Yazarlar S-İ Choi (Chonnam National University) değerli yorum ve bizim el yazması ayrıntılı okuma için teşekkür ederiz. Bu eser Chungnam Ulusal Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>Bir uygun restriksiyon enzimi tanıma sitesi (veya site) pEUI(+) MCS içinde seçin ve istenilen yönde (şekil 1) faiz gene subclone. Not: EGFP veya bayrak epitope öğesini ankyrin tekrar etki alanı 13A (ANKRD13A) transgene T4 DNA polimeraz bir sıra ve ligasyonu yöntem19klonlama bağımsız olarak kullanarak pEUI(+) vektör EcoRI sitedeki subcloned.</li>
	<li>37 ° C'de 1 h için EcoRI ile pEUI(+) linearize Mix 50 ng/µL olan pEUI(+) ile 40 ng/µL PCR güçlendirilmiş EGFP veya ANKRD13A, doğrusallaştırılmış ve T4 DNA polimeraz (1 U) önce 10 dakika süreyle buzda kuluçka (RT) oda sıcaklığında 1 dk ile reaksiyon karışıma doğrudan 100 µL eklemek 10 µL tepki DH10B yetkili hücreleri aşağıdaki dönüştürme için denemeler yapın. Not: her ne kadar birkaç restriksiyon enzimi tanıma sitesi pEUI(+) (şekil 1B) MCS eklenmiş, hedef gen EcoRI siteye subcloning tüp ligasyonu bağımsız klonlama teknolojisi19,20kullanmanızı öneririz.</li>
	<li>Sıralama tarafından INSERT doğrulayın ve sonra transfection için uygun olan bir DNA arıtma kit kullanarak DNA arındırmak.</li>
</ol>2. geçici Transfection ve Teb tedavi
<ol><li>% 5-10 fetal sığır serum (FBS) ve antibiyotik (100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin) ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 5 mL taze pasajlı HEK293 hücreleri içeren dört hücre kültür yemekleri (60 mm çapında) hazırlamak. Bundan sonra "hücre kültür orta" veya sadece "kültür orta" FBS ve antibiyotik ile DMEM temsil eder. 37 ° C'de HEK293 hücreleri korumak</li>
	<li>1 µg saf DNA'ın % 50-60 yoğunluk transfection reaktif 3 µL kullanarak, HEK293 hücre içine transfect. Seyreltici (DMEM FBS ve antibiyotikler olmadan) 200 µL transfection reaktif eklemek DNA içeren. 30 dk RT az reaksiyon karışımı kuluçka sonra kültür çanak HEK-293 hücrelerine karışımı ekleyin. Transfection için iki tabak kullanın ve diğer denetimleri tedavi edilmezse bırakayım.</li>
	<li>Transfection 12-24 saat sonra Teb (son konsantrasyonları, 0.2 - 10 µmol) birine transfected örnekleri ve sigara transfected denetimleri ekleyin. Diğer iki örnek deneysel kontrolleri tedavi edilmezse bırakın. Not: Teb hisse senedi çözüm (50 mM Dimetil sülfoksit içinde çözünmüş) hücre kültür orta, DMEM veya fosfat tamponlu tuz (PBS) deneysel parametrelere bağlı olarak kültürlü hücrelere eklemeden önce uygun bir konsantrasyon, seyreltilmiş. Ancak, sulu çözelti içinde Teb düşük çözünürlük nedeniyle, orta TEB'in yüksek bir konsantrasyon ile ana bir karışım hazırlama kaçının; Bunun yerine, taze orta Teb istenen konsantrasyon içeren tam hücre kültür orta yerine.</li>
	<li>Teb-tedavi ve tedavi edilmezse hücreler için 12-48 h 37 ° C'de yetiştirmek</li>
	<li>EGFP kullanarak eklerseniz, EGFP ifade floresan mikroskop ( Şekil 2) altında analiz. Aksi halde, bir immunoblotting tahlil için hücreleri hasat.<ol>
<li>İmmunoblotting tahlil için buz gibi PBS iki kez hücrelerle durulama ve sonra onları bir hücre kazıyıcı kullanılarak kazımak.</li>
		<li>Hücreleri kazık için spin hasat 21.000 x g (RT) 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde aşağı.</li>
		<li>PBS tamamen discarding sonra buz gibi memeli protein ayıklama reaktif 0.5 mL ekleyin (M-başı), proteaz inhibitörü (100 proteaz inhibitörü kokteyl x 5 µL), 60 mm tabak içinde hücreler kültürlü Eğer Pelet için ile birlikte.</li>
		<li>Pipetting birkaç tur hücrelerle yeniden askıya alma ve askıya alınan hücreler (RT) 18-25 ° C'de 15 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>Hücre lysate 21.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin</li>
		<li>Sulu süpernatant temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın.</li>
		<li>İmmunoblotting, aşağıdaki standart iletişim kuralları ile uygun antikorlar tarafından süpernatant analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. nesil istikrarlı HEK293 hücre hatları ile pEUI(+) Gene Switch genomik entegrasyonu
<ol><li>5-10 µg transgene ile saf pEUI(+), 15-30 µL transfection reaktif kullanarak % 50-60 birleşmesi bir 90 mm çapında hücre kültür çanak içinde olan HEK293 hücrelere transfect. Seyreltici (DMEM FBS ve antibiyotikler olmadan) 500 µL transfection reaktif eklemek DNA içeren. 30 dk RT az reaksiyon karışımı kuluçka sonra kültür çanak HEK-293 hücrelerine karışımı ekleyin.</li>
