המחברים מודים S-Y צ'וי (האוניברסיטה הלאומית Chonnam) על קריאה יסודית של כתב היד והערות יקרי ערך. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של האוניברסיטה הלאומית Chungnam.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>בחר אתר הכרה של אנזים הגבלה המתאים (או אתרים) MCS של pEUI(+), subclone את הגן עניין בכיוון הרצוי (איור 1). הערה: ankyrin מתויג epitope EGFP או דגל חזור על תחום 13A transgene (ANKRD13A) היה subcloned EcoRI באתר של וקטור pEUI(+) באמצעות T4 DNA פולימראז ב רצף, מצדו-ללא תלות שכפול השיטה19.</li>
	<li>Linearize את pEUI(+) עם EcoRI עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. מערבבים 50 ng/µL של לליניארית pEUI(+) עם 40 ng/µL מוגבר-PCR EGFP או ANKRD13A, ולא להגיב עם T4 DNA פולימראז (1 U) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לפני דגירה על קרח במשך 10 דקות להוסיף 10 µL של תערובת התגובה ישירות אל µL 100 של DH10B תאים המוסמכת לשינוי הבאים הניסוי. הערה: למרות אנזים הגבלה במספר זיהוי אתרים נוספו של MCS של pEUI(+) (איור 1B), אנו ממליצים subcloning הגן היעד לאתר EcoRI, באמצעות מצדו תלויית-19,טכנולוגיה-שיבוט-20.</li>
	<li>לאמת את תותב על ידי רצף, ואז לטהר את הדנ א באמצעות ערכת טיהור DNA מתאים תרביות תאים.</li>
</ol>2. ארעי תרביות תאים וטיפול טב
<ol><li>להכין ארבעה תאים תרבות מאכלים (קוטר 60 מ"מ) המכיל תאים HEK293 passaged טרי ב 5 מ הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) בתוספת 5-10% סרום שור עוברית (FBS) ואנטיביוטיקה (פניצילין U/mL 100, 100 סטרפטומיצין µg/mL). להלן, "תא תרבות בינונית" או פשוט "תרבות בינוני" מייצג את DMEM בתוספת FBS ואנטיביוטיקה. לשמור על התאים HEK293 ב 37 º C.</li>
	<li>Transfect µg 1 של ה-DNA מטוהרים לתוך התאים HEK293 בצפיפות של 50-60 אחוז שימוש µL 3 של ריאגנט תרביות תאים. להוסיף 200 µL של diluent (DMEM ללא FBS ואנטיביוטיקה) הכימית תרביות תאים המכילים את ה-DNA. לאחר הדגירה של תערובת התגובה למשך 30 דקות ב- RT, להוסיף את התערובת התאים HEK-293 על המנה תרבות. השתמש שתי מנות על תרביות תאים, ולהשאיר שני האחרים לא מטופל כפקדים.</li>
	<li>לאחר 12-24 h של תרביות תאים, להוסיף טב (סופי ריכוזים, 0.2 - 10 µmol) לאחד הדגימות transfected וכדי אחד מהפקדים שאינם transfected. יוצאים שני מדגמים אחרים מטופל כפקדי ניסיוני. הערה: הפתרון מניות טב (50 מ"מ מומס דימתיל סולפוקסיד) יכול להיות מדולל תא תרבות בינוני, DMEM או באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב הריכוז המתאים לפני הוספת התאים בתרבית בהתאם לפרמטרים ניסיוני. עם זאת, בשל המסיסות נמוכה של טב ב תמיסה מימית, להימנע הכנת תערובת בסיס עם ריכוז גבוה של טב בינוני; במקום זאת, החלף המדיום התרבות התא מלא בינוני טריים המכילים טב-הריכוז הרצויה.</li>
	<li>לטפח את התאים שטופלו טב ולא טופלו עבור h 12-48-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>אם את EGFP באמצעות הוספת, לנתח את הביטוי EGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ( איור 2). אחרת, לקצור את התאים עבור וזמינותו immunoblotting.<ol>
<li>Immunoblotting וזמינותו, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח, ואז לגרד אותם החוצה באמצעות המגרד של התא.</li>
		<li>עבור לערום את התאים, ספין למטה יבולים צינור חרוטי 15 מ"ל ב g x 21,000 למשך 2 דקות ב 18-25 מעלות צלזיוס (RT).</li>
		<li>לאחר השמטת מגניב לגמרי, להוסיף 0.5 מ של ריאגנט החילוץ חלבון בתרבית של קרח (M-לכל), ביחד עם מעכב פרוטאז (5 µL של 100 x מעכב פרוטאז קוקטייל), בגדר אם התאים מתורבתים בקערה 60 מ מ.</li>
		<li>מחדש להשעות את התאים עם כמה סיבובים של pipetting ולאחר מכן דגירה התאים על תנאי למשך 15 דקות ב 18-25 מעלות צלזיוס (RT).</li>
		<li>לסובב את התא lysate ב 21,000 g x 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע מימית לתוך צינור microcentrifuge mL 1.5 טריים.</li>
		<li>לנתח את תגובת שיקוע על-ידי immunoblotting, פרוטוקולים סטנדרטיים הבאים נוגדנים המתאימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדור של שורות תאים HEK293 יציב עם אינטגרציה הגנומי של pEUI(+) מתג ג'ין
<ol><li>Transfect µg 5-10 של pEUI(+) מטוהרים עם transgene לתוך תאים HEK293 confluent 50-60% בצלחת תרבות תא בקוטר 90 מ מ, באמצעות µL 15-30 מהתרכובת תרביות תאים. להוסיף 500 µL של diluent (DMEM ללא FBS ואנטיביוטיקה) הכימית תרביות תאים המכילים את ה-DNA. לאחר הדגירה של תערובת התגובה למשך 30 דקות ב- RT, להוסיף את התערובת לתאים HEK-293 על המנה תרבות.</li>
