Bu eser evrimsel bilimi ve teknolojisi (JPMJCR12W2 (yazar)), Grant-in-Aid (Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (MEXT), Japonya yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için JST, PRESTO (AI), çekirdek araştırma tarafından desteklenmiştir 26119708 (yapay zeka) ve 16 H 06480 (yazar)), bilimsel araştırma (A) (Japonya toplum bilim (JSP'ler) 24240049 teşviki (yazar)) ve genç bilim adamları (A) (JSP'ler 15 H 05326 (yapay zeka)) ve yenilikçi alanlarda "floresan bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid Canlı MEXT, Japonya ve Platform için dinamik yaklaşımlar yaşayan için MEXT, Japonya görüntüleme sistemi".

1. nesil istikrarlı hücre hatları ile Tol2 sistemi
<ol><li>
Plazmid vektörel çizimler (şekil 1A) transposase (Tol2) ifade vektör (pCAGGS-mT2TP) ile birlikte optogenetic Tol2 tabanlı modüllerin C2C12 hücrelere transfect. Tüm adımlar, kültür hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS) ve penisilin-streptomisin 37 ° c (tablo 1), aksi takdirde belirtilen % 5 CO2, huzurunda ile takıma DMEM orta ile.
	<ol>
<li>Trypsinized hücreleri hücre sayacı ile ve iyi bir 12-şey plaka başına plaka 5 x 104 C2C12 hücre transfection önce bir gün sayısı.</li>
		<li>Optogenetic Tol2 tabanlı vektörel çizimler (pAI177 veya pAI218), 0,125 μg ilaç seçimi vektörünün (pAI170) ve pCAGGS-mT2TP vektör 0.5 μg 0.375 μg lipofection reaktif kullanarak ortak transfect.</li>
		<li>Transfected hücre trypsinize ve onları bir gün transfection sonra 100 mm kültür yemekleri plakası.</li>
		<li>Exchange kültür orta kültür 100 mg/mL hygromycin ile desteklenmiş orta transfected hücreler için.</li>
		<li>Kültür hücreleri un transfected hücreleri ortadan kaldırmak 3 gündür. Orta değiştirmek gerekli olmadığını unutmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfected hücre trypsinize ve floresan proteinler seçimi için ifade hücreleri nüfusu arındırmak. PAI177 taşıyan alıcı hücreler için sıralama kapısı arıtma mCherry pozitif hücre nüfusunun yeşil-PE kanala ayarlayın. PAI218 taşıyan fotoğraf duyarlı gönderen hücreler için sıralama kapısı arıtma iRFP713 pozitif hücre nüfusunun APC kanala ayarlayın.</li>
	<li>(isteğe bağlı) Klonal hücre nüfus sınırlı seyreltme veya tek hücreli FACS tarafından sıralama gibi standart yöntemleri kurmak.</li>
</ol>2. fotoğraf-nüfus düzeyinde mühendislik hücreleri hassasiyeti değerlendirilmesi
Not: Bu bölümü qPCR ve Western Blot gibi biyokimyasal testleri tarafından mavi ışık aydınlatma üzerine Dll1 ligand proteinlerin dinamik indüksiyon kontrol etmek için bir protokolünü açıklar.
<ol><li>İnkübatörler veya ışık kaynakları olmadan ışık kaynaklı koşul veya karanlık bir koşul için iki tür sırasıyla ayarlayın. Set-up ışık-yoğunluğu bir mavi LED trans-ışık ölçer kullanarak ışığı, şekil 1B, gösterildiği gibi. Program zamanlamaları ve bir tek platalı mikro-denetleyicisine aydınlatma (şekil 1 c) için programlanabilir programları sağlayan bir denetim komut yükleme tarafından Işık Aydınlatma süresi.</li>
	<li>Hücre sayacı ile trypsinized hücreleri ve pAI218 ve pAI170 35-mm çaplı plastik kültür yemekleri (ışık durumu için 12'den fazla yemekler ve karanlık durum için 1 çanak) taşıyan plaka 1.0 x 105 fotoğraf duyarlı gönderen hücreleri saymak ve bulaşıkları ayarla İnkübatörler karanlık/ışık koşulları için ayırın. Yemekler kadar ayarladıktan sonra hücre lysates toplama kadar kapalı İnkübatörler kapıları tutun.</li>
	<li>Bir buçuk gün sonra kaplama, başlangıç ışık aydınlatma (hücrelerin % 80'den fazla olması bekleniyor Konfluent). İstenmeyen fotoğraf-stimülasyon önlemek için gün ışığına yapan hücreleri göstermek yok. Not: Aydınlatma için zamanlama deneyler bilerek bağlıdır. Unutmayın bir sürekli aydınlatma koşulu (e.g. 1-min süresi ve 10 dk aralıklarla 40 µmol/m2/s ışık-yoğunluğu ile) fotoğraf-indüksiyon ve o güçlü ışık aydınlatma basit bir denetim hücrelere zararlıdır için yeterlidir. Böylece, aydınlatma için zararsız parametreleri seçili olduğuna emin olun.</li>