	<li>Transfection sonra büyümeye ve puromisindir-direnç gen ürünleri için 24-48 h 37 ° C'de (puromisindir) olmadan seçici olmayan kültür orta altında hızlı transfectants izin ver</li>
	<li>Kültür yemekleri hücrelerden trypsinization tarafından ayırmak. Kültür orta atarak sonra transfectants Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) ile durulayın, 1 mL % 0.25 tripsin/ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin ve 37 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya Tripsin/EDTA sonra Şoklama Önceden ısıtılmış kültür orta (10 mL, 37 ° C) ekleyerek, hasat Santrifüjü 21.000 x g için 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde ardından bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri</li>
	<li>Transfectants 50 ml Önceden ısıtılmış kültür orta (37 ° C) ve transfer 10 mL hücrelerin içine 90 mm taze hücre kültür yemekler yeniden askıya alma. % 50-60 confluency puromisindir tedavi öncesi kadar 37 ° C'de hücreler kültür (genel olarak, bu yaklaşık 24-48 h alır).</li>
	<li>Hücre kültür 3 µg/mL puromisindir ile 3-4 hafta boyunca takıma orta 37 ° C'de transfectants yetiştirmek. Seçim döneminde seçimi basınç korumak için 2-3 günde puromisindir (3 µg/mL) içeren hücre kültür orta değiştirin. Hücreleri tamamen Konfluent olduğunda, puromisindir içeren kültür orta ile 3.3-3.4, adımda prosedürleri aşağıdaki bölüp. Kalan hücreleri kültür ortamında gerekli değildir Eğer atmak. Not: Puromisindir seçimi koşullar deneysel olarak belirli hücre tipleri için oluşturulmuş olmalıdır. Hücre kültürü ortamında 3 µg/mL puromisindir kullanılan; Bu hücre ölümü içinde sigara transfected HEK293 ikna etmek için yeterliydi.</li>
	<li>Hücre klonlama bir silindir kullanarak bireysel kolonilerden hasat ve üreticinin yönergeleri izleyin.<ol>
<li>Hücre kültür orta atın. İki kez Önceden ısıtılmış (37 ° C) yüzen hücreleri kaldırmak için PBS ile plaka durulayın.</li>
		<li>Steril forseps kullanarak, klonlama silindir üzerinde bireysel kolonileri ayarlayın.</li>
		<li>%0.35 tripsin/EDTA 0.2 mL her silindir için ekleyin.</li>
		<li>Kadar hücreleri müstakil ve silindir için Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür ortamının birkaç damla eklemek için 1 dk 37 ° C'de çanak kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri her silindir 6-şey plaka bireysel wells kültür orta 2 mL ve 1 µg/mL puromisindir her iyi ile aktarın. Not: hücreleri Konfluent olduğunda, kültürünü büyütmek. Şimdi clone(s) gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre kültürü 1 µg/mL ile puromisindir takıma orta bireysel klonlar korumak.</li>
	<li>Bireysel kolonileri transgene ile immunoblotting ifade düzeyini analiz ederek onların duyarlılık için Teb tedaviye (son konsantrasyonu, 10 µM) 24 h Test yanıt için Teb klonların sınayarak doğrulayın. İstenen bir klonu (veya klonları) seçin. Teb tedavi ve tedavi edilmezse bir örnek 12-48 h 37 ° C'de için kültür ortamında transgene indüksiyon düzeyini analiz daha önce yetiştirmek. Transgene ifade düzeyini immunoblotting, adımları 2.5.1 - 2.5.7 yordamlarda takip yoluyla ölçülebilir.</li>
</ol>4. Teb tükenmesi
<ol><li>Teb uyaranlara Teb-Alerjik orta ile Teb içeren hücre kültür orta değiştirerek gidermek. Not: Bu ilk hücreleri yeni bir kültür tabak üzerine reseeding olmadan büyüme ortamı değiştirin önerilir. Artık Teb plastik yemek için tutunacak görünür ve transgene güçlü arka plan ifadesidir temin. Hücreleri yeni bir kültür plaka üzerinde reseeding daha önce birkaç kez ile Kültür orta veya PBS hasat hücreleri durulayın.<ol>
<li>Kültür yemekleri hücrelerden trypsinization tarafından ayırmak. Kültür ortamı içeren Teb atarak sonra iki kez Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) ile Teb teşvik hücreleri durulama, 1 mL % 0.25 tripsin/EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya Teb-Alerjik Önceden ısıtılmış kültür orta (10 mL, 37 ° C) ekleyerek tripsin/EDTA Şoklama sonra hasat Santrifüjü 21.000 x g için 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde ardından bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri</li>
		<li>Önceden ısıtılmış Teb-Alerjik kültür orta (37 ° C) ve transfer 5 mL hücrelerin içine üç 60 mm taze hücre kültür yemekler 50 mL hücrelerde yeniden askıya alma. Sırasıyla 24, 48 ve 72 s 37 ° C'de hücreler kültür.</li>
