この作品は、日の出グラント P50GM107618 によって賄われていた。著者は、洞察力に富んだコメントや原稿の提案ありがとうゾハー B. ワインスタイン。

注:エシェリヒア属大腸菌の細菌の成長を阻害する小分子は、対角線論法に使用できます。レボフロキサシン (レフ) は、このプロトコルでナリジクス酸 (NAL) とペニシリン G (PNG) される例として、これらの薬は、顕著な 3 ウェイの相乗効果を示すので。このプロトコルのワークフローは、図 6に表示されます。室温ですべての手順を実行します。毎日細菌および薬の新しい因数を使用します。エシェリヒア属大腸菌にふさわしいバイオ セーフティ レベルの下で実験を実行します。
1. 準備の手順
<ol><li>流体培養基 LB の 25 g を蒸留水 1 L に追加することによってルリア ベルターニカミラ (LB) 媒体を準備し、ミックスします。オートクレーブで 121 ° C、15 分およびストア室温でオートクレーブ メディア。</li>
	<li>滅菌 50% グリセロールと OD600に希釈の細菌のセルの平等なボリュームを混合することによって大腸菌グリセロールを準備 = 流体培養基 LB の 1 と-80 ° C で 1.5 mL 遠心チューブに 150 μ 因数を凍結</li>
	<li>抗生物質、レフ、NAL、ジメチルスルホキシド (DMSO) 各 1 mL に PNG の 20 mg を溶解します。DMSO の 990 μ L でレフ溶液 10 μ L を混合することによってレフ ソリューション 100 x 0.2 μ g/mL を希釈します。0.2 mg/mL レフ、および 20 mg/mL NAL と PNG 手続の手順で使用します。</li>
	<li>-20 ° C で凍結し、1.5 mL 容マイクロ チューブ各抗生物質の 50 μ L 分注</li>
	<li>-80 ° C からエシェリヒア属大腸菌の取る 1 つ 150 μ 因数雪解け。</li>
	<li>14 mL 培養管の LB 媒体の 5 mL のエシェリヒア属大腸菌グリセロール ストックの 100 μ L を追加します。</li>
	<li>一晩で 200 rpm 37 ° C の定温器でチューブを振る。</li>
</ol>2. シリアル希釈用量反応実験
<ol><li>-20 ° C からレフ、NAL と PNG の薬の 1 つの因数を取る、常温で解凍し、これらの薬のシリアル希薄の準備 10 分おきます。</li>
	<li>LB 媒体の 990 μ L を混合することによってポンド-10% ソルの 1100 μ L と 110 μ L の溶媒 (DMSO) を準備します。</li>
	<li>LB 媒体の 450 μ L を混合することによってポンド-10% レフの 500 μ L とレフの 50 μ L を用意します。</li>
	<li>5 渦ポンド-10% ソル最高の設定で s。96 ウェル マイクロ プレートでの井戸の最初の 4 行に LB-10% ソルの 20 μ L を追加します。</li>
	<li>渦 5 ポンド 10% レフ s を最大に設定します。A. の行の最初の井戸の中に LB-10% レフの 20 μ L を追加します。</li>
	<li>LB-10% レフ 2 倍連続希釈を準備するには、2 番目だけでなく、上下に 5 回ピペッティングに追加する最初の井戸から 20 μ L を取ってください。この手順を繰り返しますすべての井戸の順番に 40 μ L (図 7 a) で終わるも、11 日まで。</li>
	<li>削除し、マイクロ ピペットを使用しても、11 日からコンテンツの 20 μ L を破棄します。</li>
	<li>NAL とそれぞれ、マイクロ プレートの 2 番目と 3 番目の行を使用して PNG 薬手順 2.3 2.7.</li>
	<li>4 行目に再び薬物レフ内部肯定的な制御として手順 2.3 2.7 を繰り返します。</li>
	<li>、分光光度計を使用して測定、1:10 の OD600 (手順 1.5 1.7) 文化の希薄化。</li>
	<li>0.01 外径600 LB 媒体の 5 mL の細胞を希釈します。貯水池に注ぐ。</li>
	<li>マルチ チャンネル ピペットを使用して、ステップ 2.4 2.9 の準備薬シリアル希薄に希薄化後の細胞の 80 μ L を追加します。図 7Aの各ウェルに最終的な薬物濃度が表示されます。蒸発を防ぐためにプレートをシールします。</li>
	<li>37 ° C で 16 時間プレートを孵化させなさい</li>