	<li>Yaklaşık 2 gün sonra kaplama, cep-lysate 30 dk aralıklarla hazırlayın. Örnek yemekleri İnkübatörler on Ice ve hücre lysates daha ayrıntılı bir çözümleme için hazırlanıyor başlangıç için hareket ettirin.</li>
</ol>3. dinamik Gönderici-alıcı tahlil nüfus düzeyinde: Devresel_ödeme tarafından optik stimülasyon üzerine hücresel tepkilerin gerçek zamanlı izleme
<ol><li>Trypsinize ve standart yöntemlerle göndereni ve alıcısı hücre sayıları saymak. 1-mL süspansiyon 2, 5 x 104 alıcı ve 1,25 x 105 gönderen hücreleri (1:5 oranı) karıştırma Toplam hacim hazırlayın. Not: iş 2:1, 1:1, ya da 1:2 Gönderici-alıcı oranları da 1.5 x 10 toplam hücre sayısı ile5. 10
</li>
	<li>Plaka kültür orta ile 1 mM biyoluminesans içeren hücrelerde 24-şey siyah plakaların her şey karışık.</li>
	<li>Plaka okuyucu luciferase tahlil için hücrelerdeyse analiz ve çıkış sinyalleri kayıt sistemi için çok yüksek olmadığını doğrulayın. Not: Eğer çıkış sinyalleri 1 x 106 foton sayar/sn yüksek, onlar doymuş. Bu durumda, çıkış sinyalleri 1 x 106 foton sayar/sn düşük olan biyoluminesans en uygun değerlere konsantrasyonu azaltma.</li>
	<li>Plaka üzerinde kayıt sistemi ayarlayın ve bir kayıt programı (şekil 1 d) başlatın. Örneğin, ışık aydınlatma 18 h kayıt ayarladıktan sonra başlar. Not: Geçici filtreleme ortalama ve Çetinkaya-deniyordun filtreleme, hareketli detrending sinyalleri gibi dalga formları görselleştirme için yararlı ve tespitlerde zirve.</li>
</ol>4. dinamik Gönderici-alıcı tahlil tek hücre düzeyinde: gerçek zamanlı Optogenetic pertürbasyon kontrol altında tek hücreli tepkilerin görüntüleme
<ol><li>Plaka 0.5 x 105 alıcı ve 2. 5 x 27, mm, çapı, cam, taban 35 mm çap yemekleri üzerine 105 gönderen hücreleri. Bu karışım oranları ve bir toplam hücresini sayı (bir hücre yoğunluğu) doğru olarak ayarlanır emin olun.</li>
	<li>Bir gün kaplama sonra orta kayıt orta 2 mL ile döviz (fenol kırmızısı ücretsiz DMEM orta % 5 ile desteklenmiş FBS, penisilin-streptomisin ve 1 mM biyoluminesans) ve cam-base çanak mikroskobunun ayarlayın. Gerekirse, PBS (-) ile ölü hücreleri enkaz dışarı yıkamak. Not: Bu adımı karanlık bir durumda yapmak için tercih edilir.</li>
	<li>Bir çevre odası 37 ° C ve % 5 CO2ile donatılmış bir ters mikroskobu ayarlayın.</li>
	<li>Soğutulmuş bir CCD kamera ayarla. CCD sensör sıcaklığını hedef değeri (genellikle,-90 ° C) soğuduktan emin olun.</li>
	<li>
Otomatik Alım yazılımında görüntüler 5 dk aralıklarla ve daha fazla 288 yakalamak için "Çok boyutlu Timelapse" pencere için parametreleri belirleme (birden fazla gecede kayıt) zamanlar.
	<ol>
<li>"Çok boyutlu Timelapse" penceresini açın, bir ışıldama kanal ve yavaş 50 kHz okuma modu aşağı açılır menüden seçin ve 4 x 4 4-min pozlama ile binning ayarla. Okuma modu zayıf yayan kollarındaki ışık algılamak için okuma sesleri azaltmak için önemlidir yavaş 50 kHz modu için ayarlandığından emin olun.</li>
		<li>"Çok boyutlu Timelapse" penceresini açın, Floresans kanalları ve hızlı 1 MHz okuma modu aşağı açılır menüden seçin ve 2 x 2 400 ms pozlama ile binning ayarla. Okuma modu hızlı 1 MHz moduna Floresans görüntüleme için gereken süreyi azaltmak için ayarlandığından emin olun.</li>
		<li>"Al" düğmesini tıklatarak kayıt hızlandırılmış başlatın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tek hücreli izleri ışıldama kanalları hızlandırılmış film görüntü analiz yazılımı tarafından aşağıdaki gibi ayıklayın. Öncelikle, ışıma ve floresan yığın görüntüleri görüntü analiz yazılımı için görüntü veri alarak olun. Işıma görüntüler için gelen kozmik ışınları zamansal ortalamasına ("SpikeNoise filtre" olarak uygulanan), önceki ve sonraki kare piksel değerlerini yerine geçici bitişik görüntülerde piksel yoğunluklarda karşılaştırarak elde edilen sıcak piksel kaldırmak Bu işlenmiş görüntüler bir dağınık şekilde düzeltme uygulamak ve arka plan piksel değerlerini out-field sayısı her çerçeveden çıkarın. Sonra bir "bölge" ilgi belirlemek (ROI) her hücre, her zaman bir noktada floresan image için yatırım Getirisi Işıksaçan resimler için geçerlidir ve her yatırım Getirisi Işıksaçan yoğunluğunu ölçmek.</li>
</ol>