	<li>לאחר תרביות תאים, לאפשר את transfectants לגדול ולהביע את המוצרים ג'ין puromycin-התנגדות מתחת לבינוני תרבות לא בררניים (ללא puromycin) עבור h 24-48-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>מביצועם תאים מן המנות תרבות על-ידי trypsinization. לאחר ביטול המדיום תרבות, לשטוף את transfectants עם PBS ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין/ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ולאחר תקופת דגירה של 1 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר שכבתה של טריפסין/EDTA על-ידי הוספת בינוני תרבות ומחוממת מראש (10 מ"ל, 37 מעלות צלזיוס), לקצור את התאים באמצעות המגרד של תא, ואחריו צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל ב g x 21,000 למשך 2 דקות ב 18-25 º C.</li>
	<li>מחדש להשעות את transfectants ב 50 מ של תרבות מראש ומחוממת בינוני (37 מעלות צלזיוס), העברת 10 מ"ל של התאים 90 מ מ תא טריים תרבות מנות. התרבות התאים ב 37 ° C עד 50-60% confluency לפני הטיפול puromycin (באופן כללי, זה לוקח כ 24-48 שעות).</li>
	<li>לטפח את transfectants ב 37 מעלות צלזיוס במדיום התרבות תאים בתוספת 3 puromycin µg/mL במשך 3-4 שבועות. במהלך תקופת הבחירה, לשנות את המדיום התרבות התא המכיל את puromycin (3 µg/mL) כל 2-3 ימים כדי לשמור על הלחץ הבחירה. כאשר התאים הופכים באופן מלא confluent, לפצל אותן הפרוצדורות הבאות ב שלבים 3.3-3.4, המכילות puromycin תרבות בינונית. למחוק את התאים הנותרים במדיום תרבות, אם אין צורך. הערה: תנאי הבחירה Puromycin חייב להקים השפעול לסוגי תאים מסוים. היינו 3 µg/mL של puromycin תא תרבות בינוני; זה היה מספיק כדי לגרום מוות של תאים ב- transfected HEK293.</li>
	<li>קציר תאים מן מושבות בודדות, באמצעות צילינדר שיבוט, ובצע הוראות היצרן.<ol>
<li>למחוק את המדיום התרבות תאים. יש לשטוף את הצלחת פעמיים עם ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) PBS כדי להסיר תאים צף.</li>
		<li>בעזרת מלקחיים סטרילי, להגדיר את הצילינדר שיבוט על המושבות בודדים.</li>
		<li>להוסיף 0.2 מ של 0.35% טריפסין/EDTA כל גליל.</li>
		<li>דגירה המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה עד התאים תלושים, ולאחר מכן להוסיף כמה טיפות ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) תרבות בינוני הצילינדרים.</li>
		<li>להעביר את התאים כל גליל בארות בודדים של צלחת 6-ובכן, עם 2 מ של תרבות בינוני, 1 µg/mL של puromycin כל היטב. הערה: כאשר התאים הופכים confluent, קנה המידה של התרבות. עכשיו אפשר להקים clone(s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשמור על שיבוטים בודדים במדיום התרבות תאים בתוספת 1 µg/mL של puromycin.</li>
	<li>אמת מושבות בודדות על-ידי בדיקת את רגישותם טיפול טב (הריכוז הסופי, 10 מיקרומטר) 24 ח' במבחן התגובה של השיבוטים כדי טב על-ידי ניתוח רמת הביטוי transgene עם immunoblotting. בחר שיבוט הרצוי (או שיבוטים). לטפח טב שטופלו ודגימת לא מטופל במדיום תרבות עבור h 12-48-37 מעלות צלזיוס לפני ניתוח הרמה אינדוקציה של transgene. ניתן למדוד את רמת הביטוי של transgene דרך immunoblotting, ביצוע הפרוצדורות בשלבים 2.5.1 - 2.5.7.</li>
</ol>4. דלדול של טב
<ol><li>להרוות את הגירויים טב על-ידי החלפת בינוני התרבות התא המכיל טב טב-חופשית בינוני. הערה: מומלץ להחליף התקשורת צמיחה בלי הראשון reseeding את התאים על גבי צלחת תרבות חדשה. טב שיורית מופיע לדבוק המנה פלסטיק וירתקו ביטוי רקע חזק transgene. לפני reseeding את התאים על צלחת תרבות חדשה, יש לשטוף את התאים שנקטפו מספר פעמים עם תרבות בינוני או PBS.<ol>
<li>מביצועם תאים מן המנות תרבות על-ידי trypsinization. לאחר השמטת את טב המכיל תרבות בינוני, לשטוף את התאים מגורה טב פעמיים עם PBS ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA ולאחר תקופת דגירה של 1 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. לאחר שכבתה של טריפסין/EDTA על-ידי הוספת ומחוממת מראש ללא טב תרבות בינוני (10 מ"ל, 37 מעלות צלזיוס), לקצור את התאים באמצעות המגרד של תא, ואחריו צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל ב g 21,000 x למשך 2 דקות ב 18-25 º C.</li>
		<li>מחדש להשעות את התאים ב- 50 מ של טרום ומחוממת טב ללא תרבות בינוני (37 מעלות צלזיוס), העברת מ של התאים לתוך שלוש מנות תרבות של תא טריים 60 מ מ. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24, 48, 72 שעות בהתאמה.</li>
