Este trabalho foi financiado pelo NIGMS Grant P50GM107618. Os autores agradecer Zohar B. Weinstein para as observações perspicazes e sugestões sobre o manuscrito.

Nota: Qualquer pequena molécula que inibe o crescimento de bactérias e. coli pode ser usada para o método diagonal. Neste protocolo, levofloxacina (LEV), ácido nalidíxico (NAL) e penicilina G (PNG) irão ser usado como um exemplo, já que estas drogas mostram uma sinergia de três vias saliente. O fluxo de trabalho do presente protocolo é mostrado como Figura 6. Realize todas as medidas à temperatura ambiente. Use o frescas alíquotas de bactérias e drogas cada dia. Realize o experimento sob níveis de biossegurança adequados para Escherichia coli.
1. etapas de preparação
<ol><li>Preparar a mídia de Luria-Bertani (LB) com a adição de 25 g de caldo LB para 1 L de água destilada e misturar. Autoclave a 121 ° C por 15 min e loja a mídia autoclavada à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar ações de glicerol de Escherichia coli , misturando volumes iguais de estéril 50% de glicerol e células bacterianas diluídas para OD600 = 1 caldo LB e congelar 150 alíquotas µ l em tubos de 1,5 mL microcentrifuga a-80 ° C.</li>
	<li>Dissolva 20 mg de antibióticos, LEV, NAL e PNG em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO) cada. Dilua o LEV solução 100 x 0,2 µ g/ml misturando-se 10 µ l de solução LEV com 990 µ l de DMSO. Use LEV de 0,2 mg/mL e 20 mg/mL NAL e PNG nas etapas do processo.</li>
	<li>Alíquota 50 µ l de cada antibiótico para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e congelar a-20 ° C.</li>
	<li>Tome um 150 µ l alíquota de e. coli de-80 ° C. Degelo.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de estoque de glicerol de Escherichia coli em 5 mL de LB mídia em um tubo de cultura de 14 mL.</li>
	<li>Agite os tubos em uma incubadora de 37 ° C durante a noite a 200 rpm.</li>
</ol>2. serial diluição experimento de Dose-resposta
<ol><li>Tomar uma alíquota de drogas LEV, NAL e PNG de-20 ° C, deixá-los à temperatura ambiente durante 10 minutos descongelar e preparar diluições em série destas drogas.</li>
	<li>Prepare 1100 µ l da LB - 10% sol misturando 990 µ l de LB mídia e 110 µ l de solvente (DMSO).</li>
	<li>Prepare 500 µ l de LEV LB - 10% através da mistura de 450 µ l de LB mídia e 50 µ l de LEV.</li>
	<li>Sol de vórtice LB - 10% para 5 s na configuração mais alta. Adicione 20 µ l de sol LB - 10% para as linhas top 4 dos poços de uma microplaca de 96 poços.</li>
	<li>Vórtice LEV LB - 10% para 5 s na configuração mais alta. Adicionar 20 µ l de LEV LB - 10% para o primeiro poço em linha A.</li>
	<li>Prepare-se dupla diluição serial Lev LB - 10%, tendo 20 µ l do primeiro poço, adicionando ao segundo poço, pipetagem e descer cinco vezes. Repita isto para todos os poços sequencialmente até 11 bem, que acaba com 40 µ l (Figura 7A).</li>
	<li>Remova e descarte a 20 µ l do conteúdo da 11ª bem, usando uma micropipeta.</li>
	<li>Repita as etapas 2.3-2.7 para as drogas NAL e PNG usando as segunda e terceiros linhas do microplate, respectivamente.</li>
	<li>Repita as etapas de 2,3-2,7 pela droga LEV novamente na quarta linha como um controle positivo interno.</li>
	<li>Usando um spectrophotometer, medir o OD600 de um 01:10 diluição da cultura (etapas 1.5-1.7).</li>
	<li>Dilua as células em 5 mL de LB mídia para uma OD600 de 0,01. Despeje em um reservatório.</li>
	<li>Utilizando uma micropipeta multicanal, adicione 80 µ l de células diluídas para as diluições de série drogas preparadas no passo 2.4-2.9. As concentrações de droga final em cada poço é mostrado na Figura 7A. A placa para evitar a evaporação do selo.</li>
	<li>Incubar a placa para 16 h a 37 ° C.</li>
	<li>Inicie uma nova cultura bacteriana usar na etapa 3 (repita etapas 1.5-1.7).</li>
</ol>3. linear diluição experimento de Dose-resposta
<ol><li>Medir a absorvância de600 OD para placa de dose-resposta de diluição serial da etapa 2, usando um leitor de placas (Figura 7A certo) e interpretar os resultados com base nas etapas seguintes.</li>
