ° C über Nacht bei 200 u/min.</li>
</ol>2. serielle Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experiment
<ol><li>Nehmen Sie eine Aliquote Drogen LEV, NAL und PNG von-20 ° C, lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 10 min Auftauen und bereiten für serielle Verdünnungen dieser Medikamente.</li>
	<li>Bereiten Sie 1100 µL LB - 10 % Sol durch das Mischen von 990 µL LB Medien und 110 µL des Lösungsmittels (DMSO).</li>
	<li>Bereiten Sie 500 µL LB - 10 % LEV durch das Mischen von 450 µL LB Medien und 50 µL der LEV.</li>
	<li>Vortex LB - 10 % Sol für 5 s bei der höchsten Einstellung. Die obersten vier Reihen von Brunnen in einer 96-Well-Mikrotestplatte 20 µL LB - 10 % Sol hinzufügen.</li>
	<li>Vortex LB - 10 % LEV für 5 s bei der höchsten Einstellung. Die erste Bohrung in Zeile A. 20 µL LB - 10 % LEV hinzufügen</li>
	<li>Wappnen Sie zweifach serielle Verdünnung für LB - 10 % LEV 20 µL aus dem ersten Brunnen, hinzufügen zum zweiten Brunnen, nach oben und unten fünfmal pipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Brunnen gegenüber dem Vorquartal bis 11. gut, endet mit 40 µL (Abb. 7A).</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie 20 µL des Inhalts vom 11. gut, mit einer Mikropipette.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,7 für die Drogen NAL und mit der zweiten und dritten Zeilen der Mikrotestplatte bzw. PNG.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,3 bis 2,7 für das Medikament LEV am vierten Zeile wieder als interne positive Kontrolle.</li>
	<li>Mit einem Spektralphotometer messen die OD600 eine 01:10 Verdünnung der Kultur (Stufen 1,5-1,7).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen in 5 mL LB-Medien auf einem OD-600 von 0,01. Gießen Sie in ein Reservoir.</li>
	<li>Mit einem Mehrkanal-mikropipette, 80 µL der verdünnten Zellen fügen Sie hinzu, die Droge serielle Verdünnungen in Schritt 2,4-2,9 vorbereitet. Die Letzte Droge-Konzentrationen in jede Vertiefung ist in Abbildung 7Agezeigt. Versiegeln Sie die Platte, um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 ° c</li>
	<li>Starten Sie eine neue Bakterienkultur im Schritt 3 verwenden (wiederholen Sie Schritte 1,5-1,7).</li>
</ol>3. lineare Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experiment
<ol><li>Messen Sie die OD600 Extinktion für serielle Verdünnung Dosis-Wirkungs-Platte aus Schritt 2 mit einem Teller Reader (Abbildung 7A Rechts) zu und interpretieren Sie der Ergebnisse anhand der folgenden Schritte.</li>
	<li>Normalisieren Sie das Wachstum zu, indem man das Wachstum in jedem Bohrloch mit dem Wachstum in der keine Doping-Kontrolle für jede Zeile und berechnen Sie Prozent Wachstum durch die Normalisierung der OD600bis kein Medikament Zustand zu.</li>
	<li>Suchen Sie für jedes Medikament die Brunnen, die Wachstumshemmung ~ 50 % (IC50) in Orange in Abbildung 7A richtigdargestellt haben. Weisen Sie die Konzentration in diesen Brunnen als "serielle IC50" für jedes Medikament.</li>
	<li>Tauen Sie frischen Droge Aliquote, bereiten Sie 1 mL LB - 10 % Sol durch Mischen LB Medien und Lösungsmittel (DMSO) in einem Verhältnis von 9:1 und LB - 10 % Droge durch Mischen von LB Medien und Droge im Verhältnis 9:1, wo die Wirkstoffkonzentration 100 X serielle IC50 jedes Medikament ist vor dem Hinzufügen der LB Medien , wie bei Schritt 3.3 gewählt.</li>
	<li>Bereiten Sie Linear steigende Dosen von Medikamenten LEV, NAL und PNG in 11 Konzentrationen durch Mischen LB - 10 % Drogen- und LB - 10 % Sol in Mengen, die in Abbildung 7gezeigt.</li>
	<li>Bereiten Sie Linear steigende Dosen von LEV am vierten Zeile als eine interne Positivkontrolle.</li>
	<li>Messen Sie die OD600 von der 01:10 Verdünnung der Kultur begann im Schritt 2.14.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen in 5 mL LB-Medien auf einem OD-600 von 0,01. Gießen Sie in ein Reservoir.</li>
	<li>Fügen Sie 80 µL der verdünnten Zellen auf die Droge lineare Verdünnungen im Schritt mit einem Mehrkanal-Mikropipette 3.6 vorbereitet. Die Letzte Droge-Konzentrationen in jede Vertiefung ist in Abbildung 7 bgezeigt. Hinweis: Die Mitte in der Dosis-Wirkungs-erhalten die serielle IC50 für dieses Medikament. Dichtplatte um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 16 h bei 37 ° c</li>
	<li>Starten Sie zwei frische Bakterienkulturen im Schritt 4 verwenden (wiederholen Sie Schritte 1,5-1,7).</li>
</ol>(4) Diagonale Drug Interaction Experiment
<ol><li>Messen Sie die OD600 Extinktion für Dosis-Wirkungs-lineare Verdünnung von Schritt 3 (Abb. 7 b).</li>
	<li>Wählen Sie für jedes Medikament die Konzentration, die IC50 führte und bereiten Drogen LEV, NAL und PNG in 100 x IC50 Konzentrationen.</li>
	<li>Tauen Sie frische Drogen, bereiten Sie 100 x IC50 für jedes Medikament und bereiten Sie 1:1-Wirkstoff-Mischungen nach Volumen von LEV + NAL, LEV + PNG und NAL + PNG und 1:1:1 Medikament Mischung Volumenprozent LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei Platten auf Droge Interaktion Experimente wie in Abbildung 8dargestellt.</li>
	<li>Messen Sie die OD600 von der 01:10 Verdünnung der Kulturen im Schritt 3.11 begann.</li>
	<li>Bereiten Sie OD600 = 0,01 Verdünnungen zweier Kulturen in zwei 10 mL LB Medien.</li>
	<li>Fügen Sie 80 µL der Zellen von Kultur 1 und 2 auf Platten 1 und 2, beziehungsweise. Versiegeln Sie die Platten um Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Sie die Platten für 16 h bei 37 ° c</li>
</ol>5. Diagonale Drug Interaction Scores
<ol><li>Maßnahme die OD600 Extinktion für Diagonale Wechselwirkungen experimentieren Platten aus Schritt 4.</li>
	<li>Das Wachstum zu normalisieren, indem man das Wachstum in jedem Bohrloch mit dem Wachstum keine Drogenkontrolle gut für jede Zeile.</li>
	<li>Suchen Sie für jede Zeile Spalte, die Wachstumshemmung am nächsten IC50, rechts in Orange in Abbildung 8 dargestellt hat. Ordnen Sie IC50 basierend auf die relative Konzentration des Medikaments in dieser gut zu.</li>
	<li>Für LEV + NAL, LEV + PNG und NAL + PNG und LEV + NAL + PNG Dosis-Reaktionen Berechnung erwartete IC50 durch Mittelung der IC50 der einzelnen Drogen in jeder Kombination. Beachten Sie, dass im Durchschnitt eine einfache Näherung für genaue erwartete IC50-Berechnung ist wie vor12beschrieben.</li>
	<li>Berechnen Sie gebrochene inhibitorischen Konzentration (FIC) punktet durch die Aufteilung der beobachteten IC50 durch den erwarteten IC50 in jeder Kombination.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Verwendung von Medikamenten-Kombinationen gegen Krankheitserreger oder Tumoren ist eine attraktive Perspektive, besonders unter den Umständen der Trocknung Antibiotika Pipeline. Allerdings ist dieses Potenzial durch mindestens zwei Schwierigkeiten behindert. Die erste Schwierigkeit ist die astronomische Zahl der möglichen Kombinationen. Zum Beispiel gibt es 4950 paarweisen Kombinationsmöglichkeiten unter 100 Antibiotika. Alle möglichen Kombinationen unter 100 Antibiotika (2100) ist auf der gleichen Größenordnung mit der Anzahl der Bakterien auf der Erde (~ 10-30). Wie stark synergistische Kombinationen aus diesen Möglichkeiten vorhergesagt wurde Gegenstand zahlreicher rechnerische Untersuchungen. Die zweite Schwierigkeit ist die Messung der höchstwertige Arzneimittel-Wechselwirkungen. Der Auffassung, dass eine rechnerische Plattform darauf hindeuten könnte, dass eine bestimmte 10-Wirkstoff-Kombination gegen einen bestimmten Erreger stark synergistisch ist. Traditionelle Methoden, Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten zu testen ist zu teuer, zu überprüfen oder zu widerlegen diese Hypothese, daher wurde das Studium der Synergie zwischen viele Medikamente außerhalb der Grenzen der wissenschaftlichen Untersuchung. Die Diagonale Methode, die wurde vor fast 30 Jahren vorgeschlagen und wurde in den letzten Synergie-Bildschirmen verwendet bieten ein starkes Fundament für das erste Problem, indem es erlaubt, Prüfung von der Interaktion zwischen den vielen Paaren. Es löst das zweite Problem durch eine informative Probenahme von der traditionellen Assays und ermöglicht die Untersuchung der Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten höchstwertige.
Wir beachten wichtig ist, dass unser Protokoll eine lineare Dosierung für Droge Interaktion Messungen verwendet für die Empfindlichkeit zur Erkennung von gar schwachen Wechselwirkungen. Festlegung des richtigen Konzentrationsbereichs für lineare Dosierung ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Durch die erste Durchführung eine serielle Verdünnung, machen wir eine fundierte Entscheidung über den Suchraum für lineare Dosierung. Aber das Protokoll kann geändert werden, um 2-fach verwenden oder höhere Verdünnungsreihen für Drogen-Interaktion zu testen. Eine solche Änderung würde das Experiment zu verkürzen und ermöglichen das Testen von mehr Interaktionen; Allerdings hätte es Sensibilität zu nur stark synergistische oder antagonistische Interaktionen zu erkennen.
Das Protokoll, die, das wir beschrieben, zeigt die Messung der paarweisen oder Dreiwege Interaktionen. Ein kritischer Aspekt des Protokolls ist, dass einzelne Agenten auf der gleichen Platte als Kombination, um Verzerrung aufgrund Platte Variationen zu minimieren. Daher kann das Protokoll angepasst werden um Interaktionen bis zu 7-Wege-Kombinationen zu messen durch triviale Änderungen. Kombinationen von mehr als 7 Medikamenten erfordert mehr als eine 96-Well Mikrotestplatte und weitere Überlegungen getroffen werden, um korrekte Datenintegration, wie zwischen den Platten Wiederholungen zu gewährleisten.
Eine nennenswerte Einschränkung der Diagonale Methode ist die Einschränkung, dass jedes Medikament in der Probe muss den Phänotyp von Interesse zu hemmen. Daher ist die Diagonale Methode nicht hilfreich für das Verständnis der Interaktionen zwischen den Wirkstoffen und inerte Adjuvantien. Solche "potenzierende" Wechselwirkungen können unter alternative Modelle wie Glückseligkeit oder höchsten Einzelsubstanz Modelle untersucht.
Ein wichtiger Aspekt für die Analyse von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten höchstwertige eignet sich null Modell für "erwartet, die IC50." Wenn zwei Medikamente kombiniert werden, kann die Kombination Wirkung nur auf die einzelnen Drogenwirkungen verglichen werden. Wenn drei Medikamenten kombiniert werden, kann die Kombination Wirkung auf die einzelnen paarweise Auswirkungen oder verglichen werden. Zum Beispiel wenn alle paarweise Kombinationen der drei Medikamente synergistische sind, dann es zu rechnen, dass diese Medikamente eine drei-Wege-Synergie zeigen werden. Eine drei-Wege-Interaktion Abweichung von paarweisen Interaktionen Erwartungen hat vor kurzem "emergent Interaktion"16,17genannt. Der Einfachheit halber beschreibt unser Protokoll die Messung der drei-Wege-Kombination "net Interaktion," die null Modell als einziges Medikament Auswirkungen definiert. Die Daten, die von dem Protokoll vorliegt können jedoch auch verwendet werden, um die emergent Interaktion der drei-Wege-Kombination zu berechnen. In unserer Analyse haben wir die erwartete IC50 der Dreiwege Kombination als der Durchschnitt der einzelnen Droge IC50s definiert. Alternativ können die erwarteten IC50 als Durchschnitt der IC50s der paarweisen Kombinationen (~1.1-1.2) definiert werden. Wenn die beobachteten IC50 durch diese alternative erwarteten IC50 geteilt wird, bietet der erhaltenen FIC emergent FIC für die drei-Wege-Kombination als zuvor beschriebenen12. Diese Überlegung zeigt, dass LEV + NAL + PNG mehr ist als was man erwarten würde von paarweisen Interaktionen zwischen drei Medikamente, synergistische zeigt, dass LEV + NAL + PNG emergent Synergie hat.

Wirkstoffkombinationen können überraschend hohe oder niedrige Auswirkung auf einen Phänotyp angesichts der Auswirkungen der konstituierenden Drogen, entsprechend synergistisch oder antagonistisch Arzneimittelinteraktionen, bzw.1,2,3aufweisen. Synergistische Kombinationen können Dosissteigerung zur Erhöhung der Wirksamkeit und Dosisreduktion für Nebenwirkung Relief. Kombinationstherapien können auch mehrere Rückschläge auf zellulären Maschinerie, dadurch blockiert mögliche evolutionäre Fluchtmechanismen Widerstand4anwenden. Daher sind Kombinationen von drei oder mehr Medikamenten Krankheitserreger oder Krebs Behandlung5routinemäßig eingesetzt.
Synergie und Antagonismus werden durch einen Vergleich zwischen den beobachteten Effekt einer Kombination im Vergleich zu einem erwarteten Wirkung gegeben einzelnen Drogenwirkungen definiert. Unter den Modellen für Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten Loewe Additivität ist die strengste und hat ein klar definiertes null Modell ()Abbildung 1()6, und die abgeleitete Synergie/Antagonismus Interaktion ist unabhängig von der verwendeten Konzentration der Droge 6 , 7. Loewe Modell ist jedoch auch für einen paarweisen Wechselwirkung Test experimentell kostspielig. Droge Interaktion Assays bestehen traditionell aus einer 2D-Matrix Wirkstoffkombinationen Konzentration (ein Schachbrett-Assay) ()Abbildung 2(). Wenn 5 Dosen sind für jedes Medikament verwendet, dann 25 Kombinationen erforderlich sind, entspricht eine Hälfte einer Mikrotestplatte wenn Experimente in Wiederholung durchgeführt werden. Die Kosten für diesen Ansatz verbietet Synergie Messung vom Loewe Additivität Modell für Multi-Wirkstoffkombinationen ()Abbildung 3(). Zum Beispiel um eine 10-fach-Interaktion zu testen, müsste traditionelle Methoden mehr als 100 Tausend Mikroplatten, abgesehen von experimentellen Messung von höherwertigen Synergien durch das strenge, gut theoretisiert und Konzentration-unabhängige Loewe Additivität Modell 8.
Aktuelle klinische Behandlungen nutzen nur einen Bruchteil der möglichen Medikamenten-Kombinationen. Die standard-Behandlung von aktiver Tuberkulose ist beispielsweise eine Kombination aus drei Antibiotika. Es gibt etwa 20 Antibiotika in Mycobacterium Tuberculosis (Mtb) Behandlung verwendet. Es gibt 1140 3-Wege-Kombinationen unter 20 Medikamente, jeweils mit dem Potenzial, eine starke Synergie gegen Mtbhaben. Da gab es keine kostengünstige Methode zur Messung von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten zu viele Drogen, bleiben potentiell lebensrettende synergistische Kombinationen ungetestet.
Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Messung der paarweisen und Dreiwege Arzneimittel-Wechselwirkungen durch Stichproben nur die Diagonale von einem Schachbrett-Assay ()Abbildung 4 und Abbildung 5(). Das zugrunde liegende Konzept der Probenahme die Diagonale von einem Schachbrett-Experiment wurde von Berenbaum in seiner bahnbrechenden Arbeit in 19789theoretisiert. Dieser Ansatz wurde jedoch erst vor kurzem auf Droge Synergie Bildschirme10,11,12angewendet. Wir präsentieren unser Protokoll mit Escherichia coli (E. Coli) und dem Wachstum Phänotyp. Wir beachten Sie jedoch, dass das Protokoll unabhängig von der biologischen Arten und Phänotyp von Interesse, und daher auf die Messung von höherwertigen Droge Synergie in anderen biologischen zusammenhängen angewendet werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

Eine synergetische Wirkstoffkombination hat eine höhere Wirksamkeit im Vergleich zu den Auswirkungen der einzelnen Drogen. Schachbrett-Assays, wo Drogen in viele Dosen verbunden sind, können empfindliche Messung von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten. Aber diese Assays sind teuer und nicht gut für die Messung der Interaktion zwischen den vielen Medikamenten skalieren. Mehrere neuere Studien berichteten Droge Interaktion Messungen mittels eine Diagonale Probenahme von den traditionellen Schachbrett-Assay. Diese alternative Methode erheblich verringert die Kosten der Droge Interaktion Experimente und ermöglicht Interaktion Messung für Kombinationen mit vielen Medikamenten. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der drei paarweisen Interaktionen und ein Dreiwege Interaktion zwischen drei Antibiotika in zweifacher Ausfertigung, in fünf Tagen, mit nur drei 96-Well-Mikroplatten und standard Laborgeräten. Wir präsentieren repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die drei-Antibiotikum-Kombination von Levofloxacin + Nalidixic Säure + Penicillin G synergistische ist. Unser Protokoll verkalkt, um Interaktionen zu viele Drogen und in anderen biologischen zusammenhängen ermöglicht effiziente Bildschirme für Multi-Drug Synergien gegen Krankheitserreger und Tumoren zu messen.

Bisher haben wir die paarweisen Interaktionen zwischen drei Drogen berichtet: LEV, NAL und PNG basierend auf Tests in miniaturisierten Schachbrett-Assays, wo zwei Drogen wurden in einem 4 x 4-Matrix13,14kombiniert. NAL und LEV synergistische waren, wurde PNG berichtet, antagonistischen mit NAL und LEV13,14. Hier, wir überprüft diese paarweisen Interaktionen und die Dreiwege Interaktion zwischen diesen drei Medikamente mit einem diagonalen Assay gemessen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass LEV + NAL + PNG eine synergistische 3-Wege-Antibiotika-Kombination. Schematische Darstellungen für die Ergebnisse der einzelnen Versuchsdurchführung Abschnitte erhielten auf der rechten Seite von Abbildung 7 und Abbildung 8. Hier präsentieren wir und interpretieren repräsentative raw Ergebnisse aus drei Lesungen, Platte, die in Abbildung 9gegeben sind. Die obere Platte Lesung entspricht serielle und lineare Verdünnung Experimente in den Schritten 2 und 3. Die unteren zwei Teller Lesungen sind doppelte Interaktion Platten in Schritt 4 durchgeführt.
Die Rohdaten in Abbildung 9 zeigt, dass Wachstum um 0,55, aber es eine 0,05 optische Dichte des Mediums selbst gibt, wie in der OD600 der hohen Wirkstoff-Konzentrationen beobachtet wo gibt es kein Wachstum. Daher definieren wir als IC50 (0.55-0.05)/2 = 0,25. Für jede Dosis-Wirkungs-sind die Brunnen befindet sich am nächsten an diesem Wert mit Orange angezeigt.
Die obere Hälfte der Abbildung 9A zeigt die Ergebnisse aus Schritt 2, serielle Dosis-Wirkungs-Experiment. Die IC50 Wells für LEV ist in Spalte 10 in zwei Wiederholungen, die 4 ng/mL entsprechen. Die IC50 für NAL und PNG sind 3 µg/mL und 25 µg/mL, beziehungsweise. Diese Konzentrationen entsprechen 1 X-Konzentration, die in Abbildung 7gezeigt. Die untere Hälfte der Figur 9 zeigt die Ergebnisse aus Schritt 3, lineare Dosis-Wirkungs-Experimente. LEV, NAL und PNG IC50 befinden sich 0,4 x 0,8 x und 1.2 X, beziehungsweise. Diese Konzentrationen sind als 1 X IC50 für Schritt 4 zugewiesen.
Zwei Platten entspricht zwei replizieren, die Versuche sind in Abbildung 9 b, wo die IC50 Brunnen gezeigt werden in Orange angezeigt. Ihre IC50 stehen alle einzelnen Drogen in Platte 1 1 X Konzentration. Die erwarteten IC50 für die paarweise oder Dreiwege Kombination errechnet sich durch das arithmetische Mittel der konstituierenden Drogen machen erwarteten IC50 für alle Kombinationen auch 1 X Konzentration. In Platte 2, LEV und PNG haben ihre IC50 bei 1 X Konzentration, aber NAL IC50 ist bei 1,2 X. Die erwarteten IC50 für jede Kombination wird über das arithmetische Mittel dieser IC50-Werte definiert. Beispielsweise ist die erwartete IC50 für LEV + NAL und NAL + PNG 1.1 X. Die Wechselwirkungen zwischen Medikamenten Punkten (FIC) für jede Kombination dividiert wird beobachtet IC50 mit der erwarteten IC50 wie auf der rechten Seite der Platten dargestellt. Inspektion der FIC Partituren der beiden Platten zeigt, dass LEV + NAL und LEV + NAL + PNG synergistische, während LEV + PNG und NAL + PNG feindselig sind. FIC Partituren erwarb die beiden Platten sind sich einig, die Zuverlässigkeit des Protokolls zu unterstützen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Abbildung 1: Null Modelldefinition für Loewe Additivität Medikament Interaktionsmodell. Zwei 5 x 5 Matrizen auf einer Mikrotestplatte Medikament A steigt linear in einer Achse, wie links gezeigt, wobei eine höchste Konzentration des Arzneimittels hemmt einen quantifizierbaren Phänotyp (oben rechts). Die Zugabe dieser Matrizen zeigt sich in der Mitte, wo die Verbindungslinien zwar Medikament Konzentrationen in jedes einzelne Medikament die gleiche Konzentration als Medikament A. haben Wenn Zellen auf diese "Schachbrett" Konzentration Wirkstoffkombinationen hinzugefügt werden, wird davon ausgegangen, dass der aufgezeichneten Phänotyp auf dieser Linie werden Äquivalent für die Brunnen, die sie verbindet. In diesem selbst-selbst-Droge Interaktion Experiment soll die Isobole Darstellung eines Phänotyps (mit einer grünen gestrichelten Linie dargestellt) linear, definieren die Additivität null Modell sein. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Abbildung 2: paarweise Drogeinteraktionen nach Loewe Additivität Medikament Interaktionsmodell. Wenn zwei Medikamente in einem Schachbrettmuster Assay wie in Abbildung 1kombiniert werden, kann die beobachteten Isophenotypic Kontur gerade, konvex oder konkav sein. Auf der rechten Seite sind mögliche Isophenotypic Konturen (grün gestrichelt) Schachbrett Assays überlagert. Wirkstoffkombinationen mit geraden Isophenotypic Konturen sind Loewe-Additiv, da die Konturen nicht anders als eine selbst-selbst-Wechselwirkungen sind die Loewe-Additiv ist per Definition. Wenn die Isophenotypic Kontur deutlich konkav oder konvex ist, ist die Kombination synergistisch oder antagonistisch, beziehungsweise. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Abbildung 3: Dreiwege Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten nach Loewe Additivität Medikament Interaktionsmodell. Ähnlich wie bei der Schachbrett-Assay für paarweisen Interaktionen, werden drei Drogen in einem 3D Raster (ein "Checkercube"), kombiniert, wo jedes Medikament in einer Achse linear erhöht wird. Wenn die drei Medikamente identisch wären, dürfte die Isophenotypic Oberfläche flach, definieren die Additivität für drei Wirkstoffkombinationen werden. Wenn die Oberfläche konkav oder konvex als dieses null Loewe-Additiv-Modell ist, sind Wirkstoffkombinationen synergistisch oder antagonistisch, beziehungsweise. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Abbildung 4: Diagonale Methode zur Messung der paarweisen Arzneimittelinteraktionen. Für jedes Schachbrett-Assay gemessen werden nur die Bereiche in Magenta Rechtecke dargestellt. i und Ii steigen linear einzigen Wirkstoff-Konzentrationen. III wird bewertet, indem er eine 1:1 Mischung von zwei Medikamenten und Linear titrieren diese Mischung, als sei es ein einzelnes Medikament. Der FIC ist gleich der beobachteten IC50 in der Kombination geteilt durch die erwarteten IC50 zwei einzelne Medikamente. Für die Loewe-Additivität-Modell wird die erwartete IC50 durch die durchschnittliche IC50 die beiden einzigen Medikamente angenähert. Ein FIC-Wert ist 1 für Loewe-Additiv-Paare und niedriger oder höher als 1 bei synergistisch oder antagonistisch Paaren, bzw.2,12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Abbildung 5: Diagonale Methode zur Messung der Dreiwege Arzneimittelinteraktionen. Für jede Checkercube-Assay werden nur die abgebildeten Regionen gemessen. i, Ii und Iii steigen linear einzigen Wirkstoff-Konzentrationen. IV wird gemessen, indem man eine 1:1:1 Mischung aus drei Drogen und Linear titrieren diese Mischung, als wäre es ein einziges Medikament. Die gebrochene inhibitorischen Konzentration entspricht den beobachteten IC50 in der Kombination geteilt durch die erwarteten IC50 drei einzelne Medikamente gegeben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Abbildung 6: Workflow für die Diagonale Methode Protokoll beschriebenen und Einrichtungsdetails für jedes Mikrotestplatte. Die Platte in Tag 4 dargestellte erfolgt in zweifacher Ausfertigung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Abbildung 7: serielle und lineare Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experimente. (A) Vorbereitung der Dosis-Wirkungs-serielle Verdünnung für ein Medikament und entsprechende endgültige Droge-Konzentrationen. E. Coli Zellen werden auf die Platte hinzugefügt; Wachstum wird aufgezeichnet, nachdem 16 h. serielle IC50, gezeigt in Orange, für jedes Medikament ausgewählt wurde, für Gebrauch in den folgenden Tag linear ist Verdünnung Dosis-Wirkungs-Experimente. (B) Vorbereitung der Dosis-Wirkungs-lineare Verdünnung für ein Medikament und entsprechende endgültige Droge-Konzentrationen. E. Coli Zellen werden auf die Platte hinzugefügt; Wachstum wird nach 16 Uhr aufgezeichnet. Für jedes Medikament Medikament die ausgewählten IC50s, die am nächsten Tag verwendet werden Interaktion, die Experimente in Orange angezeigt werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Abbildung 8: Drug Interaction Experimente. Vorbereitung der Interaktion Experimente ist ähnlich wie einzelne Droge lineare Dosis-Antworten, außer dass eine 1:1 oder 1:1:1 Mischung von Medikamenten dient für zwei oder drei Medikament Dosis-Antworten, beziehungsweise. IC50s für jede Dosis-Antwort, abgebildet in Orange, beobachtet werden verwendet, um FIC Ergebnisse berechnen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Abbildung 9: Vertreter experimentieren Ergebnisse. Repräsentative Ergebnisse über das beschriebene Protokoll werden mit Angaben im Haupt-Text angezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Diagonale Methode zur Maßnahme Synergie zwischen beliebig vieler Medikamente

In diesem Protokoll beschreiben wir wie Sie Loewe Additivität basierende Medikament Interaktion Messungen paarweise für und Dreiwege Medikamenten-Kombinationen.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Aufrufe.  Sabanci University. In diesem Protokoll beschreiben wir wie Sie Loewe Additivität basierende Medikament Interaktion Messungen paarweise für und Dreiwege Medikamenten-Kombinationen.

Serie: Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Forschung

Biologie

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) zu Chromatin Protein Dynamics in Living embryonalen Stammzellen Measure

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

Insulin-Injektion und Hämolymphe Extraction die Insulinsensitivität in Adult Measure Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wachstumskegel

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

In vitro-Test an Phosphatidylethanolamin Methyltransferase-Aktivität zu messen

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Hochauflösender Respirometrie, mitochondriale Funktion intakt Beta-Zellen in Anwesenheit von Naturstoffen zu messen

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of thermoregulation in birds across a variety of ecological circumstances. However, few studies characterize the contribution of the feathers alone to thermoregulation. Several previous studies have established methods for measuring the insulation value of animal pelts, but they require destructive sampling methods that are problematic for birds, whose feathers are not distributed evenly across the skin. More information is needed about 1) how the contribution of feathers to thermoregulation varies both across and within species and 2) how feather coats may change over space and time. Reported here is a method for rapidly and directly measuring the thermal performance of feather coats and the skin using dried whole skin specimens, without the need to destroy the skin specimen. This method isolates and measures the thermal gradient across a feather coat in a way that measurements of heat loss and metabolic cost in live birds, which use behavioral and physiological strategies to thermoregulate, cannot. The method employs a thermal camera, which allows the rapid collection of quantitative thermal data to measure heat loss from a stable source through the skin. This protocol can easily be applied to various research questions, is applicable to any avian taxa, and does not require destruction of the skin specimen. Finally, it will further the understanding of the importance of passive thermoregulation in birds by simplifying and accelerating the collection of quantitative data.

This protocol describes the quantification of heat transmission through a flat skinned avian specimen using a thermal camera and hot water bath. The method allows obtaining of quantitative, comparative data about the thermal performance of feather coats across species using dried flat skin specimens.

Verwenden einer Wärmebildkamera zur Messung des Wärmeverlusts durch Vogelfedermäntel

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of ...