		<li>לקצור את התאים בנקודות זמן שונות, למדוד את רמת הביטוי transgene באמצעות immunoblotting. הערה: בתנאים אלה ניסויית, הביטוי transgene הפך בלתי מורגשת תרבות שלאחר כ 3 ימים של התאים במדיום נטול טב תרבותית (איור 3). ניתן למדוד את רמת הביטוי של transgene מאת immunoblotting, לפי שלבים 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems.">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).</li><li>Clackson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+gene+expression+systems.">Regulated gene expression systems.</a> Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).</li><li>Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatable+lentiviral+system.">Gene regulatable lentiviral system.</a> Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP/mTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse.">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+and+mTOR:+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer.">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).</li><li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+mifepristone+(MFP).">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li><li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+mifepristone:+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies.">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li><li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes.">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li><li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptors+and+their+biological+actions.">Ecdysone receptors and their biological actions.</a> Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).</li><li>Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ligands+and+coligands+for+the+ecdysone-regulated+gene+switch.">Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).</li><li>Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor:+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression,+and+reduced+size.">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues.">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).</li><li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+regulation+of+zebrafish+gene+expression.">Small-molecule regulation of zebrafish gene expression.</a> Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).</li><li>Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-inducible,+ecdysone+receptor-based+gene+expression+system+for+plants.">Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants.</a> Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).</li><li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetOn+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Jeong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+sequence-+and+ligation-independent+cloning+as+a+rapid+and+versatile+cloning+method+for+functional+genomics+studies.">One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone-inducible+gene+expression+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).</li><li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+insecticidal+activity+of+benzoheterocyclic+analogues+of+N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide:+Part+1.+Design+of+benzoheterocyclic+analogues.">Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues.</a> Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).</li><li>Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse.">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li><li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide,+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist.">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li><li>McConnell, M. J., Imperiale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adenovirus+and+its+use+as+a+vector+for+gene+therapy.">Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).</li><li>Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+skin+diseases.">Gene therapy for skin diseases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).</li><li>Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Gene+Therapy:+Translational+and+Clinical+Outlook.">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li><li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats.">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li><li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter.">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li></ol>

יש לנו שאין ניגודי אינטרסים הקשורים בדו ח זה.