	<li>Normalizar o crescimento, dividindo-se o crescimento em cada poço, com o crescimento no controle nenhuma droga para cada linha e calcular o crescimento percentual normalizando OD600a condição nenhuma droga.</li>
	<li>Para cada droga, localize os poços que têm inibição do crescimento de ~ 50% (IC50), mostrada em laranja na Figura 7A certo. Atribua a concentração nesses poços como "IC50 serial" para cada droga.</li>
	<li>Descongelar as alíquotas de droga fresca, prepare-se 1 mL de LB - 10% sol misturando LB mídia e solvente (DMSO) em uma proporção de 9:1 e LB - 10% drogas misturando LB mídia e drogas na proporção de 9:1, onde a concentração da droga é 100 x de serial IC50 do cada droga antes de adicionar a mídia LB , escolhido no passo 3.3.</li>
	<li>Prepare-se linearmente crescentes doses de drogas LEV, NAL e PNG 11 concentrações, misturando drogas LB - 10% e sol LB - 10% em volumes, mostrado na Figura 7B.</li>
	<li>Prepare-se linearmente crescentes doses de LEV na quarta linha como um controle positivo interno.</li>
	<li>Medir o OD600 das 01:10 diluição da cultura começou na etapa 2.14.</li>
	<li>Dilua as células em 5 mL de LB mídia para uma OD600 de 0,01. Despeje em um reservatório.</li>
	<li>Adicione 80 µ l de células diluídas para as diluições linear de drogas preparadas na etapa 3.6 utilizando uma micropipeta multicanal. As concentrações de droga final em cada poço é mostrado na Figura 7B. Nota: O meio bem na dose-resposta receberá o serial IC50 para esta droga. A placa do selo para evitar a evaporação.</li>
	<li>Incubar a placa para 16 h a 37 ° C.</li>
	<li>Começa duas culturas bacterianas frescas para usar na etapa 4 (repita etapas 1.5-1.7).</li>
</ol>4. experimento de interação droga diagonal
<ol><li>Medir a absorvância de600 OD por diluição linear dose-resposta de etapa 3 (Figura 7B).</li>
	<li>Para cada droga, escolha a concentração que resultaram em IC50 e prepara droga LEV, NAL e PNG em 100 x IC50 concentrações.</li>
	<li>Descongelar as drogas frescas, preparar 100 x IC50 para cada droga e preparar misturas de drogas de 1:1 em volume de LEV + NAL, LEV + PNG e NAL + PNG e 1: mistura de droga de 1:1 em volume de LEV + NAL + PNG.</li>
	<li>Prepare duas placas para experiências de interação de droga como mostrado na Figura 8.</li>
	<li>Medir o OD600 das 01:10 diluição das culturas começou na etapa 3.11.</li>
	<li>Preparar OD600 = 0,01 diluições de duas culturas em duas 10 mL de LB mídia.</li>
	<li>Adicione 80 µ l de células da cultura 1 e 2 em placas 1 e 2, respectivamente. Sele as placas para evitar a evaporação. Incubar as placas durante 16 h a 37 ° C.</li>
</ol>5. golo de interação droga diagonal
<ol><li>Medida da absorvância de600 OD para interação medicamentosa diagonal experimentar pratos da etapa 4.</li>
	<li>Normalize o crescimento, dividindo-se o crescimento em cada poço, com o crescimento no controle de drogas não bem para cada linha.</li>
	<li>Para cada linha, localize a coluna que tem mais próximo de IC50, mostrado em laranja na Figura 8 certa inibição do crescimento. Atribua o IC50 baseada a concentração relativa de droga nesta bem.</li>
	<li>Para LEV + NAL, NAL + PNG e LEV + NAL + PNG dose-respostas e LEV + PNG, calcule IC50 esperado calculando o IC50 das drogas em cada combinação única. Observe que em média é uma aproximação simples para cálculo exato de IC50 esperado conforme descrito antes12.</li>
	<li>Calcule o golo de concentração inibitória fracional (FIC), dividindo o IC50 observados pelo IC50 esperada em cada combinação.