		<li>Hücreleri farklı zaman noktalarda hasat ve immunoblotting kullanarak transgene ifade düzeyini ölçmek. Not: Bu deneysel koşullarda belirlenemeyen yaklaşık 3 gün sonrası kültür Teb-Alerjik kültürel orta (şekil 3) hücrelerinin transgene ifade oldu. Transgene ifade düzeyini immunoblotting, adımları 2.5.1 - 2.5.7 göre tarafından ölçülebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems.">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).</li><li>Clackson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+gene+expression+systems.">Regulated gene expression systems.</a> Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).</li><li>Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatable+lentiviral+system.">Gene regulatable lentiviral system.</a> Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP/mTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse.">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+and+mTOR:+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer.">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).</li><li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+mifepristone+(MFP).">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li><li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+mifepristone:+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies.">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li><li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes.">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li><li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptors+and+their+biological+actions.">Ecdysone receptors and their biological actions.</a> Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).</li><li>Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ligands+and+coligands+for+the+ecdysone-regulated+gene+switch.">Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).</li><li>Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor:+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression,+and+reduced+size.">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues.">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).</li><li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+regulation+of+zebrafish+gene+expression.">Small-molecule regulation of zebrafish gene expression.</a> Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).</li><li>Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-inducible,+ecdysone+receptor-based+gene+expression+system+for+plants.">Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants.</a> Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).</li><li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetOn+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Jeong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+sequence-+and+ligation-independent+cloning+as+a+rapid+and+versatile+cloning+method+for+functional+genomics+studies.">One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone-inducible+gene+expression+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).</li><li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+insecticidal+activity+of+benzoheterocyclic+analogues+of+N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide:+Part+1.+Design+of+benzoheterocyclic+analogues.">Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues.</a> Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).</li><li>Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse.">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li><li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide,+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist.">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li><li>McConnell, M. J., Imperiale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adenovirus+and+its+use+as+a+vector+for+gene+therapy.">Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).</li><li>Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+skin+diseases.">Gene therapy for skin diseases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).</li><li>Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Gene+Therapy:+Translational+and+Clinical+Outlook.">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li><li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats.">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li><li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter.">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li></ol>

Bu raporla ilgili hiçbir çatışması var.