<ol><li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
<li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li>
<li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li>
<li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li>
<li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141(2012).</li>
<li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li>
<li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li>
<li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3(2010).</li>
<li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Gen ifade dynamics periyodik olarak 2-3 h ile denetlemek için bir yöntem gösterdik. Bu zaman-ölçek Tet tarih sistemi ve özgün aydınlatacağı sistemi de dahil olmak üzere diğer geleneksel sistemleri daha çok kısadır. Ultradian zaman ölçekleri ulaşmak için anahtar parametreleri yarı-hayat moleküler ürünleri fotoğraf kaynaklı, mRNA'ların ve proteinler vardır. Bu kinetik parametrelerin hücre tipleri ve türler üzerinde bağlı olabilir. Dizileri ve hedef proteinlerin işlevlerini değiştirmez Kinetik ayarlamak için başkalarıyla Hes1 3' UTR dizileri yerine bir düz ileri şekilde, çünkü. Diğer 3' UTRs pulsatil özellikle ilgi hücre desenleri arzu elde etmek için arayan, canlı-hücre dLuc tarafından ışık indüksiyon izleme iyi bir başlangıç noktası ve tarama ve doğrulama için kullanılır.
Işığa duyarlı hücreler günlük işleme hakkında en sık sorulan sorulardan biri. Çentik sinyal dinamik Gönderici-alıcı tahlil söz konusu olduğunda, biz bizim sistemleri (fotoğraf-indüklenebilir dLuc veya Dll1 hücreleri ve alıcı hücreleri) hücre çoğalması alter ve dinlenme için hızlı bir şekilde dönmek hücre pasajlar Oda ışıkları altında her gün yok başardık Birleşik hücreler için karanlık bir koşul taşındıktan sonra 6 saat içinde. Genler ilgi kader tayini faktörler varsa, sızan ifade hücresel başkalaşım teşvik veya hücrelerin Açılımları önlemek ve bu nedenle istenmeyen optogenetic pertürbasyon sırasında önlemek için kırmızı ışık ortamı kurmak için önemlidir hücre işleme.
Bu protokol için fotoğraf-indüklenebilir gen ifade kasetleri ile istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için yordamlar sunduk. Bu dinamik Gönderici-alıcı tahlil güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik bir adımdır. Bir-ebilmek iyice düşünüp taşınmak optogenetic modülleri giriş hücreleri için geçici transfection, ama o does değil iş-ultradian bakliyat nicel ölçümler için bizim ellerde de. UAS organizatörü kaset yol açar, karanlık bir koşulda bile nispeten yüksek düzeyde Sızan ifade taşıyan plazmidlerin geçici o transfection bulduk. Bu Sızan ifade yüksek bir arka plan olmadan herhangi bir ışık stimülasyon neden olur ve güvenilir bir ölçüm zamanı-tabii engellemektedir. İstikrarlı hücreleri oluşturmak için alternatif bir yöntem transfection12için uygun değildir hücre tipleri için yararlı olan bir lentivirus sistemidir. Klonal hücre hatları mevcut türdeş olmayan hücre hatları daha daha homojen yanıt, ama bir klonal nüfus bile, hücre yanıt-e doğru her zaman düzgün değildir: bazı hücreler stimülasyon ışık ve bu nedenle dağıtılmış bir düzeyde sunmak için ışık kaynaklı yanıt verme protein ifadesi. Bu değişken ifade hGAVPO protein ve/veya değişken flavin, ışık hGAVPO algılama için gerekli bir chromophore endojen bereket düzeyde olabilir.
Burada sunulan Protokolü gen ifade dinamikleri analiz için güçlü bir araç sağlar, ancak bazı sınırlamalar vardır. Bazı Floresans kanalları canlı-cep mikroskobu için mavi ışık stimülasyon ile uyumlu olmayan bir dezavantajıdır. Mavi ışık aydınlatma etkinleştirir mavi ışığa duyarlı proteinler hem de floresan proteinler, duyarlı olan yeşil ve sarı floresan proteinler (GFPs ve YFPs), dahil olmak üzere fotoğraf beyazlatma. Aksine, GFP görselleştirme floresan görüntü yakalama sırasında istenmeyen harekete geçirmek-in fotoğraf-duyarlı hücreler tetikleyebilir Mavi ışıklı uyarma gerektirir. Bright-alan (Faz-kontrast) ortam ışık kaynağı tarafından Imaging Ayrıca mavi ışık optogenetic deneyler ile uyumlu değil, ama bir görüntüleme için yeşil veya daha uzun dalga boyu ışık kaynakları kullanarak bu sorunu aşmak.
Dinamik Gönderici-alıcı tahlil diğer sinyal yolları soruşturma için yararlı olacaktır. Bir olasılık sistemleri sinyal salgılayan için bir uygulamadır. Bu tür analizleri için saflaştırılmış ligandlar mikro-sıvı cihazlarda uygulama alıcı hücreleri hassas geçici şekilde16,17uyarmak için alternatif bir yoludur. Ancak, bu yaklaşımlar gönderen hücrelerdeki ligand moleküllerin dinamik üretim süreçleri için erişilemez olur. Dinamik Gönderici-alıcı tahlil ile birlikte fotoğraf-indüklenebilir ligand ifade istihdam daha fazla sinyal iletim diseksiyon gönderenden gelen alıcı hücreler için olanak sağlayacak.