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O uso de combinações de drogas contra patógenos ou tumores é uma perspectiva atraente, especialmente sob as circunstâncias de antibiótico pipeline de secagem. No entanto, este potencial é dificultado pelo menos duas dificuldades. A primeira dificuldade é o número astronômico de combinações possíveis. Existem, por exemplo, 4950 combinações possíveis de pares entre 100 antibióticos. Todas as combinações possíveis entre 100 antibióticos (2100) está na mesma ordem de magnitude, com o número de bactérias na terra (10 ~30). Como prever combinações fortemente sinérgicas entre essas possibilidades tem sido objecto de numerosos estudos computacionais. A segunda dificuldade é a medição de interações medicamentosas de alta ordem. Considere que uma plataforma computacional pode sugerir que uma determinada combinação de droga-10 é fortemente sinérgica contra um determinado patógeno. Métodos tradicionais para testar interações medicamentosas é demasiado onerosa para verificar ou refutar esta hipótese, portanto, o estudo da sinergia entre muitos medicamentos tem sido fora dos limites da investigação científica. O método diagonal, o que foi proposto pela primeira vez há quase 30 anos e foi usado em algumas telas de sinergia recentes fornecem uma base sólida para o primeiro problema, permitindo o teste da interação entre muitos pares. Ele resolve o problema segundo uma amostragem informativa dos ensaios tradicionais e permite o estudo das interações medicamentosas de alta ordem.
Importante notamos que nosso protocolo usa uma dosagem linear para medições de interação de drogas, para fornecer a sensibilidade para detectar até mesmo interações fracas. Estabelecer o intervalo de concentração certa para dosagem linear é uma tarefa desafiadora. Realizando primeiro uma diluição serial, podemos tomar uma decisão informada sobre o espaço de busca para dosagem linear. No entanto, o protocolo pode ser modificado para usar 2 dobras ou maiores diluições em série para testes de interação de drogas. Essa modificação pode encurtar o tempo de experiência e permitem que o teste de interações mais; no entanto, teria sensibilidade para detectar interações apenas fortemente sinérgicas ou antagônicas.
O protocolo descrito mostra a medição de interações emparelhadas ou três vias. Um aspecto importante do protocolo é que agentes único são no mesmo prato como a combinação, para minimizar o viés devido às variações do prato. Portanto, o protocolo pode ser ajustado para medir interações até 7 vias combinações por modificações triviais. Combinações de mais de 7 drogas vão exigir mais de uma microplaca de 96 poços e considerações adicionais devem ser tomadas para garantir a integração de dados corretos, tais como repetições inter plate.
Uma notável limitação do método diagonal é a restrição que cada droga no ensaio deve inibir o fenótipo de interesse. Portanto, o método diagonal não é útil para a compreensão das interacções entre agentes ativos e adjuvantes inertes. Tais interações 'potencializadora' podem ser estudadas sob modelos alternativos tais como modelos de felicidade ou maior agente único.
Uma consideração importante para a análise de interações medicamentosas de ordem superior é a escolha do modelo nulo para o "IC50 esperado." Quando duas drogas são combinadas, o efeito da combinação só pode ser comparado aos efeitos da droga. Quando três drogas são combinadas, o efeito da combinação pode ser comparado ao único efeitos ou efeitos emparelhados. Por exemplo, se todas as combinações emparelhadas de três drogas são sinérgicas, então ser de esperar que estas drogas mostrará uma sinergia de três vias. Desvio de uma interação três vias do que é esperado de interações emparelhadas foi recentemente apelidado "interação emergente"16,17. Para simplificar, nosso protocolo descreve a medição da combinação de três vias está "líquido interação," que define o modelo nulo como efeitos de droga. No entanto, os dados que são obtidos a partir do protocolo também podem ser usados para calcular a interação emergente da combinação de três vias. Em nossa análise, definimos o esperado IC50 da combinação de três vias como a média da única droga IC50s. Alternativamente, o IC50 esperado pode ser definido como a média da IC50s de combinações emparelhadas (~1.1-1.2). Quando o IC50 observada é dividido por esta alternativa IC50 esperado, o FIC obtido fornece o FIC emergente para a combinação de três vias, como descrito anteriormente,12. Esta consideração revela que LEV + NAL + PNG é sinérgica mais do que o que seria de esperar de emparelhadas interações entre três drogas, demonstrando que o LEV + NAL + PNG tem sinergia emergente.