	<li>手順 3 (繰り返し手順 1.5 1.7) で使用する新しい細菌の培養を開始します。</li>
</ol>3. 線形希釈用量反応実験
<ol><li>ステップ プレート リーダー (図 7A 右) を使用して 2 から連続希釈用量反応プレートの外径600の吸光度を測定し、以下の手順に基づいて結果を解釈します。</li>
	<li>各行の薬物コントロールはなしでの各ウェルに成長を割って成長を正常化し、薬物のない状態に外径600を正規化することで成長の割合を計算します。</li>
	<li>それぞれの薬の 〜 50% 増殖阻害 (IC50)、図 7A 右にオレンジで示されている井戸を見つけてください。「シリアル IC50」、それぞれの薬としてこれらの井戸の濃度を割り当てます。</li>
	<li>新鮮な薬物因数を解凍、LB 媒体および薬物の濃度は LB メディアを追加する前に各薬剤のシリアル IC50 の 100 倍を 9:1 の比率で薬剤を混合することによって LB 媒体、溶剤 (DMSO) 9:1 の比率で LB-10% 薬剤を混合することによってポンド-10% ソルの 1 mL を準備、ステップ 3.3 で選ばれました。</li>
	<li>LB-10% 薬物と図 7 bに示すようにボリュームの LB-10% ソルを混ぜてレフ、NAL と PNG の薬 11 濃度の漸増投与を準備します。</li>
	<li>内部の肯定的な制御として 4 番目の行のレフの漸増投与を準備します。</li>
	<li>測定、1:10 の OD600 2.14 の手順で文化の希薄化を開始。</li>
	<li>0.01 外径600 LB 媒体の 5 mL の細胞を希釈します。貯水池に注ぐ。</li>
	<li>3.6 マルチ チャンネル ピペットを使用して準備した薬の線形希釈に希釈した細胞の 80 μ L を追加します。図 7 bに各ウェルに最終的な薬物濃度を示します。 注: も用量反応の中間は、この薬のシリアルの IC50 を受け取ります。蒸発を防ぐためにプレートをシールします。</li>
	<li>37 ° C で 16 時間プレートを孵化させなさい</li>
	<li>手順 4 (繰り返し手順 1.5 1.7) で使用する 2 つの新鮮な細菌文化を開始します。</li>
</ol>4. 斜め薬物相互作用実験
<ol><li>手順 3 (図 7 b) から線形希釈用量応答を OD600吸光度を測定します。</li>
	<li>各薬物濃度 IC50 で起因したおよび準備を行う薬 100 x IC50 濃度のレフ、NAL、PNG を選択します。</li>
	<li>新鮮な薬剤を解凍、100 を準備ごと x IC50 薬し、レフ + NAL、レフ + PNG と NAL + PNG および 1 の量に 1:1 薬物混合物の準備: レフ + NAL + PNG の容積 1:1 薬物混合物。</li>
	<li>図 8に示すように、薬物相互作用実験の 2 つのプレートを準備します。</li>
	<li>測定、1:10 の OD600文化の希薄化は、3.11 の手順で開始します。</li>
	<li>準備外径600 mL の LB 培地 2 つ 10 で 2 つの文化の 0.01 の希薄を =。</li>
	<li>1 と 1 と 2、プレートに 2 の文化から細胞の 80 μ L をそれぞれ追加します。蒸発を防ぐためにプレートをシールします。37 ° C で 16 時間の版を孵化させなさい</li>
</ol>5. 斜め薬物相互作用スコア
<ol><li>斜めの薬物相互作用の OD600の吸光度を測定は、ステップ 4 からプレートを試してみてください。</li>
	<li>行ごとによく薬物コントロールはなしでの各ウェルに成長を割って成長を正規化します。</li>
	<li>各ローに対して、成長阻害 IC50、右図 8にオレンジ色の表示に最も近いのある列を見つけます。この井戸で薬剤の相対的な濃度に基づく IC50 を割り当てます。</li>
	<li>レフ + NAL、レフ + PNG NAL + PNG とレフ + NAL + PNG の線量応答の組み合わせごとに単一の薬物の IC50 を平均することによって予想される IC50 を計算します。平均化は正確な予想される IC50 計算の簡単な近似12前述したよう、注意してください。</li>
	<li>各組み合わせで予想される IC50 によって観測された IC50 で割って小数阻害濃度 (FIC) スコアを計算します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