Bir ikili gen ifade anahtarı kullanmanın en büyük dezavantajı aynı anda iki ayrı plazmid (sürücü ve efektör) hedef hücreye teslim etmek ihtiyacıdır. Bu eşitsiz dağılımı Plazmid ve tutarsız bir yanıt sonucu indükleyicileri1,2,3geçmek için yol açabilir. İki-vektör sisteminin başka bir eksiklik en az iki el antibiyotik seçimi taahhüdü hücre satırları tanımlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenle, tek bir birim oluşan bir gen-indüklenebilir kaset uzun biyolojik araştırmalarda kullanılmak aranan. PEUI(+) tekil transgene ifade anahtarı transgene uyarılması için gerekli tüm yasal birimler ile donatılmış bir tek vektör yer almaktadır. Böylece, pEUI(+), subcloned transgene indüksiyon düzeyini geçici transfection deney ve kimyasal uyarıcı dozu transfected DNA miktarı bağlıdır. Buna ek olarak, daha fazla pEUI(+) vektör kullanımı ANKRD13A transgene15tek bir kopyasını içeren bir istikrarlı hücre satır oluşturarak test ettik. Kurulan hücre Teb tedaviye (şekil 3) yüksek hassasiyet gösterdi. Topluca, yüksek hassasiyet, reversibility ve düşük leakiness15, ifade düzeyi sınırlı varyasyon ile birlikte pEUI(+) hedef gen ekspresyonu değiştirmek için değerli bir moleküler ve hücresel araç olun.
Çeşitli indüklenebilir gen sistemleri arasında biz GvEcR bağlı gen indüksiyon kaset seçildi. GvEcR diğer sistemleri üzerinde çeşitli avantajları vardır: Birincisi, kimyasal indükleyicileri (Teb dahil olmak üzere) kullanılan birkaç ecdysone analogları lipofilik doğası hücresel zarları21; verimli penetrasyon için avantajlıdır İkinci olarak, omurgalıların içinde hiçbir EcR orthologs vardır, ecdysteroid agonistler üzerinde etkisi var bu yüzden işlevini endogenously nükleer reseptörleri21,22ifade; Üçüncü olarak, ecdysteroids omurgalılarda zararsız ve dolaşım sistemi içinde vivo21,23hızla temizlenmiş. ve çok sayıda ecdysone agonistler şimdiye kadar en iyi şekilde ölçekli küçük moleküller seçerek geliştirilmiştir bu yana dördüncü olarak, araştırmacılar istenmeyen komplikasyonlar13,22,24önleyebilirsiniz. PEUI(+) yüksek hassasiyet için Teb gösterir, ancak yanıt için diğer ecdysteroid agonistler pEUI(+) hızını test değerli kanıtlayabilir. Methoxyfenozide gibi non-steroid EcR agonistler varlığını Teb24 pEUI(+) uygulamalarının kapsamını genişletmek daha fazla suda çözünür. PEUI(+) transgene ifade bu Tet-sistemi15dakika sonra daha nispeten zayıf olsa da, transgene indüksiyon düzeyini VP16 transactivation etki (veri gösterilmez) çok bir kopyasını ekleme tarafından artar. Son gen terapisi uygulamaları bir hedef gen güvenli teslimat hücreleri veya ilgili fonksiyonel gen ürünü sayesinde genetik hastalık25,26,27eksikliği dokular üzerinde odaklanmıştır. Ancak, Sigara düzenlenir transgene doku özgü ya da viral bünye rehberleri kontrol altında hiper-ifade yerel doku hasarı28,29olasılığını yükseltir hedef genin temin. Böylece, bir güvenilir gen anahtar gen tedavisi için uygulama istenmeyen komplikasyonları önlemek olabilir. PEUI(+) vektör biyolojik ve klinik çalışmalarda transgene ifade denetlemek için kullanışlı ve güçlü bir araç sağlar. Şu anda, bir tekil lentiviral vektör sistemimiz uygulama aralığı artırmak için GvEcR üzerinde dayalı gelişmekte olan.