Combinações de drogas podem apresentar efeito surpreendentemente alto ou baixo em um fenótipo dado os efeitos das drogas constituintes, correspondente a interações medicamentosas sinérgicas ou antagônicas, respectivamente,1,2,3. O uso de combinações sinérgicas pode permitir dose-escalonamento para aumento da eficácia e redução de dose para alívio de efeito colateral. Tratamentos de combinação podem igualmente aplicar vários contratempos a maquinaria celular, bloqueando potenciais mecanismos de fuga evolutiva para resistência4. Portanto, as combinações de três ou mais drogas são rotineiramente usadas em patógeno ou câncer tratamento5.
Sinergia e antagonismo são definidos por uma comparação entre os efeitos observados de uma combinação contra um efeito esperado, tendo em conta os efeitos de drogas individuais. Entre os modelos para interações medicamentosas, aditividade Loewe é a mais exigente e tem um modelo bem definido nulo (Figura 1)6, e a interação de sinergia/antagonismo inferido é independente da concentração da droga usada 6 , 7. no entanto, o modelo de Loewe é experimentalmente caro mesmo para um teste de interação emparelhadas. Ensaios de interação droga tradicionalmente são compostos por uma matriz 2D de combinações de concentração da droga (um ensaio de quadriculado) (Figura 2). 5 doses são usados para cada droga, se 25 combinações são necessárias, correspondente a uma metade de uma microplaca se são conduzidos experimentos em replicar. O custo desta abordagem proíbe medição sinergia pelo modelo de aditividade da Loewe para combinações de múltiplas drogas (Figura 3). Por exemplo, para testar uma 10-forma interação, métodos tradicionais exigiria mais de 100 mil microplacas, barrando a medição experimental de alta-ordem sinergias pelo modelo de aditividade Loewe rigoroso, bem teorizado e independente de concentração 8.
Tratamentos clínicos atuais utilizam apenas uma fração de combinações de drogas possíveis. Por exemplo, o tratamento padrão da tuberculose activa é uma combinação de três antibióticos. Existem aproximadamente 20 antibióticos usados no tratamento de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Há combinações possíveis de 3 vias 1140 entre 20 drogas, cada um com potencial para ter uma forte sinergia contra Mtb. Como não houve nenhum método cost-effective para medir as interações medicamentosas entre muitas drogas, combinações sinergéticas potencialmente salva-vidas permanecem não testadas.
Aqui, descrevemos um protocolo simples para medir interações medicamentosas emparelhadas e três vias por amostragem somente a diagonal de um ensaio de xadrez (,Figura 4 e Figura 5). O conceito subjacente de amostragem da diagonal de um experimento de xadrez foi teorizado por Berenbaum em sua obra seminal em 19789. Ainda, esta abordagem só recentemente tem sido aplicada a droga sinergia telas10,11,12. Apresentamos o nosso protocolo com Escherichia coli (e. coli) e o fenótipo de crescimento. No entanto, notamos que o protocolo é independente das espécies biológicas e fenótipo de interesse e, portanto, pode ser aplicado para a medição da sinergia de drogas de alta ordem em outros contextos biológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