病原体や腫瘍に対する薬剤の組合せの使用は、特に乾燥抗生物質パイプラインの状況の下で、魅力的な見通しです。ただし、この可能性は、少なくとも 2 つの困難によって妨げられています。最初の難関は、可能な組み合わせの天文学的数字です。たとえば、100 抗生物質のうち 4950 の可能なペアの組み合わせがあります。100 の抗生物質間のすべての組み合わせ (2100) 地球のバクテリアの数は、同程度の大きさに (10 ~30)。これらの可能性の間で強く相乗的な組み合わせを予測する方法について多くの研究の対象とされています。2 番目の難易度上位の薬物相互作用の測定であります。計算プラットフォームが特定 10 薬の組み合わせは特定の病原体に対して強く相乗効果を提案するかもしれないことを検討してください。薬物相互作用をテストする従来の方法は確認またはこの仮説に反論するのにはコストがかかりすぎる、したがって多くの薬剤間の相乗効果の研究は、科学的な調査の境界の外されています。斜めに、ほぼ 30 年前初めて提案されたいくつかの最近の相乗効果画面で使用されたメソッドは、多くのペア間の相互作用のテストにより最初の問題のための強力な基盤を提供します。伝統的な試金の有益なサンプリングで 2 番目の問題を解決でき、上位の薬物相互作用の研究。
我々 のプロトコルを使用する薬物相互作用測定のための線形投与も弱い相互作用を検出する感度を提供するを重要なことに注意してください。線形投与の右側の濃度範囲を確立するやりがいのある仕事です。シリアル希薄を実行する最初と、線形投与のための探索空間の知識のある決定を行います。ただし、倍を使用するプロトコルを変更ことができます。 またはの高いシリアル希薄薬物相互作用試験。このような変更は実験時間を短縮し、; より多くの相互作用をテストできるようにただし、のみ強く相乗的あるいは敵対的相互作用を検出する感度があります。
我々 が説明されたプロトコルは、ペアまたは 3 ウェイの相互作用の測定を示しています。プロトコルの重要な側面は、単一のエージェントがプレートの変動によるバイアスを最小限に抑えるための組み合わせとして同じプレート上にあります。したがって、プロトコルは、些細な変更で 7 方法の組み合わせまでの相互作用を測定する調整できます。以上 7 薬の組み合わせが 2 つ以上の 96 ウェル マイクロ プレートを必要し、追加の考慮事項は、プレート間の複製などの適切なデータ統合のために取られなければなりません。
対角線論法の顕著な制限は、各薬物アッセイの必要があります興味の表現型を阻害する制限です。したがって、対角線論法は活性剤及び不活性アジュバント間の相互作用を理解するために便利ではありません。'増強' そのような相互作用は、至福または最高の単一のエージェント モデルなど代替モデルの下で学ぶことができます。
高次薬物相互作用の分析のための重要な考慮事項は、「予想 IC50」null モデル選択2 つの薬を組み合わせる場合併用の効果は単一の薬剤効果にのみ比較できます。3 つの薬剤を組み合わせる場合は、単一のエフェクトや対効果を併用の効果を比較できます。たとえば、3 つの薬のすべてのペアの組み合わせは相乗効果、する場合それが期待するこれらの薬が 3 ウェイの相乗効果を示します。「創発的相互作用」16,17、ペアの相互作用から期待されるものから三者相互作用の偏差によって最近と呼ばれていますいます。わかりやすくするため、我々 のプロトコルは、3 ウェイの組み合わせの net 相互作用"の"単一の薬剤効果として null モデルを定義する測定について説明します。ただし、プロトコルから得られたデータは、3 ウェイの組み合わせの創発的相互作用を計算する使用も可能性があります。我々 の分析で IC50s の単一の薬剤の平均としての 3 ウェイの組み合わせ予想される IC50 を定義します。また、予想される IC50 は、ペアの組み合わせ (~1.1-1.2) の IC50s の平均として定義できます。この代替の予想される IC50 によって観測された IC50 を分割すると、得られた FIC は前述12として、3 ウェイの組み合わせで緊急 FIC を提供します。この考察は、レフ + NAL + PNG は、レフ + NAL + PNG が創発的相乗効果であることを示す 3 つの薬剤の間で一対の相互作用から期待されるものよりもより相乗、明らかにします。