החיסרון העיקרי של שימוש בבורר ביטוי גנים בינארי הוא הצורך להעביר בו זמנית בשני פלסמידים נפרד (מנהל ההתקן ואת אפקטור) לתוך תא היעד. זה יכול להוביל שוויונית של פלסמידים ולהוביל והתגובה לא עקבי של המתג inducers1,2,3. חסרון נוסף של מערכת דו-וקטור הוא מינימום של שני סיבובים של הבחירה אנטיביוטי נדרשים לזהות מבטיח שורות תאים. לכן, קלטת ג'ין-inducible הכוללת יחידה אחת יש דומה לשימוש במחקר הביולוגי. הבורר ביטוי יחיד transgene pEUI(+) הכלול וקטור יחידה מצויד עם כל היחידות הרגולטוריות נדרש לגירוי transgene. לכן, רמת אינדוקציה של transgene, subcloned, pEUI(+), הוא תלוי כמות ה-DNA transfected ניסוי ארעי תרביות תאים, המינון של משרן כימי. בנוסף, בהמשך בדקנו את השימוש של וקטור pEUI(+) על ידי יצירת קו יציב תא המכיל עותק יחיד של transgene ANKRD13A 15. שורת התאים הוקמה הראו רגישות גבוהה לטיפול טב (איור 3). באופן קולקטיבי שלה רגישות גבוהה, הפיכות, leakiness נמוכה15, יחד עם וריאציה מוגבל ברמת הביטוי הופכים pEUI(+) כלי רב ערך מולקולרית, תאית מניפולציות היעד גנים.
בין המערכות השונות inducible ג'ין, בחרנו את הקלטת אינדוקציה של גנים תלויי-GvEcR. GvEcR יש כמה יתרונות על פני מערכות אחרות: ראשית, הטבע lipophilic של מספר תחליפי ecdysone משמש inducers כימי (כולל טב) יש יתרון לחדירה יעיל של ממברנות הסלולר21; שנית, ישנם אין orthologs EcR גולגולת, כך ecdysteroid אגוניסטים משפיעה לבטא את הפונקציה של endogenously רצפטורים גרעיניים21,22; שלישית, ecdysteroids הם לא מזיק גולגולת ואי במהירות מ זרימת הדם במערכת ויוו21,23; רביעית, מאז אגוניסטים ecdysone רבים פותחו עד כה, על-ידי בחירת מולקולות קטנות בגודל בצורה אופטימלית, חוקרים יכול למנוע סיבוכים בלתי רצויות13,22,24. למרות pEUI(+) מראה רגישות גבוהה כדי טב, בוחן את יכולת התגובה של pEUI(+) כדי אגוניסטים ecdysteroid אחרים שעשויים להועיל. קיומו של אגוניסטים EcR לא סטרואידיות, כגון methoxyfenozide, כי הם יותר מסיס במים מאשר טב24 עשוי להרחיב את היקף יישומים של pEUI(+). למרות הביטוי של transgene ב pEUI(+) הוא יחסית חלש יותר מאשר ב- ט-ב מערכת15, הרמה של אינדוקציה transgene יכול להיות מרובדת על ידי הוספת עותק מרובה של התחום transactivation VP16 (נתונים לא מוצג). יישומים טיפול גנטי האחרונות התמקדו בטוח המסירה של גן המטרה לתוך תאים או רקמות חסרי המוצר בהתאמה גן פונקציונלי בשל מחלה גנטית25,26,27. עם זאת, שאינו מוסדר transgene תחת השליטה של היזמים מכוננת רקמות ספציפיות או ויראלי יכול להפיק hyper-ביטוי של הגן היעד, אשר מעלה את האפשרות של רקמות מקומיות-נזק-28,-29. לפיכך, היישום של מתג ג'ין אמין עבור ריפוי גנטי יכול למנוע סיבוכים בלתי רצויים. וקטור pEUI(+) מספק כלי נוח ורב עוצמה כדי לשלוט transgene ביטוי במחקרים ביולוגית וקלינית. כיום, אנו מפתחים וקטור lentiviral ייחודי המבוסס על GvEcR כדי להגדיל את טווח היישום של המערכת שלנו.