Uma combinação sinérgica de drogas tem uma eficácia maior em comparação com os efeitos das drogas individuais. Ensaios de tabuleiro de damas, onde drogas são combinadas em doses muitos, permitam a medição sensível de interações medicamentosas. No entanto, estes ensaios são caros e não se adapta bem para medir a interação entre muitos medicamentos. Vários estudos recentes têm relatado as medições de interação de drogas usando uma amostragem diagonal do ensaio do xadrez tradicional. Esta metodologia alternativa grandemente diminui o custo das experiências de interação de drogas e permite a medição de interação para combinações com muitas drogas. Aqui, descrevemos um protocolo para medir as três interações emparelhadas e uma interação de três vias entre três antibióticos em duplicado, em cinco dias, usando apenas três microplacas de 96 poços e equipamentos de laboratório padrão. Apresentamos resultados representativos, mostrando que a combinação de três-antibiótico da penicilina G + Levofloxacina + ácido nalidíxico é sinérgica. Nosso protocolo escalas medir as interações entre muitas drogas e em outros contextos biológicos, permitindo a telas eficientes para múltiplas drogas sinergias contra patógenos e a tumores.

Anteriormente, informamos as interações emparelhadas entre três drogas: LEV, NAL e PNG com base em testes em ensaios miniaturizados quadriculado, onde duas drogas foram combinadas em uma matriz 4 x 413,14. Enquanto NAL e LEV foram sinérgicos, PNG foi relatado para ser antagônico com tanto LEV e NAL de13,14. Aqui, verificamos essas interações emparelhadas e medido a interação de três vias entre estas três drogas usando um ensaio diagonal. Nossos resultados demonstram que o LEV + NAL + PNG é uma combinação sinérgica de antibiótica 3 vias. Representações esquemáticas para os resultados das seções individuais procedimento experimental foram dadas no lado direito da Figura 7 e Figura 8. Aqui, apresentamos e interpretar resultados brutos representativos de três leituras de placa, que são dadas na Figura 9. A leitura da placa superior corresponde à diluição serial e linear experimentos conduzidos em etapas 2 e 3. As duas leituras de placa inferior são placas duplicadas interação realizadas na etapa 4.
Os dados brutos na Figura 9 mostram que crescimento superior é em torno de 0,55, mas há uma densidade óptica 0,05 da mídia em si, como observado no OD600 das concentrações alta drogas onde não há nenhum crescimento. Portanto, definimos IC50 como (0.55-0.05)/2 = 0,25. Para cada dose-resposta, os poços localizados mais próximo a este valor são mostrados com laranja.
A metade superior da Figura 9A mostra os resultados da etapa 2, experimento serial dose-resposta. Os poços de IC50 para LEV é em repetições de 10 em duas colunas, que correspondem a 4 ng/mL. O IC50 para NAL e PNG estão a 3 µ g/mL e 25 µ g/mL, respectivamente. Essas concentrações correspondem à concentração de 1 x indicado na Figura 7B. A metade inferior da Figura 9B mostra os resultados da etapa 3, experimentos dose-resposta linear. LEV, NAL e IC50 do PNG encontram-se em 0,4 x, x 0.8 e 1.2 x, respectivamente. Essas concentrações são atribuídas como o 1 X IC50 para etapa 4.
Duas placas correspondente ao replicar dois experimentos são mostrados na Figura 9B, onde o IC50 poços são mostradas com laranja. Em chapa de 1, todos os medicamentos simples têm seu IC50 na concentração de 1 x. O IC50 esperados para a combinação de emparelhadas ou ménage é calculado pela média aritmética das drogas constituintes, tornando IC50 esperado para concentração de 1x também todas as combinações. Em chapa 2, LEV e PNG têm seu IC50 na concentração 1 x, mas NAL IC50 é de 1.2 x. O IC50 esperados para cada combinação é definida utilizando a média aritmética destes valores de IC50. Por exemplo, o esperado IC50 para LEV + NAL e NAL + PNG é 1.1 x. A interação de droga marcar (FIC) para cada combinação é calculada dividindo-se observado IC50 com o IC50 esperados, como mostrado no lado direito das placas. Inspeção das pontuações das duas placas FIC demonstra que LEV + NAL e LEV + NAL + PNG são sinérgicas, enquanto LEV + PNG e NAL + PNG são antagônicas. FIC somatória de pontos atribuídas as duas placas está de acordo, a confiabilidade do protocolo de apoio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> Figura 1: Null definição de modelo para modelo de interação de droga de aditividade de Loewe. 5 x duas 5 matrizes em uma microplaca, onde drogas A linearmente é aumentada em um eixo, como mostrado à esquerda, e uma alta concentração de fármaco inibe um fenótipo quantificável (superior direito). A adição destas matrizes é mostrada no meio, onde as linhas conectando equipotent droga um concentrações em cada única droga tem a mesma concentração que droga A. Quando as células são adicionadas a este "tabuleiro de damas" de combinações de concentração de drogas, espera-se que o fenótipo gravado nesta linha será equivalente para os poços que se conecta. Neste experimento de interação droga autoauto, o isobole representando um fenótipo (mostrado com uma linha tracejada verde) é esperado para ser linear, definindo o modelo de aditividade nula. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> Figura 2: interações de droga emparelhadas, de acordo com o modelo de interação de droga de aditividade de Loewe. Quando dois medicamentos são combinados em um ensaio de xadrez, como na Figura 1, o contorno de isophenotypic observado pode ser em linha reta, convexa ou côncava. À direita, isophenotypic possíveis contornos (linhas tracejadas verdes) são sobrepostos em ensaios de tabuleiro de damas. Combinações de drogas com contornos isophenotypic reta são Loewe-aditivo, como os contornos não são diferentes de uma interação de droga autoauto, que é a Loewe-aditivo por definição. Quando o contorno de isophenotypic significativamente é côncavo ou convexo, a combinação é sinérgica ou antagônica, respectivamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> Figura 3: interações medicamentosas de três vias de acordo com o modelo de interação de droga de aditividade de Loewe. Semelhante para o ensaio de quadriculado para interações emparelhadas, três-drogas são combinadas em uma grade 3D (um "checkercube"), onde cada droga linearmente é aumentada em um eixo. Se as três drogas eram idênticas, isophenotypic superfície deve ser plana, definindo a aditividade para três combinações de drogas. Se a superfície é mais côncava ou convexa que este modelo nulo Loewe-aditivo, combinações de drogas são sinérgicas ou antagônicas, respectivamente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> Figura 4: método Diagonal para medir interações medicamentosas emparelhadas. Para cada ensaio de tabuleiro de damas, medem-se apenas as regiões mostradas em retângulos magenta. i e ii são linearmente única droga concentrações crescentes. III é avaliada, fazendo uma mistura 1:1 de dois medicamentos e linearmente titulada esta mistura como se fosse uma única droga. A FIC é igual ao IC50 observados na combinação dividida pelo esperado IC50 de duas drogas única. Para o modelo de aditividade de Loewe, o esperado IC50 é aproximada pelo IC50 média das duas drogas única. Um valor FIC é 1 para pares de Loewe-aditivo e é inferior ou superior a 1 para os pares sinérgicas ou antagônicas, respectivamente2,12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> Figura 5: método Diagonal para medir interações medicamentosas ménage. Para cada ensaio de checkercube, apenas as regiões mostradas são medidas. i, ii e iii são linearmente única droga concentrações crescentes. IV é medido por fazendo um 1:1:1 mistura de três drogas e linearmente titulada esta mistura como se fosse uma única droga. A concentração inibitória fracional é igual ao observado IC50 na combinação dividida pelo IC50 esperado dado três drogas única. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> Figura 6: fluxo de trabalho para o protocolo do método diagonal aqui descritos e os detalhes de configuração para cada microplacas. A placa mostrada no dia 4 é conduzida em duplicado. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> Figura 7: experimentos dose-resposta de diluição Serial e linear. (A) preparação da diluição serial dose-resposta para uma droga e concentrações de droga final correspondente. Células de Escherichia coli são adicionadas à placa; crescimento é gravado após 16 h. IC50 Serial, mostrado em laranja, é selecionado para cada droga para uso no dia seguinte é linear experimentos dose-resposta de diluição. (B) preparação da diluição linear dose-resposta para uma droga e concentrações de droga final correspondente. Células de Escherichia coli são adicionadas à placa; crescimento é registrado após 16 h. Para cada droga, o selecionado IC50s que será usado do dia seguinte drogas interação experimentos são mostrados em laranja. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> Figura 8: experiências de interação de drogas. Preparação de experiências de interação é a única droga linear dose-respostas semelhantes, exceto que um 1:1 ou 1:1:1 mistura de drogas é usada para dois ou três droga dose-respostas, respectivamente. Observada IC50s para cada dose-resposta, retratado em laranja, são usados para calcular o golo de FIC. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> Figura 9: representante experimentar resultados. São mostrados resultados representativos obtidos usando o protocolo descrito, com pormenores fornecidos no texto principal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Método diagonal medida sinergia entre qualquer número de drogas

