Questo lavoro è stato finanziato dalla NIGMS Grant P50GM107618. Gli autori ringraziano Zohar B. Weinstein per i penetranti commenti e suggerimenti sul manoscritto.

Nota: Qualsiasi piccola molecola che inibisce la crescita di batteri e. coli può essere utilizzato per il metodo diagonale. In questo protocollo, levofloxacina (LEV), acido nalidixico (NAL) e penicillina G (PNG) verrà utilizzato come esempio, dal momento che questi farmaci mostrano una sinergia di tre vie saliente. Il flusso di lavoro del presente protocollo è indicato come nella figura 6. Eseguire tutte le operazioni a temperatura ambiente. Utilizzare fresche aliquote di batteri e farmaci ogni giorno. Eseguire l'esperimento sotto livelli di biosicurezza adeguati per e. coli.
1. procedura di preparazione
<ol><li>Preparare il supporto di Luria-Bertani (LB) con l'aggiunta di 25 g di brodo LB a 1 L di acqua distillata e miscelare. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min e archivio media in autoclave a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare scorte di glicerolo di e. coli mescolando volumi uguali di glicerolo sterile 50% e cellule batteriche diluite a OD600 = 1 in libbra di brodo e congelare 150 aliquote µ l in microcentrifuga da 1,5 mL a-80 ° C.</li>
	<li>Sciogliere 20 mg di antibiotici, LEV, NAL e PNG in 1 mL di solfossido dimetilico (DMSO) ciascuna. 10 µ l di soluzione LEV di miscelazione con 990 µ l di DMSO, diluire LEV soluzione 100x a 0,2 µ g/mL. Utilizzare LEV 0,2 mg/mL e 20 mg/mL NAL e PNG nei passaggi procedere.</li>
	<li>Aliquotare 50 µ l di ciascun antibiotico per provette per microcentrifuga da 1,5 mL e congelare a-20 ° C.</li>
	<li>Aliquota di prendere uno 150 µ l di e. coli da-80 ° C. Disgelo.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di brodo di glicerolo di e. coli in 5 mL di LB media in un tubo di cultura 14 mL.</li>
	<li>Agitare le provette in un incubatore a 37 ° C durante la notte a 200 giri/min.</li>
</ol>2. esperimento di Dose-Risposta di diluizione seriale
<ol><li>Prendere un'aliquota delle droghe LEV, NAL e PNG da-20 ° C, lasciarli a temperatura ambiente per 10 min scongelare e preparare diluizioni seriali di questi farmaci.</li>
	<li>Preparare 1100 µ l di sol LB - 10% mescolando 990 µ l di LB media e 110 µ l di solvente (DMSO).</li>
	<li>Preparare 500 µ l di LB - 10% LEV mescolando 450 µ l di LB media e 50 µ l di LEV.</li>
	<li>Vortice LB - 10% sol per 5 s l'impostazione massima. Aggiungere 20 µ l di sol LB - 10% per le prime quattro righe di pozzi in una micropiastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Vortice LEV LB - 10% per 5 s l'impostazione massima. Aggiungere 20 µ l di LEV LB - 10% per il primo pozzo nella riga A.</li>
	<li>Preparare diluizioni seriali per LEV LB - 10% con 20 µ l dal primo bene, aggiungendo all'interno della seconda pipettaggio su e giù per cinque volte. Ripetere questa operazione per tutti i pozzetti in sequenza fino a 11 ben, che finisce con 40 µ l (figura 7A).</li>
	<li>Rimuovere e scartare 20 µ l del contenuto dall'11 Beh, utilizzando una micropipetta.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.3-2.7 per le droghe NAL e PNG con la seconda e terza fila della micropiastra, rispettivamente.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.3-2.7 per la droga LEV nuovamente sulla quarta riga come controllo positivo interno.</li>
	<li>Utilizzando uno spettrofotometro, misurare il OD600 di un 01:10 diluizione della cultura (passi 1.5-1.7).</li>
	<li>Diluire le cellule in 5 mL di LB media per un OD600 di 0,01. Versare in un flacone.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta multicanale, aggiungere 80 µ l delle cellule diluite per le diluizioni seriali di droga preparate al punto 2.4-2.9. Le concentrazioni di farmaco finale in ciascun pozzetto è mostrato nella figura 7A. Sigillare la piastra per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Incubare la piastra per 16 h a 37 ° C.</li>
	<li>Iniziare una nuova coltura batterica da utilizzare nel passaggio 3 (ripetere passaggi 1.5-1.7).</li>
</ol>3. esperimento di diluizione lineare Dose-risposta
<ol><li>Misurare l'assorbanza di600 OD per piastra di dose-risposta di diluizione seriale dal passaggio 2 utilizzando un lettore di piastra (figura 7A giusto) e interpretare i risultati in base alla seguente procedura.</li>