Tam olarak hücre kültürü ve hayvan modellerinde başarı1,2,3değişen derecelerde transgene ifade düzenlemek yeteneklerini için birkaç farklı gen anahtar incelemiş bulunuyoruz. Potansiyel gen anahtar sistemleri de dahil olmak üzere birkaç sıkı kriterleri karşılamak: hassas yönlü ifade transgene, dozaj ve zaman bağımlı kavramaları indükleyicileri, düzenleyicinin önemsiz leakiness, transgene reversibility etkinleştirme uyarıcı kaldırma ve uyarıcı toksisite düzeyleri hücre satırları ve laboratuvar hayvanları1,2,3için tolere edilebilir. Birkaç küçük molekül indükleyicileri, tetrasiklin4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10da dahil olmak üzere istismar, ve ecdysone11,12,13,14. Genel olarak, bu sistemler, iki ya da üç ayrı ifade birimleri içeren en az iki plazmid gerektirir, bir ya da iki tanesi transkripsiyon etkinlik kazanmak için bir küçük molekül uyarıcı bağlar bir düzenleyici öğesi (uyarıcı plazmid) oluşturmak; ve başka bir plazmid (efektör plazmid) uyarıcı bağlı yasal öğe erişim sağlar düzenleyici bir DNA bölge kontrol altında transgene içeren. En büyük dezavantajı ikili sistemdeki hedef hücre içine iki vektörlerin (uyarıcı ve efektör) giriş eşlik eden gerektirmesidir. Geçici transgene ifade denemelerinde iki plazmid aynı anda transfection kaçınılmaz bir nüfus tek başına uyarıcı ya da efektör ile transfected veya unequally co transfected hücre üretir. Ayrıca, ikili sistem istikrarlı hücre hatları, zaman alan ve zahmetli olan kurmak için antibiyotik seçimi en az iki tur gerektirir. Bu nedenle, tüm bileşenleri birleştirerek transgene ifade için gerekli ve yönetmelik tek bir vektör içine tek bir hücredeki tüm gerekli öğeleri eşlik eden ifade garanti ve transgene ifade Yönetmeliği için izin vermek ideal olacaktır Küçük molekül indükleyicileri ile tedavi yoluyla.
İkili gen anahtarları eksikliklerin üstesinden gelmek için biz son zamanlarda bir tekil gen anahtar, bir Drosophila melanogaster EcR tabanlı gen indüklenebilir sistem15kullanılarak geliştirilmiş. Sırayla DNA düzenleyici elemanlarının3,11EcR bağlama indükler EcR/ultraspiracle (USP) heterodimerdir için bağlandığında ecdysone gen ekspresyonu aracılık eder. Omurgalı retinoid X reseptör (RXR), böcek USP, bir ortholog bir etkin transkripsiyon aktivatör16oluşturmak için EcR acemi. Böylece, omurgalı hücreleri veya doku transgene hedeflenen ifadesi için EcR ve RXR aynı anda ecdysone veya onun agonistler tarafından daha önce uyarılmış ortak ifade olması gerekir. Heterodimeric özelliği EcR tabanlı gen anahtarının endojen RXR düzeyi, Padidam ve arktarafından etkilenmiş olabilir beri. EcR DNA'ya bağlanıcı ve harekete geçirmek etki alanları kapaklı GAL4 DNA'ya bağlanıcı ile herpes simpleks virüs protein vmw65 yerine (VP16) etkinleştirme etki alanları erimiş olan o zaman endojen RXR tepkisiz oldu ve bir homodimer oluşan EcR ligand bağlayıcı etki Transkripsiyon etkinliği17kazanmak için. EcR tabanlı gen anahtar en az VP16 harekete geçirmek etki alanı olan bir homodimer oluşmuş ve ecdysone agonist, Teb16yokluğunda sitozol lokalize GvEcR ile birlikte oluşan bir chimeric protein oluşturmak yoluyla daha da geliştirildi, 18. Teb için bağlama tarafından GvEcR onun hücre altı yerelleştirme sitozol en az organizatörü kombine ile on bir tandem Zebra balığı E1b oluşan bir karma organizatörü ters yönde harekete geçirmek dizileri (UASs) başlatmak için tekrar tanımak için çekirdek değişti Transkripsiyon hedef gene16.
Daha önce raporlanmış EcR tabanlı gen basitleştirmek için16,18geçer, uyarıcı transgene ifade için tüm gerekli öğeleri ile donatılmış ve daha sonra belirlenen bir tek vektör ikili sistemin özelliklerini kombine Yeni oluşturulan vektör pEUI(+) (GenBank üyelik numarası: KP123436, şekil 1A)15. GvEcR sürücü (bundan sonra sürücü) yanıt efektör on tandem birden çok klonlama sitesi (MCS) tarafından takip E1b en az organizatörü yanındaki UAS tekrarlar, EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ve AflII tanıma dizileri ile (şekil 1B) oluşur. Buna ek olarak, seçimi kolaylaştırmak için transfected hücreleri, bir SV40 organizatörü tahrik puromisindir N-asetil-transferaz (PAC) gen istikrarlı hücre satır (şekil 1) korumak için sürücü ve efektör bölgeler arasında yerleştirildi.
Biz transgene ifade pEUI(+) kullanarak geçici ve istikrarlı modülasyon için detaylı bir protokol tanımlamak. Buna ek olarak, bir ecdysone agonist TEB'in başarılı kullanımı için ayrıntılı yönergeler sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEUI(+)</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The patent license was transferred to TransLab Inc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gene-Fect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;">TLC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tebufenozide</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">S001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:71px;">SPL life science</td>
			<td style="width:119px;">11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse FLAG M2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-alpha tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">CP06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td style="width:71px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740410.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M-PER Mammalian Protein 
			Extraction Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Protease inhibitor Cock. III</td>
			<td style="width:71px;">T&#38;I</td>
			<td style="width:119px;">BPI-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

Hassas kontrol transgene ifade biyolojik ve klinik çalışmalarda tercih edilir. Ancak, şu anda istihdam gen anahtarları ikili özelliği iki tedavi edici ifade ünite transferi aynı anda tek bir hücreye gerektirdiğinden, gen tedavisi için sisteminin pratik uygulama sınırlıdır. Transgene ifade sistemi basitleştirmek için tek bir vektör transgene ifade modüllerde eksiksiz bir dizi kapsayan pEUI(+) olarak belirlenmiş bir gen anahtarı oluşturulur. GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanını oluşan ve değiştirilmiş EcR (GvEcR), en az bir VP16 harekete geçirmek etki GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı, hem de değiştirilmiş Drosophila ecdysone reseptör (EcR), ile erimiş yeni geliştirilen tekil gen anahtarı son derece olduğunu kimyasal bir uyarıcı bir saat ve doz bağımlı şekilde yönetimi için duyarlı. PEUI(+) vektör transgene ifade Biyolojik araştırma ve önceden klinik çalışmalar kontrolünü geliştirmek için potansiyel olarak güçlü bir araçtır. Burada, detaylı bir iletişim kuralı modülasyonu pEUI(+) vektör tebufenozide (Teb) tedavi ile kullanarak bir geçici ve istikrarlı transgene ifade için mevcut. Ayrıca, kimyasal bir uyarıcı olarak Teb kullanımı için önemli bir yönerge paylaşıyoruz.

Tekil gen GvEcR tabanlı anahtar şekil 1Aile tasvir edilir. PEUI(+) vektör Teb ile tedavi tarafından düzenlenmiş transgene ifade için optimize edildi. PEUI(+) efektör bölgesinin bir 10xUAS ve EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ve AflII restriksiyon enzimi tanıma siteleri içeren bir MCS tarafından en az organizatörü takip bir E1b oluşmaktadır. Bir SV40 Poli(a) sinyal MCS (şekil 1B) eklendi. PAC gen puromisindir direnç tanımak pEUI(+) sürücü ve efektör bölgeler arasında eklenir.
Etkinlik ve pEUI(+) leakiness değerlendirmek için biz subcloned EGFP MCS EcoRI siteye (pEUI(+)-EGFP), geçici HEK293 hücrelere plazmid yapı transfected ve Teb 24 h () için farklı konsantrasyonlarda yönetilen Şekil 2). Sahte vektör transfectants floresan değil göstermek did Teb tedavi ne olursa olsun (şekil 2A, B), pEUI (+) sinyalleri iken-EGFP transfectants oldu giderek duyarlı Teb (şekil 2C-F artış miktarı ). Daha da önemlisi, (+) pEUI-EGFP transfectants tedavi TEB'in olmadan değil herhangi bir tespit EGFP sinyalleri floresan mikroskop (şekil 2C) altında temin.
Daha fazla pEUI(+) Teb için yanıt verdiğini doğrulamak için biz bir bayrak epitope öğesini ANKRD13A gen pEUI(+) EcoRI siteye subcloned, yapý HEK293 hücrelere transfer ve sonra onları kurmak 3 hafta boyunca puromisindir seçime tabi istenen hücre kültürünü ANKRD13A transgene ile. ANKRD13A transgene ifade Teb ile 24 h tedaviden sonra analiz ettik ve kurulan hücre kültürünü iyi yanıt (şekil 3). Daha fazla kültürel ortamdan Teb tüketen tarafından pEUI(+) gen anahtarı reversibility gösterdi. Teb-Ücretsiz medya hücrelerde kültürlü zaman şekil 3' te gösterildiği gibi ANKRD13A ifade artık algılanabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig1.jpg"> Resim 1 . PEUI(+) şematik diyagramı. (A) pEUI(+) vektör harita inşa. CMV organizatörü GvEcR kurucu ifade ediyor. Teb-bağlı GvEcR çekirdeği translocate ve 10xUAS CISbağlama-MCS eklenen transgene ifade uyarmak için düzenleyici serilerini rol. (A) köşeli ayraçlar arasında (B) sıra bilgi pEUI(+) tüm efektör dizisi içerir. Oklar MCS dahil bireysel restriksiyon enzimi tanıma siteleri temsil eder. <a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig2.jpg"> Resim 2 . Tekil gen GvEcR tabanlı anahtar Teb tedaviye yanıt. HEK293 hücreleri ile belirtilen DNA transfected oluşturur. Transfection, 24 saat sonra hücreleri belirtilen konsantrasyon Teb ile 24 h için teşvik. EGFP transgene etkinlik floresan mikroskop altında gözlendi. PEUI(+) ile alay etmek transfectants(a)herhangi bir tespit Floresans gösterme veya (B) Teb tedavi olmadan. (C-E) PEUI (+) floresan yoğunluğu-EGFP-transfected hücreleri bir Teb doz bağımlı şekilde artırır. Ölçek bar, 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig3.jpg"> Şekil 3 . HEK293 hücreleri stabil barındıran pEUI (+) / bayrak-ANKRD13A cevap geri dönülebilir olarak Teb yönetim. BAYRAK epitope öğesini ANKRD13A ifade Teb (1,5 µM) tedavi tarafından tetiklendi. Teb ile tedavinin 24 saat sonra hücreleri belirtilen süreyi için Teb bırakma medyaya açık. ANKRD13A göreli miktarını Anti-bayrak antikor ile Western Blot tarafından ölçüldü. α-tübülin endojen ifade düzeyini anti-α-tübülin antikor ile bir denetim olarak ölçüldü. Beyaz Yıldız işareti kimliği belirsiz bir cross-reactive türü gösterir. <a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness at JoVE.com

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K Görüntüleme.  Chungnam National University. Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.

Video: An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genetik

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...