Neste protocolo, descrevemos como fazer Loewe medições de interação de drogas baseadas em aditividade para pairwise e combinações de drogas de três vias.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K visualizações.  Sabanci University. Neste protocolo, descrevemos como fazer Loewe medições de interação de drogas baseadas em aditividade para pairwise e combinações de drogas de três vias.

Vídeo: Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biologia

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

Injeção de insulina e Extração de hemolinfa para medir a sensibilidade à insulina em adultos Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Matriz Hibridização Genômica Comparativa (Array CGH) para a detecção de Genomic copiar o número de variantes

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Ensaio in vitro para medir Fosfatidiletanolamina Metiltransferase Atividade

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of thermoregulation in birds across a variety of ecological circumstances. However, few studies characterize the contribution of the feathers alone to thermoregulation. Several previous studies have established methods for measuring the insulation value of animal pelts, but they require destructive sampling methods that are problematic for birds, whose feathers are not distributed evenly across the skin. More information is needed about 1) how the contribution of feathers to thermoregulation varies both across and within species and 2) how feather coats may change over space and time. Reported here is a method for rapidly and directly measuring the thermal performance of feather coats and the skin using dried whole skin specimens, without the need to destroy the skin specimen. This method isolates and measures the thermal gradient across a feather coat in a way that measurements of heat loss and metabolic cost in live birds, which use behavioral and physiological strategies to thermoregulate, cannot. The method employs a thermal camera, which allows the rapid collection of quantitative thermal data to measure heat loss from a stable source through the skin. This protocol can easily be applied to various research questions, is applicable to any avian taxa, and does not require destruction of the skin specimen. Finally, it will further the understanding of the importance of passive thermoregulation in birds by simplifying and accelerating the collection of quantitative data.

This protocol describes the quantification of heat transmission through a flat skinned avian specimen using a thermal camera and hot water bath. The method allows obtaining of quantitative, comparative data about the thermal performance of feather coats across species using dried flat skin specimens.

Usando uma câmera térmica para medir a perda de calor através de casacos de penas de pássaro

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of ...