	<li>Normalizzare la crescita dividendo la crescita in tutti i pozzetti con la crescita di nessun controllo di droga per ogni riga e calcolare la crescita percentuale normalizzando OD600a nessuna condizione di droga.</li>
	<li>Per ogni farmaco, individuare i pozzi che hanno l'inibizione della crescita ~ 50% (IC50), indicato in arancione nella figura 7A giusto. Assegnare la concentrazione in questi pozzetti "seriale IC50" per ogni farmaco.</li>
	<li>Disgelare aliquote di droga fresca, preparare 1 mL di sol LB - 10% con LB media e solvente (DMSO) in un rapporto 9:1 e LB - 10% droga mescolando LB media e droga in un rapporto di 9:1, dove la concentrazione del farmaco è 100 x di IC50 seriale di ogni farmaco prima di aggiungere il supporto LB , come indicato al punto 3.3.</li>
	<li>Preparare linearmente crescente dosi di farmaci LEV, NAL e PNG in 11 concentrazioni, con droga LB - 10% e sol LB - 10% a volumi indicati in figura 7B.</li>
	<li>Preparare le dosi linearmente crescente di LEV sulla quarta riga come controllo positivo interno.</li>
	<li>Misurare il OD600 del 01:10 diluizione della cultura avviato nel passaggio 2.14.</li>
	<li>Diluire le cellule in 5 mL di LB media per un OD600 di 0,01. Versare in un flacone.</li>
	<li>Aggiungere 80 µ l delle cellule diluite per le diluizioni lineare droga preparate al punto 3.6 utilizzando una micropipetta multicanale. Le concentrazioni di farmaco finale in ciascun pozzetto è mostrato in figura 7B. Nota: La metà bene in dose-risposta riceverà il IC50 seriale per questo farmaco. Sigillare la piastra per evitare l'evaporazione.</li>
	<li>Incubare la piastra per 16 h a 37 ° C.</li>
	<li>Avviare due colture batteriche fresche da utilizzare nel passaggio 4 (ripetere passaggi 1.5-1.7).</li>
</ol>4. esperimento di interazione di droga diagonale
<ol><li>Misurare l'assorbanza di600 OD per diluizione lineare dose-risposta dal passaggio 3 (figura 7B).</li>
	<li>Per ogni farmaco, scegliere la concentrazione che ha provocato il IC50 e preparare droga LEV, NAL e PNG in 100 x IC50 concentrazioni.</li>
	<li>Scongelare i farmaci freschi, preparare 100 x IC50 per ogni droga e preparare miscele di droga 1:1 in volume di LEV + NAL, LEV + PNG e NAL + PNG e 1: miscela di droga 1:1 in volume di LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Preparare due piastre per esperimenti di interazione della droga come mostrato in Figura 8.</li>
	<li>Misurare il OD600 del 01:10 diluizione delle culture iniziato nel passaggio 3.11.</li>
	<li>Preparare OD600 = 0,01 diluizioni di due culture in due 10 mL di LB media.</li>
	<li>Aggiungere 80 µ l delle cellule dalla cultura 1 e 2 su piastre 1 e 2, rispettivamente. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione. Incubare le piastre per 16 h a 37 ° C.</li>
</ol>5. diagonale droga interazione Spartiti
<ol><li>Misurare l'assorbanza di600 OD interazione farmacologica diagonale sperimentare piatti dal passaggio 4.</li>
	<li>Normalizzare la crescita dividendo la crescita in tutti i pozzetti con la crescita senza controllo droga bene per ogni riga.</li>
	<li>Per ogni riga, individuare la colonna che è più vicina alla IC50, mostrati in arancione nella Figura 8 giusto l'inibizione della crescita. Assegnare IC50 basato sulla concentrazione relativa di droga in questo pozzo.</li>
	<li>Per LEV + NAL, LEV + PNG e NAL + PNG e LEV + NAL + PNG di dose-risposta, è necessario calcolare IC50 previsto calcolando il IC50 dei singoli farmaci in ogni combinazione. Si noti che in media è una semplice approssimazione per il calcolo esatto di IC50 previsto come descritto prima delle12.</li>
	<li>Calcolare punteggi concentrazione inibitoria frazionario (FIC) dividendo il IC50 osservati dal IC50 previsto in ogni combinazione.