薬剤の組み合わせは、驚くほどハイまたはローに及ぼす相乗的あるいは敵対的薬物相互作用、それぞれ1,2,3に対応する成分の薬剤の効果を与えられた表現型を表わすかもしれない。相乗的な組み合わせの使用は、有効性の増加のための増量と副作用救済のため線量低減可能です。組み合わせ治療も細胞機械装置、それにより抵抗4潜在的な進化のエスケープ機構をブロックする複数挫折を適用可能性があります。したがって、3 つ以上の薬剤の組み合わせは、病原体や癌治療5で日常的に使用されます。
拮抗作用との相乗効果は、個々 の薬剤の効果を与えられて期待される効果と組み合わせの観察された効果の比較によって定義されます。薬物相互作用のなかでは、ロエベ加法では最も厳しい、明確に定義された null モデル(図 1)6と推論されるシナジー/拮抗作用は使用薬物濃度に依存しません。6,7します。 しかし、ロエベ モデルは実験的ペア相互作用実験のため高価な。薬物濃度の組み合わせ (チェッカー ボードの試金) の 2次元マトリックスの伝統的薬物相互作用アッセイを構成する(図 2)。5 用量が、それぞれの薬に使用される場合は 25 の組み合わせが必要で、1 つに対応する複製の実験を行った場合のマイクロ プレートの半分。このアプローチのコストは、多剤の組み合わせ(図 3)ロエベ加法モデルによる相乗効果測定を禁止しています。たとえば、10 方向の相互作用をテストするため従来の方法が厳しい、よく理論および濃度に依存しないロエベ加法モデルによる高次相乗効果の計測実験がなければ、以上 10 万マイクロ プレートに必要8。
現在治療は利用可能な薬剤の組み合わせのほんの一部です。たとえば、活動性の結核の標準治療は 3 つの抗生物質の組み合わせです。マイコバクテリウムの結核(Mtb) の治療に使用されて約 20 抗生物質があります。1140 3 ウェイ組み合わせ中で 20 の薬、それぞれMtbに対して強い相乗効果を持っている可能性があります。多くの薬物の間で薬物相互作用を測定するコスト効果の高い方法がずっとない、潜在的に命を救う相乗的組み合わせまま未検証です。
ここでは、チェッカー ボードの試金(図 4の対角線だけをサンプリングすることによってペアと 3 ウェイの薬物相互作用を測定するための単純なプロトコルについて述べると図 5)。チェッカー ボードの実験の対角線をサンプリングの基本的な概念はだった 1978年9の彼の精液の仕事の Berenbaum によって理論化。まだ、このアプローチは最近薬剤の相乗効果画面10、11,12に適用されています。私たちプロトコルを提案するエシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌) と成長表現型。しかし、我々 は、プロトコルが生物種および関心の表現型は独立した、したがって、他の生物学的文脈で上位薬相乗効果の測定に適用される可能性があります注意してください。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

相乗効果薬の組み合わせは、個々 の薬剤の効果と比較して高い治療効果をが。市松模様の試金、多くの用量で薬を結合し、薬物相互作用の高感度測定を許可します。ただし、これらの試金は高価であり、よく多くの薬剤間の相互作用を測定するスケールは変更されません。いくつかの最近の研究は、伝統的な市松模様の試金の斜めサンプリングを用いた薬物相互作用の測定を報告しています。この代替方法論は大きく薬物相互作用実験のコストを削減し、多くの薬剤の組み合わせの相互作用測定が可能します。ここでは、我々 だけの 3 つの 96 ウェル マイクロ プレートと標準的な実験装置を使用して 3 対相互作用および 5 日に、重複での 3 つの抗生物質間 1 つ 3 ウェイの相互作用を測定するためのプロトコルをについて説明します。ペニシリン G + ナリジクス酸レボフロキサシン 3 抗生物質の組み合わせが相乗効果を示す代表的な結果を提案します。我々 のプロトコルは、多くの薬剤の中で、病原体や腫瘍に対する多剤の相乗効果で効率的な画面を可能にする、他の生物学的文脈での相互作用を測定するスケール アップ。