Hücre hücre iletişim gelişim süreçlerinde embriyonik desenlendirme kritik rol oynamaktadır. Omurgalı embriyo metameric yapıları somites olarak adlandırılan bölümleme saat1adı verilen bir zaman tutma saat kontrol altında kesin bir zamansal doğruluk ile ön-arka gövde ekseni boyunca oluşur. Bu işlem sırasında bir grup presomitic mesoderm (PSM) hücre düzenli olarak dönüştürülür somites zaman uyumlu bir şekilde. Bu işlem eşzamanlı salınım gen ekspresyonu içerir ve aynı somites aşamasında salınım PSM hücreleri oluşturur. Salınım gen ekspresyonu yaklaşık 2-3 h farelerde ve yaklaşık 30 dk içinde Zebra balığı dönemidir. Ayrışmış PSM hücreleri senkronizasyonu2,3kaybetmek, ama yeniden toplanmış oldukları zaman, onlar kendi kendine organize etmek ve nüfus senkronizasyonu4hücre-hücre kaplin eşitlenmiş için bir anahtar olduğunu düşündüren, yeniden elde etmek titreşimler.
Geniş çabaları Delta-çentik yolu sinyal molekülleri segmentasyon genlerine eşitlenmiş salınım için sıkıca bağlandığından emin saptandı. Farmakolojik inhibitörleri veya çentik sinyal, Genetik mutasyonlar osilatörler nüfusu desynchronize. Zebra balığı, DeltaC, DeltaD ve Notch1a, gibi bileşenleri sinyal çentik mutantlar zaman uyumsuz salınımlarını5,6görüntüler. Eşitlenmiş salınımlarını7,8,9için piliç ya da fare embriyo, sadece çentik ligand Delta-like1 (Dll1) aynı zamanda çentik modülatör deli fringe (Lfng) gereklidir. Gen düzenlemesi dinamikler geleneksel pertürbasyon zamansal çözünürlük araştırmak için yeterli değildi çünkü ancak, hücre hücre böyle molekülleri dinamik bilgi aktarımı için fonksiyonel yeteneğini test etmek zor olmuştur zaman ölçeği 2-3 h (ultradian ritimleri) süreçleri.
Biz son zamanlarda kontrol ve monitör gen ifade desenleri memeli hücreleri10entegre bir yöntem geliştirdik. Bu teknoloji, ultradian zaman-ölçeklerde periyodik ışık aydınlatma tarafından gen ifade darbeleri indüksiyon sağlar. Bu iletişim kuralı ışığa duyarlı hücre hatları kurmak ve hücre-hücre iletişim bağlamlarda izleme canlı hücre ışıldama tarafından muhabiri hücre dinamik yanıtlar gözlemlemek için yöntemleri gösterir. Bu yöntem diğer birçok sinyal yolları analiz için geçerlidir.