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'uso di combinazioni di farmaci contro gli agenti patogeni o i tumori è una prospettiva allettante, soprattutto nelle circostanze della pipeline antibiotica essiccazione. Tuttavia, questo potenziale è ostacolato da almeno due difficoltà. La prima difficoltà è il numero astronomico di possibili combinazioni. Ci sono, ad esempio, 4950 combinazioni possibili coppie tra 100 antibiotici. Tutte le possibili combinazioni tra 100 antibiotici (2100) è dello stesso ordine di grandezza con il numero di batteri sulla terra (~ 1030). Come predire combinazioni fortemente sinergiche tra queste possibilità è stata oggetto di numerosi studi computazionali. La seconda difficoltà è la misurazione delle interazioni farmacologiche di alto ordine. Considera che una piattaforma computazionale può suggerire che una certa combinazione di 10-droga è fortemente sinergica contro un certo agente patogeno. Metodi tradizionali per testare le interazioni farmacologiche è troppo costoso per verificare o smentire questa ipotesi, pertanto lo studio della sinergia tra molti farmaci è stato fuori dai confini della ricerca scientifica. Il metodo diagonale, che è stato inizialmente proposto quasi 30 anni fa ed è stato utilizzato in alcune schermate di sinergia recenti forniscono una solida base per il primo problema, consentendo l'analisi dell'interazione tra molte coppie. Risolve il secondo problema di un campionamento informativo delle analisi tradizionali e consente lo studio delle interazioni farmacologiche di alto ordine.
D'importanza, notiamo che il nostro protocollo utilizza un dosaggio lineare per misurazioni di interazione della droga, per fornire la sensibilità per la rilevazione anche interazioni deboli. Stabilire l'intervallo di concentrazione giusta per dosaggio lineare è un compito impegnativo. Eseguendo prima una diluizione seriale, facciamo una decisione informata circa lo spazio di ricerca per il dosaggio lineare. Tuttavia, il protocollo può essere modificato per utilizzare 2 volte o più diluizioni seriali per interazione test antidroga. Tale modifica sarebbe ridurre il tempo di esperimento e consentire la sperimentazione di più interazioni; Tuttavia, avrebbe sensibilità per rilevare interazioni solo fortemente sinergiche o antagonistiche.
Il protocollo che abbiamo descritto Mostra la misurazione delle interazioni di coppie o a tre vie. Un aspetto critico del protocollo è che singoli agenti sono nello stesso piatto come la combinazione, per minimizzare la distorsione a causa di variazioni di piastra. Di conseguenza, il protocollo può essere regolato per misurare le interazioni fino a 7 vie combinazioni di semplici modifiche. Combinazioni di più di 7 farmaci richiederà più di una micropiastra da 96 pozzetti e considerazioni aggiuntive devono essere prese per garantire l'integrazione di dati corretti, come replica inter-supporto.
Una notevole limitazione del metodo diagonale è la limitazione che ogni droga nel dosaggio deve inibire il fenotipo di interesse. Di conseguenza, il metodo diagonale non è utile per comprendere le interazioni tra agenti attivi e inerti coadiuvanti. Tali interazioni 'potenziamento' potrebbero essere studiati sotto modelli alternativi come modelli Bliss o più alto singolo agente.
Una considerazione importante per l'analisi di interazioni farmacologiche di ordine superiore è la scelta del modello null per il "IC50 previsto." Quando si combinano due farmaci, effetto di combinazione può essere paragonato solo agli effetti singola droga. Quando tre farmaci vengono combinati, effetto di combinazione può essere paragonato agli effetti singoli o coppie effetti. Ad esempio, se pairwise tutte le combinazioni di tre farmaci sono sinergiche, quindi si può supporre che queste droghe mostrerà una sinergia di tre vie. Deviazione di un'interazione tre vie da cosa ci si aspetta da interazioni pairwise è stato recentemente ribattezzato "interazione emergente"16,17. Per semplicità, il nostro protocollo descrive la misura di triplice combinazione "netto l'interazione," che definisce il modello null come effetti dei singoli farmaci. Tuttavia, i dati ottenuti dal protocollo possono anche essere utilizzati per calcolare l'interazione emergente della combinazione di tre vie. Nella nostra analisi, abbiamo definito il IC50 previsto della combinazione tre vie come la media del singolo farmaco IC50s. In alternativa, il IC50 previsto può essere definita come la media di IC50s di combinazioni pairwise (~1.1-1.2). Quando il IC50 osservata è divisa da questa alternativa IC50 previsto, la FIC ottenute fornisce la FIC emergente per la combinazione di tre vie, come descritto in precedenza12. Questa considerazione rivela che LEV + NAL + PNG è più sinergica rispetto a quanto ci si aspetterebbe dalle interazioni pairwise tra tre farmaci, dimostrante che LEV + NAL + PNG ha sinergia emergente.