מספר הגן שונה מתגי נחקרו על יכולתם לווסת דווקא transgene ביטוי תרבית תאים, מודלים, בדרגות שונות של הצלחה-1,-2,-3 מערכות מתג גנים פוטנציאליים צריך לעמוד בקריטריונים מחמירים שונים, כולל: ביטוי כיווני מדויק של transgene, המינון ותלוי זמן ההיענות inducers, leakiness זניח של האמרגן, הפיכות של transgene הפעלה באמצעות הסרת משרן משרן רמות רעילות נסבלת שורות תאים ו2,1,חיות מעבדה3. מספר מולקולה קטנה inducers נוצלה, כולל טטרציקלין4,5, rapamycin6,7,8,9,mifepristone10, ecdysone11,12,13,14. באופן כללי, מערכות אלו דורשים לפחות שני פלסמידים המכיל שתיים או שלוש יחידות ביטוי דיסקרטית, אחד או שניים מהם לחבר רכיב תקינה (משרן פלסמיד) המאגד של משרן מולקולה קטנה כדי לזכות פעילות גנים ברמת השעתוק; פלסמיד אחר (אפקטור פלסמיד) המכיל את transgene תחת השליטה של אזור DNA תקינה המאפשרת את הגישה של רכיב מאוגד משרן רגולטוריות. החיסרון העיקרי של מערכת בינארית היא שזה דורש המבוא בו-זמני של שני וקטורים (משרן ו אפקטור) לתוך תא היעד. בניסויים ביטוי transgene ארעי, תרביות תאים בו זמנית של פלסמידים 2 מייצרת באופן בלתי נמנע אוכלוסיה של תאים ביחידים transfected עם משרן או את אפקטור, או שיתוף transfected ושליחותם. בנוסף, השיטה הבינארית מחייב לפחות שני סיבובים של הבחירה אנטיביוטי כדי ליצור שורות תאים יציב, וזו ההגדרה המפורטת. לפיכך, המשלב את כל הרכיבים הדרושים עבור הביטוי transgene, תקנה לתוך וקטור יחידה יהיה אידיאלי להבטיח את הביטוי בו-זמני של כל הרכיבים הנדרשים בתא יחיד ולאפשר ויסות ביטוי transgene דרך הטיפול עם inducers מולקולה קטנה.
כדי להתגבר על החסרונות של ג'ין בינארי מתגים, לאחרונה פיתחנו מתג יחיד ג'ין, באמצעות דרוזופילה melanogaster ג'ין מבוסס-EcR מערכת inducible15. Ecdysone שמתווכת ביטוי גנים כאשר הוא נקשר אל heterodimer EcR/ultraspiracle (USP), אשר בתורו גורם עקידת EcR ה-DNA גורמים רגולטוריים3,11. הקולטן חוליות retinoid X (RXR), ortholog של חרקים USP, מגייס EcR ליצירת מטוס activator תעתיק פעיל16. לפיכך, עבור הביטוי יישוב של transgene חוליות תאים או רקמות, EcR RXR חייב להיות שותף ביטוי בו זמנית לפני להיות מגורה על ידי ecdysone או אגוניסטים שלו. מאז התכונה heterodimeric של הבורר גנים מבוססת-EcR שיכול להיות מושפע אנדוגני RXR רמה, Padidam et al. מוחלף על התחומים EcR DNA מחייב והפעלה heterologous GAL4 DNA מחייב, vmw65 חלבון וירוס הרפס סימפלקס (VP16) הפעלת תחומים דבוקה התחום מחייב ליגנד EcR, אשר לאחר מכן הפך להגיב RXR אנדוגני, נוצר homodimer של כדי לזכות פעילות גנים ברמת השעתוק17. הבורר גנים מבוססת-EcR היה עוד יותר משופר על ידי בניית חלבון chimeric מורכב תחום הפעלה VP16 מינימלי, בשילוב עם GvEcR, אשר נוצרו homodimer מקומית ציטוזול בהיעדרו של ecdysone אגוניסט, טב16, 18. באמצעות קשירה טב, GvEcR שונה לוקליזציה subcellular שלה ציטוזול את הגרעין לזהות מקדם היברידית מורכבת דג זברה E1b יזם מינימלי בשילוב זוגיים עשר חזר על הפעלת במעלה רצפים (UASs) ליזום שעתוק של ה-ג'ין היעד16.