<table><tbody><tr><td>FACS</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FACSAriaII SORP</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>iKon M-934</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-81 ZDC</td><td></td></tr><tr><td>PMT device</td><td>Churitsu eletric corp.</td><td>CL24B-LIC/B</td><td></td></tr><tr><td>Blue LED illuminator</td><td>OptoCode</td><td>LEDB-SBOXH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08459-35</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>KRYSTAL24 (black 24 well plate )</td><td>Hi-tech</td><td>303012</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Potassium Salt</td><td>Nacalai</td><td>20028-24</td><td></td></tr><tr><td>Light meter</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>LI-250A</td><td></td></tr><tr><td>anti-HA-Peroxidase antibody</td><td>Roche</td><td>clone 3F10</td><td></td></tr><tr><td>anti-Actin-Peroxidase antibody</td><td>Wako</td><td>clone 2F3</td><td></td></tr></tbody></table>

an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions

Hücreleri düzgün geçici hücreleri çevreleyen gelen çeşitli faktörler tarafından etkilenmiştir ortamlar değişen yanıt vermesi. Yol sinyal çentik gibi temel moleküler makine normal embriyo gelişiminde önemli roller oynayan hücre hücre iletişim için biridir. Bu yolu bir hücre hücre transfer ultradian ritimleri ile salınım bilgi içerir, ancak moleküler biyoloji teknikleri ilerlemeye rağmen bu çok hücreli etkileşimler salınım gen üzerinde etkisini aydınlatmak için zor oldu dinamiği. Burada, optogenetic kontrol ve canlı gen ifade şekillerinin kesin bir zamansal biçimde izleme izin veren bir protokol mevcut. Bu yöntem başarıyla çentik sinyal, hücre içi ve hücreler arası periyodik giriş frekans ayarlama ve tek hücreli çözünürlükte değişen faz tarafından iç salınımlar trene binmek ortaya koydu. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlayan çeşitli sinyal yolları dinamik özelliklerini analiz için geçerlidir.