以前は、3 つの薬剤の間で一対の相互作用を報告した: レフ、NAL と PNG 小型チェッカー ボードの試金、4 x 4 行列13,14の 2 つの薬を砕きましたテストに基づきます。NAL とレフ相乗効果でしたが、PNG はレフと NAL13,14と拮抗すると報じられました。ここでは、これらのペアの相互作用を検証した、斜めの試金を使用してこれらの 3 つの薬剤の間で三者相互作用を測定します。我々 の結果は、レフ + NAL + PNG が相乗 3 ウェイの抗生物質の組み合わせであることを示します。図 7の右側にある個々 の実験手順セクションの結果を図式的な表示を与えられた、 図 8。ここでは、図 9で与えられる 3 つのプレート測定値から代表の raw の結果を解釈します。トップ プレートの読書は、ステップ 2 および 3 のシリアルおよび線形希釈実験に対応します。下 2 つ板測定値は、ステップ 4 において重複する相互作用のプレートです。
図 9で raw データ示します上の成長は 0.55、周りが、メディアそのものの 0.05 光学密度がある高い薬剤濃度の OD600で観測された成長がないです。したがって、我々 は定義として IC50 (0.55-0.05)/2 = 0.25。各用量反応のこの値に近い井戸はオレンジで表示されます。
図 9 aの上半分は、手順 2、シリアルの用量-反応実験からの結果を示しています。レフの IC50 井戸は列 2 の 10 複製 4 ng/mL に対応します。NAL と PNG の IC50 は、3 μ g/mL で 25 μ g/mL、それぞれ。これらの濃度は図 7 bに示すように 1 倍の濃度に相当します。図 9 bの下半分は、手順 3、線形線量反応実験からの結果を示しています。レフ、NAL と PNG の IC50 は 0.4 倍、0.8 倍、1.2 である x、それぞれ。これらの濃度は、ステップ 4 の 1 X IC50 として割り当てられます。
実験は、図 9 b、IC50 が井戸に示すように 2 つの複製に対応する 2 つのプレートは、オレンジ色で表示されます。プレート 1、1 倍の濃度にその IC50 があるすべての単一の薬。ペアまたは 3 ウェイの組み合わせで予想される IC50 は、すべての組み合わせも 1 倍の濃度の予想される IC50 を作る成分の薬の算術平均で計算されます。板 2、レフと PNG がその IC50 1 倍の濃度で、NAL IC50 は 1.2 で x。各組み合わせで予想される IC50 は、これらの IC50 値の算術平均を使用して定義されます。たとえば、レフ + NAL と NAL + PNG のため予想される IC50 は 1.1 x。薬物相互作用スコア (FIC) の各組み合わせは、プレートの右側に示すように、予想される IC50 と IC50 を観察を割ることによって計算されます。2 つのプレートの FIC スコアの検査は、レフ + PNG と NAL + PNG が拮抗しながらレフ + NAL とレフ + NAL + PNG は、相乗効果を示します。2 枚の板で得られた FIC スコアが一致しており、プロトコルの信頼性を支えます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> 図 1: ロエベ加法性薬物相互作用モデルのモデル定義を Null です。薬物 A は直線で示すように、1 つの軸で増加している、マイクロ プレート上の 2 つ 5 x 5 行列左右トップ薬物濃度定量表現型 (右上) を抑制します。これらの行列付加がヒドロキ シル化薬を結ぶ線各単一の薬剤の濃度がある薬 A. として同じ濃度、途中で表示されます。薬剤濃度の組み合わせのこの「チェッカー ボード」のセルが追加されると、この行に記録された表現型が接続する井戸の相当となりますが期待されます。この自己自己薬物相互作用実験 (緑の点線で示すように) 表現型を描いた isobole が直線的で加法 null モデルを定義する予定です。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> 図 2: ロエベ加法性薬物相互作用モデルに従ってペア薬物相互作用します。2 つの薬は図 1のように市松模様のアッセイで組み合わせれば、ストレート、凸または凹面観測 isophenotypic 輪郭があります。右端では、市松模様の試金に可能 isophenotypic 輪郭 (緑色の破線) を重畳しています。ストレート isophenotypic 輪郭をもつ薬剤の併用は、ロエベ-添加剤、輪郭、ロエベ添加剤である自己自己薬物相互作用とは異なるしない定義によって。Isophenotypic 輪郭が大きく凹または凸、組み合わせは相乗的あるいは拮抗、それぞれです。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> 図 3: ロエベ加法性薬物相互作用モデルによると 3 ウェイ薬物相互作用します。ペア相互作用の市松模様の試金と同様に、3 薬は 1 つの軸のそれぞれの薬が増加直線 (、"checkercube")、3 D グリッドに結合します。3 つの薬剤が同一であった場合 isophenotypic 表面はフラット、3 つの薬剤の組合せの加法を定義することになっています。凹または凸このロエベ無添加 null モデルよりも表面になった場合、薬の組み合わせは、相乗的あるいは拮抗、それぞれ。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> 図 4: ペアの薬物相互作用を測定する対角線論法。それぞれの市松模様の試金のためマゼンタの四角形で示されている領域のみが測定されます。i および ii 単一の薬剤濃度の増加は直線的。iii は、2 つの薬の 1:1 の混合物を単一の薬剤だったかのようにこの混合物を直線的滴定によって評価されます。ラフィックは、2 つの単一薬の期待される IC50 で割った値の組み合わせで観測された IC50 と同じです。ロエベ加法モデルの予想される IC50 は 2 つの単一の薬の平均 IC50 で近似です。FIC 値のロエベ無添加ペア 1、低い、または高い相乗効果または拮抗の組、それぞれ2,121 より。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> 図 5: 3 ウェイ薬物相互作用を測定する対角線論法。各 checkercube の試金のため表示領域のみが測定されます。i、ii および iii 単一の薬剤濃度の増加は直線的。iv は、1 することによって測定した: 3 つの薬と単一の薬剤であるかのように、この混合物を直線的滴定の 1:1 混合物。小発育阻止濃度は 3 つの単一の薬を与えられた期待される IC50 で割った値の組み合わせで観測された IC50と同じです。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> 図 6: 記載対角線論法プロトコルの各マイクロ プレート用セットアップの詳細ワークフロー 。日 4 に示すように板で重複して行われています。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> 図 7: シリアルおよび線形希釈用量反応実験。1 つの薬剤および対応する最終的な薬物濃度の連続希釈用量-反応の(A)準備。エシェリヒア属大腸菌細胞は、プレートに追加されます。成長の記録、それぞれの薬 16 h. シリアル IC50 は、オレンジ色で表示を選択すると、次の日に使用の線形希釈用量反応実験。1 つの薬剤に対応する最終的な薬物濃度の線形希釈用量-反応の準備を(B) 。エシェリヒア属大腸菌細胞は、プレートに追加されます。成長は、16 時間後に記録されます。各薬の次の日に使用されます選択した IC50s 薬物相互作用実験がオレンジ色で表示されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> 図 8: 薬物相互作用実験。相互作用実験の準備は単一のような薬物線形線量応答、ことを除いて 1:1 または 1:2 つの薬の 1:1 の混合物を使用または、線量応答をそれぞれ薬 3 つ。各用量-反応、オレンジ色で描かれているため IC50s を観察、FIC のスコアの計算に使用されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> 図 9: 実験結果を代表します。メイン テキストで提供された詳細で説明されているプロトコルを使用して得られた代表的な結果が表示されます。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

任意の数の薬のメジャーの相乗効果に対角線論法

このプロトコルでは、作り方ロエベ加法性基づかせていた薬剤の相互作用の測定ペアと 3 ウェイの薬物の組み合わせについて説明します。

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

diagonal-method-to-measure-synergy-among-any-number-of-drugs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K ビュー.  Sabanci University. このプロトコルでは、作り方ロエベ加法性基づかせていた薬剤の相互作用の測定ペアと 3 ウェイの薬物の組み合わせについて説明します。

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

生物学

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

インスリン注射と成人のインスリン感受性を測定する血リンパの抽出キイロショウジョウバエ</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

で微小管ダイナミクスを測定するためにplusTipTrackerソフトウェアを使用した<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;成長円錐

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

シングル出芽酵母細胞での寿命と細胞表現型を測定するためのマイクロ流体デバイスを使用しました

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of thermoregulation in birds across a variety of ecological circumstances. However, few studies characterize the contribution of the feathers alone to thermoregulation. Several previous studies have established methods for measuring the insulation value of animal pelts, but they require destructive sampling methods that are problematic for birds, whose feathers are not distributed evenly across the skin. More information is needed about 1) how the contribution of feathers to thermoregulation varies both across and within species and 2) how feather coats may change over space and time. Reported here is a method for rapidly and directly measuring the thermal performance of feather coats and the skin using dried whole skin specimens, without the need to destroy the skin specimen. This method isolates and measures the thermal gradient across a feather coat in a way that measurements of heat loss and metabolic cost in live birds, which use behavioral and physiological strategies to thermoregulate, cannot. The method employs a thermal camera, which allows the rapid collection of quantitative thermal data to measure heat loss from a stable source through the skin. This protocol can easily be applied to various research questions, is applicable to any avian taxa, and does not require destruction of the skin specimen. Finally, it will further the understanding of the importance of passive thermoregulation in birds by simplifying and accelerating the collection of quantitative data.

This protocol describes the quantification of heat transmission through a flat skinned avian specimen using a thermal camera and hot water bath. The method allows obtaining of quantitative, comparative data about the thermal performance of feather coats across species using dried flat skin specimens.

サーマルカメラを使用して鳥の羽のコートを通して熱損失を測定する

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of ...