כדי לפשט את הגן מבוססת-EcR שדווחה בעבר מפסיקים16,18, שילבנו בין התכונות בינארי של המערכת לתוך וקטור יחידה מצויד עם כל הרכיבים הנדרשים עבור מגרה transgene ביטוי ולאחר מכן המיועד הווקטור החדש שנוצר, pEUI(+) (מספר גישה GenBank: KP123436, איור 1A)15. אפקטור להגיב על הנהג GvEcR (להלן-התקן) מורכב טנדם עשר UAS חוזר ליד יזם מינימלי E1b ואחריו אתר שיבוט מרובים (MCS) עם רצפי זיהוי EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ו- AflII (איור 1B). בנוסף, כדי להקל על הבחירה של transfected תאים, puromycin מונחה יזם Nשל SV40-אצטיל-טרנספראז (PAC) ג'ין הושם בין האזורים אפקטור ונהג כדי לשמור על שורות תאים יציב (איור 1).
אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור אפנון ארעית ויציבה של הביטוי transgene תוך שימוש pEUI(+). בנוסף, אנו מספקים הוראות מפורטות לשימוש מוצלח של טב כמו אגוניסט ecdysone.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEUI(+)</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The patent license was transferred to TransLab Inc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gene-Fect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;">TLC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tebufenozide</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">S001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:71px;">SPL life science</td>
			<td style="width:119px;">11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse FLAG M2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-alpha tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">CP06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td style="width:71px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740410.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M-PER Mammalian Protein 
			Extraction Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Protease inhibitor Cock. III</td>
			<td style="width:71px;">T&#38;I</td>
			<td style="width:119px;">BPI-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

שליטה מדויקת של הביטוי transgene רצוי במחקרים ביולוגית וקלינית. אולם, בגלל התכונה בינארי של מתגים ג'ין מועסקים כיום דורשת ההעברה של שתי יחידות טיפוליות ביטוי במקביל לתא בודד, היישום המעשי של המערכת עבור ריפוי גנטי הוא מוגבל. כדי לפשט את המערכת ביטוי transgene, יצרנו מתג ג'ין כמנהל pEUI(+) המקיף ערכה מלאה של מודולי ביטוי transgene וקטור יחידה. הכוללת של התחום מחייב GAL4 DNA, ששונה EcR (GvEcR), תחום הפעלה מינימלית VP16 התמזגו עם תחום מחייב GAL4 DNA, כמו גם קולטן ecdysone דרוזופילה ששונתה (EcR), המתג פיתח גן מיוחד במינו הוא מאוד מגיבים אדמיניסטרטיבי משרן כימי באופן זמן ותלוי במינון. וקטור pEUI(+) הוא כלי רב עוצמה פוטנציאל לשיפור השליטה של הביטוי transgene המחקר הביולוגי והן מחקרים קליניים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור אפנון של ביטוי transgene ארעית ויציבה באמצעות וקטור pEUI(+) על ידי הטיפול של tebufenozide (טב). בנוסף, אנו חולקים חשוב הנחיות השימוש של טב משרן כימי.

הבורר מבוססי GvEcR ג'ין יחיד מתואר באיור 1A. וקטור pEUI(+) היה אופטימיזציה עבור הביטוי transgene מוסדר על ידי הטיפול עם טב. האזור אפקטור של pEUI(+) מורכב 10xUAS E1b יזם מינימלי ואחריו MCS המכיל אתרי זיהוי אנזים ההגבלה EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ו- AflII. אות poly(A) SV40 נוספה מאחורי MCS (איור 1B). גן PAC הוכנס בין האזורים אפקטור ונהג של pEUI(+) להתייעץ התנגדות puromycin.