Biz fotoğraf kaynaklı gen ekspresyonu ile 2 - 3 h periodicity genetik osilatörler çalışma memeli hücrelerinde sağlayan aydınlatacağı sistemi11,12, uyarlanmış. Bu sistemi iki bölümden oluşur: fotoğraf-indüklenebilir transkripsiyon harekete geçirmek hGAVPO ve sürücü transkripsiyon ilgi rasgele genlerin için UAS organizatörü kaset. Fotoğraf kaynaklı gen ekspresyonu pulsatil Kinetik hızlandırmak için UAS organizatörü kaset polyA sırayla fare Hes1 3' UTR, fare fibroblastlar içinde 20 dk mRNA yarı ömrü kısalır tarafından değiştirildi.
Tri-cistronic vektörler Tol2 transposase sistemi temelinde istikrarlı hücre hatları kurmak, kullanılan13 (şekil 1A) oldu. Tol2 ifade vektör plazmid kaset14kromozom entegrasyon verimliliği arttırmak için esastır. Bu vektörel çizimler sadece da fotoğraf duyarlı protein hGAVPO ve floresan proteinleri (iRFP71315 veya mCherry) ifade kaset UAS-düzenleyici tarafından tahrik ışık-indüklenebilir genlerin ifade kaset taşırlar. Bu tasarım etkili plazmid ana bilgisayar genleri entegre hücreleri nüfusu arındırmak izin verdi.
Dll1 ligand proteinler mavi ışık aydınlatma (şekil 2A) üzerine üretmek fotoğraf duyarlı gönderen hücreleri kurduk. Bu amaçla, bir Tol2 sistemi tabanlı BI cistronic vektör (pAI218) kullanılmıştır. Dll1 ligand ışık aydınlatma üzerine indüksiyon denetlemek için hücre içinde gösterilen şekil 1B ve 1 Cprogramlanmış LED mavi ışık kaynakları ile donatılmış İnkübatörler kültürlü. Dll1 protein ifade dinamikler fotoğraf kaynaklı Western Blot analizi ile tespit temsilcisi sonuçları şekil 2B ve 2 Cgösterilir.
Giriş sinyal çentik için yanıt hücreleri oluşturmak için biz bozulma luciferase muhabir çentik efektör gene Hes1 ve phosphoglycerate organizatörü kontrol altında taşıyan bir Tol2 sistemi tabanlı BI cistronic vektör (pAI177) kullanılan kinaz (PGK) organizatörü tahrik çekirdeği lokalize kırmızı floresan muhabir H2B-mCherry. Bu durumda, floresan muhabir arıtma ve tek hücreli hızlandırılmış mikroskobu izleme için yararlıdır.
Fotoğraf-indüklenebilir gönderen hücreleri ve alıcı hücreler başarıyla oluşturulduktan sonra bu hücreler (şekil 2A) ortak kültür tarafından dinamik Gönderici-alıcı tahlil gerçekleştirmek hazırdır. Bu tahlil, çentik ligand protein Hızlı fotoğraf duyarlı gönderen hücreleri Dll1 mavi ışık aydınlatma üzerine taşımak endojen Hes1 osilatör ve bir bioluminescence Hes1 muhabir (fotoğraf-duyarlı alıcı hücrelerle birlikte kültürlü pHes1-dLuc) (şekil 2B). Alıcı hücreler komşu hücreleri tarafından sunulan Dll1 duyarlı olduğu çentik reseptör endogenously hızlı.
Dinamik Gönderici-alıcı deneyleri temsilcisi sonuçları şekil 2E ve 2Fgösterilir. Biz ilk foton sayma ve ışık stimülasyon ( için bir LED mavi ışık kaynağı için bir yüksek-duyarlı Foto-çarpanı tüp (PMT) ile donatılmış bir canlı hücre izleme sistemi bioluminescence kaydıyla alıcı hücrelerin dinamik yanıtlar algılamak için kullanılan Şekil 1 d). Bu sistem bioluminescence sinyalleri zamanlanmış ışık aydınlatma ile nüfus düzeyinde gerçek zamanlı kayıt sağlayan. Hücreler