Combinazioni di farmaci possono presentare effetto sorprendentemente alta o bassa su un fenotipo dato gli effetti dei farmaci costituenti, corrispondente alle interazioni della droga sinergici o antagonistici, rispettivamente1,2,3. L'uso di combinazioni sinergiche può permettere dose-escalation per aumento di efficacia e riduzione della dose per effetto collaterale di rilievo. Trattamenti di combinazione possono anche applicare più battute d'arresto al macchinario cellulare, bloccando così il potenziale evolutivo fuggire meccanismi di resistenza4. Di conseguenza, combinazioni di tre o più farmaci sono abitualmente utilizzati in agente patogeno o cancro trattamento5.
Sinergia e antagonismo sono definiti da un confronto tra l'effetto osservato di una combinazione contro un effetto previsto dato diversi effetti della droga. Tra i modelli per le interazioni di droga, additività di Loewe è la più severa e ha un modello ben definito null (Figura 1)6, e l'interazione di sinergia/antagonismo dedotto è indipendente dalla concentrazione di farmaco utilizzata 6 , 7. Tuttavia, il modello di Loewe è sperimentalmente costoso anche per un test pairwise interazione. Analisi di interazione farmaco tradizionalmente costituiscono una matrice 2D di combinazioni di farmaci concentrazione (un saggio della scacchiera) (Figura 2). 5 dosi sono utilizzate per ogni farmaco, se 25 combinazioni sono necessari, corrispondente ad una metà di una micropiastra se gli esperimenti vengono condotti in replica. Il costo di questo approccio vieta misura sinergia dal modello di additività di Loewe per combinazioni di multi-farmaci (Figura 3). Ad esempio, per testare un'interazione di 10 vie, metodi tradizionali richiederebbe più di 100 mila micropiastre, blocco misura sperimentale delle sinergie di alto ordine dal modello di additività Loewe rigoroso, ben teorizzato e indipendente dalla concentrazione 8.
Gli attuali trattamenti clinici utilizzano solo una frazione di combinazioni di farmaci possibili. Ad esempio, il trattamento standard della tubercolosi attiva è una combinazione di tre antibiotici. Ci sono circa 20 antibiotici usati nel trattamento di Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Ci sono combinazioni di 3 vie possibili 1140 tra 20 farmaci, ciascuno con la possibilità di avere una forte sinergia contro Mtb. Poiché non c'è nessun metodo economico per misurare le interazioni farmacologiche tra molti farmaci, combinazioni sinergiche potenzialmente salva-vita rimangono non testati.
Qui, descriviamo un protocollo semplice per misurare le interazioni farmacologiche pairwise e tre vie campionando soltanto la diagonale di un dosaggio di scacchiera (nella figura 4 e Figura 5). Il concetto sottostante di campionamento la diagonale di un esperimento della scacchiera è stato teorizzato da Berenbaum nel suo lavoro seminale in 19789. Eppure, questo approccio è stato applicato solo recentemente al farmaco sinergia schermi10,11,12. Vi presentiamo il nostro protocollo con Escherichia coli (e. coli) ed il fenotipo di crescita. Tuttavia, notiamo che il protocollo è indipendente dalla specie biologiche e il fenotipo di interesse e quindi può essere applicato per la misurazione della sinergia di alto ordine droga in altri contesti biologici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

Una combinazione sinergica di droga ha un'efficacia superiore rispetto agli effetti dei singoli farmaci. Saggi di scacchiera, dove i farmaci vengono combinati in molte dosi, consentono sensibile misura di interazioni farmacologiche. Tuttavia, queste analisi sono costose e non scala bene per misurare l'interazione tra i molti farmaci. Parecchi studi recenti hanno segnalato misurazioni di interazione di droga utilizzando un campionamento diagonale del dosaggio tradizionale scacchiera. Questa metodologia alternativa notevolmente riduce il costo degli esperimenti di interazione della droga e permette la misura di interazione per le combinazioni con molti farmaci. Qui, descriviamo un protocollo per misurare le tre interazioni coppie e un tre vie interazione tra tre antibiotici in duplice copia, in cinque giorni, usando solo tre a 96 pozzetti e normale attrezzatura da laboratorio. Presentiamo i risultati rappresentativi dimostrano che la combinazione di tre-antibiotico di levofloxacina + acido nalidixico + penicillina G è sinergica. Il nostro protocollo di scale per misurare le interazioni tra i molti farmaci e in altri contesti biologici, permettendo per schermi efficienti per le sinergie della multi-droga contro agenti patogeni e tumori.

Precedentemente, abbiamo segnalato il pairwise interazioni tra i tre farmaci: LEV, NAL e PNG basata su test nelle analisi miniaturizzati scacchiera, dove i due farmaci sono stati combinati in una matrice 4 x 413,14. Mentre NAL e LEV erano sinergici, PNG è stato segnalato per essere antagonistico con sia LEV e NAL13,14. Qui, abbiamo verificato queste interazioni pairwise e misurata l'interazione di tre vie tra questi tre farmaci usando un'analisi di diagonale. I nostri risultati dimostrano che LEV + NAL + PNG è una combinazione sinergica di antibiotica 3 vie. Rappresentazioni schematiche per i risultati delle sezioni individuali procedura sperimentale sono stati dati sul lato destro della Figura 7 e Figura 8. Qui, presentiamo e interpretare risultati rappresentativi crudi da tre letture di piastra, che sono riportati nella Figura 9. La lettura della piastra superiore corrisponde alla diluizione seriale e lineare esperimenti condotti nei passaggi 2 e 3. Le letture di piastra inferiore due sono piastre duplicate interazione condotti nel passaggio 4.
I dati grezzi in Figura 9 dimostra che crescita superiore è intorno a 0,55, ma c'è una densità ottica 0.05 del supporto stesso, come osservato nel OD600 delle concentrazioni di farmaco alta dove non c'è nessuna crescita. Di conseguenza, definiamo IC50 come (0.55-0.05)/2 = 0,25. Per ogni dose-risposta, i pozzi che si trova più vicino a questo valore vengono visualizzati con l'arancio.
La metà superiore della Figura 9A Mostra i risultati del passaggio 2, esperimento seriale dose-risposta. I pozzetti di IC50 per LEV è alle repliche di 10 in due colonne, che corrispondono a 4 ng/mL. Il IC50 per NAL e PNG sono a 3 µ g/mL e 25 µ g/mL, rispettivamente. Queste concentrazioni corrispondono alla concentrazione di 1 x mostrato in figura 7B. La metà inferiore della figura 9B Mostra i risultati dal passaggio 3, esperimenti di dose-risposta lineare. LEV, NAL e IC50 di PNG si trovano a 0,4 x, x 0,8 e 1,2 x, rispettivamente. Queste concentrazioni sono assegnate come 1 X IC50 per il passaggio 4.
Due piastre corrispondenti a replicare due esperimenti sono mostrati in figura 9B, dove il IC50 pozzi sono mostrati con l'arancio. In piastra 1, tutte le singole droghe hanno loro IC50 alla concentrazione di 1 x. Il IC50 previsto per la combinazione di coppie o a tre vie viene calcolata la media aritmetica delle droghe costituente, rendendo previsto IC50 per concentrazione di 1x anche tutte le combinazioni. In lamiera di 2 LEV e PNG hanno loro IC50 alla concentrazione di 1 x, ma NAL IC50 è a 1.2 x. Il IC50 previsto per ogni combinazione è definita utilizzando la media aritmetica di questi valori di IC50. Ad esempio, il IC50 previsto per LEV + NAL e NAL + PNG è 1.1 x. L'interazione della droga Punteggio (FIC) per ogni combinazione è calcolato dividendo osservato IC50 con IC50 previsto, come mostrato sul lato destro delle piastre. Ispezione dei punteggi delle due piastre FIC dimostra che LEV + NAL e LEV + NAL + PNG sono sinergici, mentre LEV + PNG e NAL + PNG sono antagonisti. FIC punteggi ottenuti nelle due piastre sono d'accordo, sostenendo l'affidabilità del protocollo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Figura 1: Null definizione modello per modello di interazione di Loewe additività droga. Due 5x5 matrici su una micropiastra, dove droga A è aumentato linearmente in un asse come mostrato a sinistra, e una concentrazione superiore di droga inibisce un fenotipo quantificabile (in alto a destra). L'aggiunta di queste matrici è indicata nel mezzo, dove le linee che collegano equipotenti droga un concentrazioni in ogni singola droga hanno la stessa concentrazione come farmaco A. Quando le cellule vengono aggiunti su questa «scacchiera» concentrazione di combinazioni di farmaci, si prevede che il fenotipo registrato su questa linea sarà equivalente per i pozzi che si connette. In questo esperimento di interazione di droga self-self, il isobole raffigurante un fenotipo (indicato con una linea verde tratteggiata) dovrebbe essere lineare, definizione del modello di additività null. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Figura 2: interazioni farmacologiche Pairwise secondo il modello di interazione di Loewe additività droga. Quando due farmaci sono combinati in un'analisi della scacchiera come in Figura 1, il contorno di isophenotypic osservato può essere diritta, convesso o concavo. A destra, isophenotypic possibili contorni (linee tratteggiate verdi) si sovrappongono sulla scacchiera saggi. Combinazioni di farmaci con dritto isophenotypic contorni sono Loewe-additivi, come i contorni non sono diversi da un'interazione della droga di auto-self, ovvero Loewe-additivo per definizione. Quando il contorno di isophenotypic è significativamente concavo o convesso, la combinazione è sinergico o antagonistico, rispettivamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Figura 3: interazioni farmacologiche tre vie secondo il modello di interazione di Loewe additività droga. Simile al dosaggio della scacchiera per interazioni pairwise, tre-farmaci vengono combinati in una griglia 3D (un "checkercube"), dove ogni droga è aumentato linearmente in un asse. Se i tre farmaci erano identici, la superficie di isophenotypic dovrebbe essere piatto, definendo l'additività per tre combinazioni di farmaci. Se la superficie è più concavo o convesso rispetto a questo modello null Loewe-additivo, combinazioni di farmaci sono sinergici o antagonistici, rispettivamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Figura 4: metodo diagonale per misurare interazioni farmacologiche pairwise. Per ogni dosaggio della scacchiera, si misurano solo le regioni mostrate in rettangoli rosso magenta. i e ii linearmente stiamo aumentando le concentrazioni di farmaco singolo. III è valutata facendo una miscela 1:1 dei due farmaci e linearmente titolazione questa miscela come se fosse una singola droga. La FIC è uguale all'IC50 osservati nella combinazione divisa per il IC50 previsto di due singoli farmaci. Per il modello di additività di Loewe, il IC50 previsto è approssimata dal IC50 medio dei due singoli farmaci. Un valore FIC è 1 per le coppie di Loewe-additivo ed è inferiore o superiore a 1 per coppie sinergiche o antagonistiche, rispettivamente2,12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Figura 5: metodo diagonale per misurare le interazioni farmacologiche di tre vie. Per ogni dosaggio checkercube, solo le regioni indicate sono misurate. i, ii e iii linearmente stiamo aumentando le concentrazioni di farmaco singolo. IV viene misurata facendo un 1:1:1 miscela di tre farmaci e linearmente titolazione questa miscela come se si trattasse di una singola droga. La concentrazione inibitoria frazionario è uguale all'osservato IC50 nella combinazione divisa per la IC50 previsto dato tre singoli farmaci. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Figura 6: flusso di lavoro per il protocollo metodo diagonale descritto nel presente documento e i dettagli di installazione per ogni micropiastra. La piastra mostrata nel giorno 4 è condotta in duplicato. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Figura 7: esperimenti di dose-risposta di diluizione seriale e lineari. (A) preparazione della diluizione seriale dose-risposta per una droga e le corrispondenti concentrazioni di farmaco finale. Cellule di e. coli vengono aggiunti alla piastra; crescita è registrato dopo 16 h. seriale IC50, arancione, è selezionato per ogni droga per uso nel giorno seguente di lineare esperimenti di dose-risposta di diluizione. (B) preparazione della diluizione lineare dose-risposta per una droga e le corrispondenti concentrazioni di farmaco finale. Cellule di e. coli vengono aggiunti alla piastra; crescita è registrato dopo le 16h. Per ogni farmaco, il IC50s selezionati che verrà utilizzato nel giorno seguente droga interazione esperimenti sono mostrati in arancione. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Figura 8: esperimenti di interazione della droga. Preparazione di esperimenti di interazione è simile a singola droga lineare dose-risposte, tranne che un 1:1 o 1:1:1 miscela di farmaci viene utilizzato per due o tre farmaco dose-risposta, rispettivamente. Osservato IC50s per ogni dose-risposta, raffigurato in arancione, vengono utilizzati per calcolare i punteggi FIC. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Figura 9: rappresentante sperimentare risultati. Risultati rappresentativi ottenuti utilizzando il protocollo descritto vengono visualizzati, con dettagli forniti nel testo principale. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Metodo diagonale misura sinergia tra un qualsiasi numero di farmaci

In questo protocollo, descriviamo come fare Loewe misurazioni di interazione del farmaco a base di additività per pairwise e combinazioni di farmaci a tre vie.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Sabanci University. In questo protocollo, descriviamo come fare Loewe misurazioni di interazione del farmaco a base di additività per pairwise e combinazioni di farmaci a tre vie.

Video: Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Ricerca

Biologia

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Fotodecolorazione saggi (FRAP e FLIP) per misurare la dinamica delle proteine ​​della cromatina in Living cellule staminali embrionali

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

L&#39;insulina per iniezione ed estrazione emolinfa per misurare la sensibilità all&#39;insulina nei adulti Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; coni di crescita

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Uso di dispositivi microfluidici misurare la durata della vita e cellulare fenotipi in singole cellule di lievito in erba

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of thermoregulation in birds across a variety of ecological circumstances. However, few studies characterize the contribution of the feathers alone to thermoregulation. Several previous studies have established methods for measuring the insulation value of animal pelts, but they require destructive sampling methods that are problematic for birds, whose feathers are not distributed evenly across the skin. More information is needed about 1) how the contribution of feathers to thermoregulation varies both across and within species and 2) how feather coats may change over space and time. Reported here is a method for rapidly and directly measuring the thermal performance of feather coats and the skin using dried whole skin specimens, without the need to destroy the skin specimen. This method isolates and measures the thermal gradient across a feather coat in a way that measurements of heat loss and metabolic cost in live birds, which use behavioral and physiological strategies to thermoregulate, cannot. The method employs a thermal camera, which allows the rapid collection of quantitative thermal data to measure heat loss from a stable source through the skin. This protocol can easily be applied to various research questions, is applicable to any avian taxa, and does not require destruction of the skin specimen. Finally, it will further the understanding of the importance of passive thermoregulation in birds by simplifying and accelerating the collection of quantitative data.

This protocol describes the quantification of heat transmission through a flat skinned avian specimen using a thermal camera and hot water bath. The method allows obtaining of quantitative, comparative data about the thermal performance of feather coats across species using dried flat skin specimens.

Utilizzo di una termocamera per misurare la perdita di calore attraverso i cappotti di piume di uccello

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of ...