כדי להעריך את פעילותן ואת leakiness של pEUI(+), אנו subcloned EGFP לתוך האתר EcoRI של MCS (pEUI(+)-EGFP), transiently transfected הבונה פלסמיד לתאים HEK293, וערך טב בריכוזים שונים עבור 24 שעות ( איור 2). בעוד וקטור מדומה transfectants לא הראה פלורסנט אותות בין טיפול טב (איור 2 א, ב'), pEUI (+)-EGFP transfectants הפך בהדרגה על ידי כמות מוגברת טב (איור 2C–F ). חשוב מכך, pEUI (+)-EGFP transfectants ללא טיפול של טב לא זכה סימנים לזיהוי EGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2C).
כדי לתת תוקף נוסף התגובה של pEUI(+) כדי טב, אנחנו subcloned גן דגל מתויג epitope ANKRD13A לתוך האתר EcoRI של pEUI(+), הועבר הבונה לתוך תאים HEK293, ועינו ואז לבחירה puromycin למשך 3 שבועות להקים קו התא הרצוי עם transgene ANKRD13A . ניתחנו את הביטוי של transgene ANKRD13A לאחר טיפול 24 שעות עם טב ו קו תא הוקמה הגיבו היטב (איור 3). עוד יותר להדגים את הפיכות הבורר גנים pEUI(+) מאת depleting טב מהתקשורת תרבותית. כפי שמוצג באיור3, ביטוי ANKRD13A לא היו יותר לזיהוי כאשר אנחנו תרבותי התאים בתקשורת ללא טב.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig1.jpg"> איור 1 . תרשים סכמטי של pEUI(+). (א) מפת וקטור pEUI(+) נבנה. מקדם CMV כוננים ביטוי המכונן של GvEcR. GvEcR טב מכורך translocate לתוך הגרעין ותקשור את 10xUAS ציס-מתנהג רצפים רגולטוריות לעורר הבעת transgene מוכנס לתוך MCS. מידע (ב') הרצף בין הסוגריים המרובעים ב (א) מכיל את רצפי אפקטור שלמה של pEUI(+). החצים מייצגים האתרים זיהוי אנזים הגבלה בודדים הכלולים של MCS. <a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig2.jpg"> איור 2 . מתג מבוססי GvEcR ג'ין יחיד מגיב לטיפול טב. HEK293 התאים היו transfected עם ה-DNA שצוין בונה. לאחר 24 שעות של תרביות תאים, התאים היו מגורה במשך 24 שעות ביממה עם טב-ריכוז המצוין. פעילות transgene EGFP נצפתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Transfectants מדומה עם pEUI(+) לא הראה שום קרינה פלואורסצנטית לזיהוי עם (A) (B) טב טיפול או בלעדיו. (C–E) עוצמת פלורסנט ב- pEUI (+)-EGFP-תאים transfected מגביר באופן תלוי מינון טב. סולם בר, 10 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig3.jpg"> איור 3 . HEK293 תאים stably מחסה pEUI (+) / דגל-ANKRD13A הפיכה להגיב הממשל של טב. דגל מתויג epitope ANKRD13A ביטוי נגרמה ע י טיפול טב (1.5 מיקרומטר). לאחר 24 שעות של טיפול עם טב, התאים הוחלפו למדיה הנשירה טב לסכום המצוין של הזמן. הכמות היחסית של ANKRD13A נמדדה על ידי סופג המערבי עם נוגדן אנטי-דגל. רמת ביטוי אנדוגני של α-טובולין נמדדה עם נוגדן anti-α-טובולין כפקד. הכוכבית לבן מציין זן cross-reactive לא מזוהה. <a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness at JoVE.com

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ecdysone המבוסס על קולטן מיוחד במינו ג'ין מתג עבור הביטוי מכוון של Transgene עם חוסן, הפיכות Leakiness זניח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אפנון הביטוי transgene באמצעות מתג יחיד ג'ין pEUI(+) על ידי טיפול tebufenozide.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K Views.  Chungnam National University. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אפנון הביטוי transgene באמצעות מתג יחיד ג'ין pEUI(+) על ידי טיפול tebufenozide.

Video: An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

ג'ין המועמד בדיקות במחקרים קליניים עוקבה ועם Genotyping מרובבת ספקטרומטר מסה

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...