bu iki tür ortak kültürlü ve tekrarlayan ışık aydınlatma (30 s süresi, 2,5 h aralıklarla) maruz, alıcı hücreleri döngüsel yanıt oranları (şekil 2E) karıştırma çeşitli koşullarda tespit edildi. Bu örnekte, biz Çetinkaya-deniyordun (4th sipariş ve 13 bir veri noktası pencere) gürültülü sinyalleri azaltmak için filtre uygulanır. Tekrarlayan ışık aydınlatma (2 dk süresi, 2.75 h aralıklarla) ile hızlandırılmış mikroskobu, aynı zamanda alıcı hücreleri tek hücre düzeyinde ( şekil 2Fiçinde gri çizgiler) ve nüfus düzeyi (kırmızı çizgi şekil içinde eşzamanlı yanıt ortaya 2F). bu veri gönderen hücrelerdeki Dll1 proteinin döngüsel ifade alıcı hücreler komşu Hes1 salınım eşitlemek için yeterli olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57149/57149fig1.jpg"> Şekil 1: optogenetic tedirginlikler üzerine hücresel yanıt-e doğru çözümlemek için strateji. (A) şeması bu iletişim kuralı için kullanılan temsilcisi plazmid vektörel çizimler. Bu Plasmid'ler istek üzerine temin edilir. (B) 6-şey hücre kültür plaka altında mavi LED aygıtı ile donatılmış bir CO2 kuluçka makinesi bir fotoğraf. (C) şematik diyagramı bir elektrik devresi kontrol Güç LED ışık kaynağı için programlanabilir bir mikro-bilgisayar tarafından tedarik. Solid-state röle (SSR), açık/kapalı durumları açık/kapalı durumları LED ışık kaynağı mikro-bilgisayar dijital PIN-dışında geçiş için ayarlandı. (D) bir fotoğraf ve izleme sistemi bir canlı hücre bioluminescence şematik. Motorlu sahne karakter Devresel_ödeme dedektörü üst kısmında bir kayıt konumdan LED ışık kaynağı üst kısmında bir aydınlatma duruma taşıyabilirsiniz unutmayın. Ayrıca, devresel_ödeme dedektörü için de izlemek için taşıyabilirsiniz Not bireysel kuyulardan sinyalleri. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57149/57149fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57149/57149fig2.jpg"> Resim 2: optogenetic pertürbasyon deneyler örnekleri. Bu örneklerde, fare C2C12 myoblast hücre hatları kullanılmıştır. (A) şeması dinamik Gönderici-alıcı testin. (B, C) Işık kaynaklı Dll1 ifade tarafından Western Blot analizi analiz temsilcisi sonuçları. Dll1 proteinler 2,5 h nokta, 2 dk süresi ve yoğunluğu 24,7 W/m2periyodik ışık aydınlatma tarafından indüklenen. (D) floresan ortak kültür sisteminin gönderici ve alıcı hücrelerin görüntüsünü. (E, F) Dinamik Gönderici-alıcı tahlil sonuçlarını temsilcisi. (E) ödeme ile donatılmış canlı hücre izleme sistemi tarafından kaydedilen alıcı tepkilerin zamansal desenleri Toplam hücre sayısı 1.5 x 105 hücreleri için sabit ama oranları Gönderenler ve alıcılar arasında 5: 1'den 1: 2'ye dağıtıldı. (F) tarafından periyodik ışık aydınlatma (2 dk süresi, 2.75 h aralıklarla) indüklenen, salınım bilgi transfer gönderenden gelen alıcı hücrelere tek hücreli görüntüleme saptandı. 1.5 x 5:1 gönderen alıcı oranı 105 hücreler kullanıldı. Referans 10 uyarlanmış. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57149/57149fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions at JoVE.com

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

an-optogenetic-method-to-control-analyze-gene-expression-patterns

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

7.6K Görüntüleme.  Kyoto University. Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Video: An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Nörobilim

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Gelişim Biyolojisi

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate light-gated ion channels and pumps in neurons. While this bioluminescent optogenetics (BL-OG) approach confers a chemogenetic component to optogenetic tools, it is not limited to use in neuroscience. Rather, bioluminescence can be harnessed to activate any photosensory protein, thus enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells. A variety of luciferase-luciferin pairs can be matched with photosensory proteins requiring different wavelengths of light and light intensities.
Depending on the specific application, efficient light delivery can be achieved by using luciferase-photoreceptor fusion proteins or by simple co-transfection. Photosensory proteins based on light-dependent dimerization or conformational changes can be driven by bioluminescence to effect cellular processes from protein localization, regulation of intracellular signaling pathways to transcription. The protocol below details the experimental execution of bioluminescence activation in cells and organisms and describes the results using bioluminescence-driven recombinases and transcription factors. The protocol provides investigators with the basic procedures for carrying out bioluminescent optogenetics in vitro and in vivo. The described approaches can be further extended and individualized to a multitude of different experimental paradigms.

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescence-light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small-molecule substrate, a luciferin-can be harnessed to activate photosensory proteins, thereby adding another dimension to light stimulation and enabling the manipulation of a multitude of light-mediated functions in cells across temporal and spatial scales.

Biyolüminesan Optogenetik 2.0: Fotosensör Proteinleri In Vitro ve In Vivo'yu Aktive Etmek için Biyolüminesanstan Yararlanma

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

Biyokimya

Zebra Balıklarında Optogenetik Sinyal Manipülasyonu ile Gelişimin İncelenmesi

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Yazar Spotlight: Hücre Kaderi Kararlarını Çözmek için Zebra Balığı Embriyolarında Sinyalizasyonu Manipüle Etmek 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Biyomühendislik

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

A Light-Stimulation Grid Approach to Study Cellular Optogenetic Protein

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid

Our goal was to accurately track the cellular distribution of an optogenetic protein and evaluate its functionality within a specific cytoplasmic location. To achieve this, we co-transfected cells with nuclear-targeted cAMP sensors and our laboratory-developed optogenetic protein, bacterial photoactivatable adenylyl cyclase-nanoluciferase (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, when stimulated with 445 nm light or luciferase substrates, generates adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (cAMP). We employed a solid-state laser illuminator connected to a point scanning system that allowed us to create a grid/matrix pattern of small illuminated spots (~1 &#181;m2) throughout the cytoplasm of HC-1 cells. By doing so, we were able to effectively track the distribution of nuclear-targeted bPAC-nLuc and generate a comprehensive cAMP response map. This map accurately represented the cellular distribution of bPAC-nLuc, and its response to light stimulation varied according to the amount of protein in the illuminated spot. This innovative approach contributes to the expanding toolkit of techniques available for investigating cellular optogenetic proteins. The ability to map its distribution and response with high precision has far-reaching potential and could advance various fields of research.

This protocol involves transfecting cAMP sensors and bPAC-nLuc, an optogenetic protein, to accurately track its cellular distribution and response to light stimulation. The innovative approach of creating a cAMP response map using a point scanning system holds the potential for advancing research with optogenetic proteins in different fields.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem

Biyolüminesan Optogenetik 2.0: Fotosensör Proteinleri In Vitro ve In Vivo'yu Aktive Etmek için Biyolüminesanstan Yararlanma

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid