Bu eser R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) ve T32DK098107 tarafından desteklenmiştir (T.L.H. ve J.E.N.).

ana hatlar aşağı tüm hayvan iletişim kuralları'e göre vardır ve University of Maryland kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylı.
 1. embriyo hazırlık <ol><li>doğal çiftleşme aracılığıyla oluşturma embriyo <ol><li>kültür embriyolar için 3 ay-in yaş, üreme vade 5 , 8 .</li>
		<li>Ayırmak istediğiniz zorlanma yetişkin erkek ve dişi balık bölünmüş çiftleşme tankları embriyo koleksiyonu önce akşam ve 2 ve 3 erkek her tanka ekleyin. 
		Not: Transgenik insulin2a:mCherry floresan muhabir zorlanma kullanımına izin pankreas β-hücreleri analizini.</li>
		<li>Çiftleşme için transfer balık tank taze sistemi su ile ve hemen ertesi sabah ışıkları boşaldıktan sonra ayırıcıyı kaldırmak.</li>
		<li>Embriyo alt tankında gözlenir kadar doğal olarak çiftleşmeye balık izin. İstediğiniz miktarda toplanan kadar embriyo 30 dk aralıklarla toplamak. Mağaza her zaman noktası ayrı Petri yemeklerinde embriyo medya 28.5, toplanan ° C.</li>
		<li>Mikroenjeksiyon genetik malzeme veya yerleşim deneysel kültür medya 6 ' da, istenirse gerçekleştirmek ve taze Hank embriyo kültür &#39; s embriyo orta 8 10 cm Petri yemeklerinde 28.5 ° C'de Not: enjekte morpholino (PT) veya mutant hayvanlar gen ifade analizi için her manipülasyon gen ekspresyonu olası etkileri olabilir unutmayın. Mutantlar 9 hedefleme PT tabanlı gen tarafından gözlenen değil transkripsiyon düzeyinde genetik tazminat sergilemek.</li>
	</ol></li> <li>Sahne embriyo <ol><li>gruplar halinde embriyo kültür 50 &#8211; 75 embriyo tüm embriyoların tutarlı gelişim zamanlaması tanıtmak için 10 cm Petri kabına başına.</li>
		<li>İzlemek gelişimsel ilerleme 10 emin olmak için blastomere, epiboly ve somite aşamalarında diseksiyon mikroskop kullanarak gelişimsel morfolojisi. 
		Not: çanak gelişimsel gecikme önlemek için herhangi bir ölen veya hatalı biçimlendirilmiş embriyo çıkarın.</li>
		<li>Gelişimsel geçerlilik süresi temel embriyo ayırın. Somite numarasını kullanarak bölümleme (sonrası gastrulasyon 10.33 h sonrası döllenme (hpf)) sonra embriyo yaş yaklaşık 24 kadar ölçmek hpf. Sahne embriyo ve toplam vücut uzunluğu 24 sonra kullanarak larva hpf. 
		Not: Somites chevron şeklindeki Mezodermal doku embriyonun dorsal kısmındaki mevcut bulunur.</li>
		<li>Sıralanmış embriyo 28.5 ° C kuluçka makinesi yerleştirin ve geliştirme ilerlemeniz için istenilen yaş sağlar.</li>
	</ol></li></ol> 2. Tek hücreli ayrılma: Bütün embriyo ve hücre popülasyonlarının sıralanmış <ol><li>bütün embriyo ayrılma <ol><li>ötenazi Zebra balığı embriyoların istenen aşamada hiçbir hareketi gözlenen kadar 5-15 dakika buzda Petri kabına koyarak .</li>
		<li>Etiketli 1.5 mL microcentrifuge tüp bir havuzu 20 embriyo transfer. Herhangi bir fazla embriyo medya microcentrifuge tüpü çıkarması.</li>
		<li>Eklemek 200 µL lizis reaktif (Tablo malzemeleri görmek) embriyo içeren tüp. Mekanik bir havaneli ile kullanarak lysis reaktif embriyo lunaparkçı. Toplam hacim için 1 mL getirmek için 800 µL lizis reaktif ekleyin. -80 ° c RNA ayıklama kadar mağaza.</li>
	</ol></li> <li>Akışı sıralanmış hücre izolasyon 11 <ol><li>embriyo Petri kabına 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarmak ve mümkün olduğunca fazla embriyo orta kaldırmak. 
		Not: embriyo yaş bağlı olarak mekanik ayrışma da bu adımda gerekli olabilir. Embriyo ile &#62; 48 hpf, devam etmeden önce embriyo bütünlüğünü bozmaya bir havaneli kullanımı tavsiye ediyoruz.</li>
		<li>Kuluçkaya embriyo ile ayrılma arabelleği 1 1 mL (Tablo malzemeleri görmek) 1.5 mL microcentrifuge tüp. 15-30 dakika oda sıcaklığında için kuluçkaya. Çözüm yavaşça her 3-4 dk kuluçka adımı sırasında karıştırmak için P1000 ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından triturate. DEĞİL girdap mı.</li>
		<li>300 x g de 3 dk aralıklarla tarafından embriyo toplamak ve süpernatant kaldırın. Embriyolardan 1 mL ayrılma arabellek (Tablo malzemeleri görmek) 2 yeniden askıya alma. 15-30 dakika düzenli damlalıklı toz ile oda sıcaklığında için kuluçkaya.</li>
		<li>1-2 µL süspansiyon (FACS) arabellek mikroskop altında sıralama Floresans aktif hücredeki sulandrarak sindirim değerlendirmek. 
		Not: muayene aliquot tek hücreleri en az hücre kümeleri ve embriyonik doku parçaları gösterdiğinde tam sindirim oluştu.</li>
		<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x g 5 dk. Kaldır süpernatant için de toplamak. Hücreleri 1 mL FACS tampon ve yerçekimi filtre sindirilmemiş doku örneğinden kaldırmak için bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla yeniden askıya alma.</li>
		<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve yaklaşık 1 x 10 6 hücre/ml bir FACS tüp bir FACS arabellek ile sulandırmak. 
		Not: nispeten az sayıda embriyo (daha az toplamı %5) pankreas β-hücreleri gibi başı ile hücre tipleri için en az 1.000 sahne eşlemeli embriyo kullanın.</li>
		<li>Özelliği hücre süspansiyon örnekleri 1 mL içeren FACS tüpler gibi sadece lizis reaktif veya FACS arabellek içeren FACS tüp sayesinde sıralama FACS sağlar. FACS akışı floresan muhabir hızlı yalnızca tek hücreleri toplamak için sıralayıcı kapısı.</li>
		<li>Gerçekleştirmek FACS akışı sıralama istediğiniz hücre sayıları toplayana kadar. 
		Not: RNASeq gerçekleştirmek için işte toplam RNA gerekli en az. Biz 3.000-5.000 hücreleri yüksek kaliteli, yüksek konsantrasyon RNA yalıtmak için yeterli olduğunu bulduk.</li>
		<li>Kendine hakim hücre buza depolamak ve hemen RNA hazırlık için devam.</li>
	</ol></li></ol> 3. RNA hazırlık <ol><li>Ayıklamak RNA <ol><li>lizis reaktif oda sıcaklığında 5 min için toplanan örnekle (--dan adım 2) kuluçkaya.</li>
		<li>Ekle 0.2 mL kloroform her 1.0 mL lizis reaktif için kullanılan ve tüpler el ile oda sıcaklığında 2-3 dk 15 s. Incubate için tersine çevirin. 12.000 x g 15dk için de örnek 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>Ayrılmış, sulu faz için taze bir tüp aktarmak ve isopropanol için kullanılan lizis reaktif her 1.0 mL 0.5 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. 12.000 x g 10 dk de örnekleri 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>Yıkama ile % 75 etanol ve 7.500 x g 5 min için de örnek 4'te santrifüj kapasitesi ° C. süpernatant tamamen kaldırmak ve hava için oda sıcaklığında kuru sağlar. RNA 15-30 µL Dietil pyrocarbonate (DEPC) yeniden askıya alma-tedavi su.</li>
	</ol></li> <li>Arındırmak yüksek kaliteli RNA <ol><li>RNA süspansiyon 1/10 Cilt 3 M sodyum asetat (pH 5.5) ile birleştirmek ve 1 isopropanol hacmi. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya ve 12.500 x g 10 dakika için de örnek 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>Pelet buz gibi % 70 etanol DEPC tedavi su ile yıkama ve 10.000 x g 5 min için de örnek 4'te santrifüj kapasitesi ° C. tekrar bir kez yıkama adım.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak ve oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. DEPC tedavi suda yeniden askıya alma.</li>
		<li>Konsantrasyonu (ng/µL) ve Absorpsiyon spektrometresi kullanılarak saflık (260/230 oranı) ayıklanan RNA tahlil. 260/230 değeri olduğundan emin olun ~ 2.0 RNASeq işlemine devam etmeden önce. -80 ° C'de bize kadar saklamake (6 ay).</li>
		<li>RNA örnekleri göndermek bir satıcı ya da çekirdek için RNASeq ve gen ifade okuma sıralama, miktar dayalı analiz. Satıcıdan döndürülen sonuçlar genellikle transkript okuma örnekleri arasında önemli bir kat-değişiklik sergilenmesi genler listesi olarak sağlanan. 
		Not: belgili tanımlık yukarıda yöntem kalitesiz RNA belirtiyorsa bir sütun kullanılabilir. Tutarı, konsantrasyon ve RNA örnekleri için RNA bütünlük numarası (RIN) satıcı veya çekirdek ile onaylanması. Satıcı veya çekirdek RIN de genellikle değerlendirecek.</li>
	</ol></li></ol> 4. Yol ve gitmek dönem analizi Not: bkz: şekil 1 gen ifade analizi temsilcisi çıktısı için çekirdek veya satıcı tarafından sağlanan RNASeq sonra.
<ol><li><ol><li><ol><li>Açık tek bir deneysel koşula karşı denetim karşılaştırma Sıralama differentially genlerin ifade verileri bir elektronik tablo yönetim yazılımı (sonuçlar) (bkz: malzemeler tablo ).</li>
			<li>Yanındaki aşağı açılan oku seçin &#39; sıralama &#39; düğmesini tıklatın ve seçin &#34; özel sıralama &#34; deneysel kontrol koşulu karşı differentially ifade genler içeren elektronik tablo içinde.</li>
			<li>Altında kutusunu işaretleyin &#39; sütun &#39; açılır penceresinde ve göre sıralamak seçin &#39; LFC &#39; sütun. Emin olmak &#39; değerler &#39; içinde seçilen &#39; sıralama koşulu &#39; sütun. Gelen sıralamak için seçin &#39; büyükten küçüğe &#39; içinde &#39; sipariş &#39; sütun ve tıkırtı &#34; Tamam &#34;. 
			Not: Bu azalma ifade (negatif LFC) ile listenin alt kısmında görünür iken bu artan ifade (pozitif LFC) ile listesinin en üstünde görünmesi Bu differentially ifade genler sıralanır.</li>
		</ol></li> <li>Tek bir denetim için birden çok deneysel koşullar aşağıdaki gibi karşılaştırın.
		<ol><li>Seçin deneysel differentially belirlemek için 1 kontrol elektronik tablo karşı boş bir sütunda ilk hücreye iki deneysel koşullarda bulunan genler dile getirdi. Aşağıdaki eşitliği hücre içine yazın: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56187/56187eq1.jpg" /> Not: Bu denklem IF, EHATALIYSA, bir kombinasyonudur ve maç işlevleri. (i) KAÇINCI işlevi, kaçıncı (A1, Experimental2_vs_Control! Tümüne, 0), A1 değerini arar (ENSEMBL ID) Experimental2_vs_Control adlı elektronik tablo bir sütun (tümüne) içinde (Experimental2_vs_Control!). &#34; 0 &#34; için tam bir eşleşme, bakmak için gösterir ve tam bir eşleşme bulunursa, işlev değerini döndürür &#34; 1 &#34;, eşleşme bulunursa, bu işlev bir hata döndürür iken &#34; N/A &#34;. (ii) maç işlevinin sonucu sonra IsError işlevi, EHATALIYSA (maç (A1, Experimental2_vs_Control! giriş Tümüne, 0)), nerede, giriş ise &#34; 1 &#34; gösteren bir eşleşme bulundu, o-ecek dönmek &#34; yanlış &#34;, ve giriş ise &#34; N/A &#34; gösteren bir eşleşme bulunamazsa, o-ecek dönmek &#34; gerçek &#34;. (III) &#34; doğru &#34; ya da &#34; yanlış &#34; sonuç ise o zaman Eğer işlevi içine girişi (EHATALIYSA (maç (A1, Experimental2_vs_Control! Tümüne, 0)), &#34; &#34;, &#34; yinelenen &#34;), nerede, giriş ise &#34; gerçek &#34; gösteren bir eşleşme bulunamazsa, bu tırnak işareti ilk kümesi arasında değer döndürür (&#34; &#34;) boş olduğu ve bu nedenle hücre boş olacaktır. Giriş ise &#34; yanlış &#34; gösteren bir eşleşme bulundu, bu tırnak işaretleri ikinci kümesi arasında değer döndürür (&#34; yinelenen &#34;), ve hücre diyecekler &#34; yinelenen &#34;.</li>
			<li>Basın &#34; Enter &#34; ya da &#34; geri &#34; denklemi çalıştırmak için. Denklemi içeren hücreyi seçin ve hücrenin sağ alt köşesinde kutusunda tıklatın. Tıklayan fare tutun ve seçili alanı sütun aşağı tüm yol kadar son sürükleyebilir &#39; özellik kimliği &#39;, sütundaki her hücreyi denklemi için.</li>
			<li>Select &#34; özel sıralama &#34; yeniden tıklatarak sıralama ikinci bir düzeyde ekleyin &#34; + &#34; simge sol alt köşedeki. İlk kademede &#34; göre sıralama &#34;, sütun Seç altında &#34; yinelenen &#34;, sıralama koşulu Seç altındaki &#39; değerleri &#39; ve sipariş Seç altındaki &#39; Z-A &#39;. İkinci kademede &#34; sonra tarafından &#34;, sütun Seç altında &#39; LFC &#39;, sıralama koşulu Seç altındaki &#39; değerleri &#39; ve sipariş Seç altındaki &#39; büyükten küçüğe &#39; ve seçin &#34; Tamam &#34;. 
			Not: Bu ifade değişimin yönünü göre 4 gruplara genler listesi sıralanır. Ifade değişikliği hem de veya ters yönde aynı yönde olduğundan emin olmak için her iki deneysel koşullarda bulunan genler kontrol etmek önemlidir.</li>
			Önce veritabanlarında devam etmeden veya sonuçları bulundu değil <li>herhangi bir parantez gen sembolleri sütundan kaldırın. Gen sembolleri içeren sütunun tamamını seçin. Seçin &#34; düzenleme &#34; sonra &#34; yerine &#34;, açılan &#39; dosya &#39; menü. Türü &#34; (*) &#34; içinde &#34; Aranan: &#34; bar Değiştir penceresinin ve terk &#34; eski yerine koymak ile: &#34; boş bar. Seçin &#39; Tümünü Değiştir &#39; çıkarmak tüm örnek-in parantez için. 
			Not: * temsil herhangi bir sayıda karakter iki parantez program herhangi bir örnek vurgulanan hücrelerdeki bulmak için istenir ve parantez içinde herhangi bir örneğini arasındaki bu karakterin yerleştirerek, hiçbir şey, böylece bunları kaldırmayı ile değiştirilecek.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Belirleme yolları zenginleştirilmiş <ol><li>kopya kümesi için hangi bir gen sembollerin dilek panoya zenginleştirilmiş yolları belirlemek için. ConsensusPathDB 12 ' ye gidin. Seçin &#34; gen analizi ayarla &#34; Web sayfasının sol kenar, ardından &#34; aşırı temsil analiz &#34;.</li>
		<li>Yapıştırın genlerinde listesi &#34; gen/protein tanımlayıcıları yapıştırın &#34; kutusu. Seçme gen simge &#34; gen/protein tanımlayıcısı türü &#34; kutu ve tıkırtı &#34; devam et &#34;. Yanındaki kutuyu seçin &#34; yolu veritabanlarının tarafından tanımlandığı gibi yollar &#34; yolu tabanlı altında Ayarlar bölümünde. 
		Not: Arama için kullanılabilir veritabanları listesine dahil olmak üzere bir dizi seçenek analizi için görünür. Onlar en kurulan ve kapsamlı olarak Kegg ve Reactome veritabanları dışındaki tüm veritabanları de-seçmenizi öneririz. Giriş listesi ve p-değeri kesme ayarları ile en az çakışma da ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Bu ayarları varsayılan 2 gen en az örtüşme ve 0,01 p-değeri kesme bırakarak öneririz.</li>
		<li>Select &#34; zenginleştirilmiş kümeleri bulmak &#34; giriş listesinde genleri içeren yollar listesini elde etmek için. 
		Not: Ardından her yolu adını da dahil olmak üzere tablo formatında çıkış olacaktır &#34; küme boyutu &#34; (Toplam yol genlerinde sayısını gösteren), &#34; yer alan adaylar &#34; (o yolu olan genler giriş listesinde sayısını gösteren ), yanı sıra p-değeri ve q-değeri (FDR) ve hangi yol tespit veritabanı.</li>
	</ol></li> <li>Yolu ağları nesil <ol><li>belirlemek zenginleştirilmiş yolları yukarıda açıklandığı gibi.</li>
		<li>Tüm yol ağında her kutusunu görüntülenmeyecektir için yol adlarının yanındaki seçerek veya tıklatarak görselleştirmek için zenginleştirilmiş yolları seçin &#34; tüm &#34; altında &#34; seçin &#34; sonra seçim kutuları yukarıda sütun başlığını seçin &#34; Seçili ayarlar görselleştirmek &#34;. 
		Not: Eğer az 30 tüm yolları görüntülenmesi önerilir; yoksa 30 yollar büyük top 30 en zenginleştirilmiş yolları (Bu genler giriş listesinden en fazla içeren) seçmenizi öneririz.</li>
		<li>Ayarla &#34; göreli örtüşme &#34; ve &#34; adaylar paylaşılan &#34; filtreler, sayfanın üst ortasına ya kutusunu işaretleyip giren desirEd yüzde göreli veya bu daha uygun hale getirmek için daha sıkı olmak paylaşılan aday sayısı ile çakışıyor daha net ve seçme yolu ağları içinde &#34; uygulamak &#34;. 
		Not: En az bir göreli örtüşme 0.2, onları bağlamak için 2 yolları ve en az 2 paylaşılan adaylar arasında % 20 gen örtüşme belirten önerilir. Grafik göstergeyi Grafik göstergede sayfanın üst sol tıklayarak görülebilir.</li>
	</ol></li> <li>Zenginleştirilmiş GO şartlar belirlenmesi <ol><li>kopyalamak için bir dilek zenginleştirilmiş gen kaynakta panoya belirlemek grup gen sembolleri. Git &#39; git zenginleştirme çözümleme aracı &#39; Gene Ontoloji Konsorsiyumu 13 ' te. Gen simgelerin listesi altında sayfanın sol tarafındaki kutusuna yapıştırın &#34;, gen kimlikleri &#8230; &#34;</li> <li>Gen kimlikleri kutusunun altında listelenen kullanmak için git şartları grubunu seçmek: biyolojik süreci, moleküler işlevi veya hücresel bileşeni. (Önerilen) seçin &#39; biyolojik süreci &#39;. Seçin &#39; Danio rerio &#39; gitmek altında şartlar kutusunda ve'ı tıklatın &#34; gönder &#34;. 
		Not: Varsayılan p-değeri kesme 0,05 kullanarak önerilir.</li>
	</ol></li></ol> 5. Doğrulama qRT-PCR tarafından Not: bireysel genler önemli gen ifade RNASeq değişimler ile tanımlanan hedeflenen qRT-PCR Çoğalt deneylerde tarafından doğrulanmadı.
<ol><li>cDNA sentez <ol><li>Bölüm 3.1'açıklanan yöntemi kullanarak embriyo gelen RNA ayıklayın. RNA çıkarma.</li>
		<li>RNA'ın dönüştürmek 1 µg cDNA dönüştürme kullanarak cDNA için (bkz. Tablo reçetesi) kit. RNA, dNTPs ve transkriptaz enzimi birleştirir. Üreticiye göre thermocycler reaksiyonu gerçekleştirmek &#39; s belirtimleri.</li>
		<li>CDNA 1:3 DEPC tedavi su oranında seyreltin. 1-2 aya kadar 4 ° C'de mağaza.</li>
	</ol></li> <li>qRT-PCR doğrulama <ol><li>seçin genler tarafından qRT-PCR RNA sıralama sonuçları doğrulamak için. Genler yüksek kat değişiklikleri ifade tanımlar. Bu bol ifade belirttiği gibi bu genlerin de yüksek okuma sayıları içeren belirlemek.</li>
		<li>10-12 hedefleri yüksek kat üstü genler yüksek okuma sayısı listesini seçin. Tasarım en az 1 intron exon sınır yayılan hedef genlerin yükseltmek için astar.</li>
		<li>Gen veya gen hedeflenen bölgeye qPCR astar tasarım sitesi 14 girin. Seçin &#34; 2 qPCR astar tasarım &#34; ve astar kümesi oluşturmak için site ister. 
		Not: örnekleri arasında karşılaştırmalar normalize etmek gibi β-aktin, iç kontrol astar eklediğinizden emin olun. β-aktin astar F: 5 olan &#39; - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 &#39; ve R: 5 &#39; - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 &#39;.</li>
		<li>CDNA, ileri astar, ters astar ve polimeraz birleştirir. Genler 15 göreli ifade belirlemek için qRT-PCR güçlendirme gerçekleştirmek.</li>
		<li>Göreli mRNA ifade ilgi genlerin göreli miktar tayini 15 tarafından analiz.</li>
		<li>QRT-PCR fark ifade yön tutarlı olduğundan emin olmak için RNASeq sonuçları karşılaştırmak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).</li><li>Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).</li><li>Detrich, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196 (2012).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Rossi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+compensation+induced+by+deleterious+mutations+but+not+gene+knockdowns.">Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns.</a> Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>. IDT Primerquest Tool Available from: <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index">https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</a> (2017)</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+proteins+regulate+Notch+signaling+through+endosomal+trafficking.">Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).</li><li>Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O'Hare, E. A., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes.">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li><li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes.">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için açıklanan yaklaşım nispeten hızlı ve düşük maliyetli strateji bütün hayvanlar veya belirli sıralanmış hücre popülasyonlarının transcriptome düzeyi analizi için sunuyor. Zebra balığı avantajlı modeli çalışması bu tür için kolaylık ve malzeme, genetik uygulama kolaylığı veya çevre deneysel koşullar ve bir büyük kullanılabilirliğini başlayan büyük miktarda üreten içinde hız nedeniyle sağlar spektrum transgenik muhabir satır için hücre tipi özel ve doku özel örneğin alınma olasılığını izolasyon sağlar.
Burada ayrıntılı değil iken, bu yöntem doku bölümleri çocuk ya da yetişkin balık FACs ve toplama bir alternatif olarak toplanan kolayca alabilecek. Biz de sadece temel elektronik tablo komutları ve önceden varolan yol ve gitmek veritabanları kullanımına dayanıyor bir temel izleme analiz stratejisi geliştirdi. Bu yaklaşımın önemli avantajı bilgisayar programlama veya veritabanı yönetimi'nde üst düzey uzmanlık gerektiren olmadan erişilebilirlik kolaylığıdır. Bu nedenle, bu strateji tüm arka planlar büyük gen ifade veri kümelerinin bilgilendirici analiz için araştırmacılar için geçerlidir.
Bizim yaklaşım temel Zebra balığı embriyo ve larva kültür RNASeq tarafından izlenen standart RNA ayıklama teknikleri ile birleştirir. RNASeq yüksek kaliteli başlangıç malzeme büyük miktarda gerektirir; bazı satıcılar toplam RNA'ın 2 µg gerektirir. Sonuç olarak, nadir/kesintili hücre türleri veya tek tek embriyo analiz dışarı-in uzanmak var. Ancak, son beş yıldır düşük verimli analizleri, daha küçük örnekleri ve düşük RNA miktarlarda, üretilen veri kümeleri dramatik gelişmeler göstermiştir ve bu uygulamaların yakın gelecekte mümkün olacaktır bekliyoruz. Doğru sonuçlar, her iki teknik çoğaltır, Yani, ek sağlamak için tek bir örnek ve biyolojik çoğaltır, Yani, birden çok matings, üzerinden toplama embriyo iki RNA kitaplıkları oluşturma idealdir. Varyasyon örneklerinde için araştırmacılar denetlemek için aşağıdaki adımları izin ve tüm örneklerinde tanımlanan dizileri gerçek sonuçları, daha düşük bir okuma sayısı sonucu eksik düşük olasılığı daha yüksektir.

Küresel gen ekspresyonu karşılaştırmalı analizi için gözlenen fenotipleri katkıda roman genlerin tanımlamak için değerli bir araçtır. Bu tür analizler genellikle nicel değerlendirmesi arasında deneysel karşılaştırıldığında transkript bereket itimat ve kontrol örnekleri. Hedeflenen yaklaşımlar, qRT-PCR gibi nispeten hızlı ve doğru tek gen ifade değişikliklerin incelenmesi için. RNA sıralama (RNASeq) gen ifade örnekleri, yapım o şimdi böyle araştırmalar için standart deneysel sistemleri arasında arasındaki önemli değişiklikleri tanımlamak için geniş, hipotez-Alerjik bir yaklaşım sunmaktadır.
Zebra balığı birçok hastalığı alanda genelinde önemli bir model olarak ortaya çıkmıştır. Başlangıçta gelişim biyolojisi çalışmaları, yüksek verimlilik ve bakım, nispeten düşük maliyeti nedeniyle onların yardımcı programı için geliştirilmiş Zebra balığı deneysel kullanımı fenotipleri gelen embriyonik olarak yetişkin aşamaları de için geniş bir eklemek gelmifltir bir 1,2,3dizi moleküler deneyleri. Nitekim, bu avantajları moleküler mekanik çalışmalar hızlı yapmak ve büyük miktarda malzeme edinme kolaylığı nedeniyle düşük maliyetli yaşam tüm aşamaları, genetik ve çevresel işleme kolaylığı ile kombine. Ayrıca, Zebra balığı embriyo ve larva şeffaf doğası vivo içinde görselleştirme ayrı hücre nüfus4sağlayan hücre ve doku özel transgenik muhabir satırları oluşturmak için ideal hale. Bu satırları sömürü küresel gen ifade analizi muhabir gen ifade üzerinde temel alan belirli izole hücre türlerine izin verir.
Burada RNASeq sonra Zebra balığı embriyo kültürü kullanarak küresel gen ifade analizi için kapsamlı bir iletişim kuralı mevcut. Morpholino (MO) dahil olmak üzere genetik deneysel manipülasyonlar-tabanlı geçici gen nakavt veya CRISPR-aracılı genom düzenleme, sunulmuş başka bir yerde5,6,7. Biz bu nedenle veya RNA izolasyonu bütün embriyolar için detaylı bir protokol odaklanmak transgenik muhabir ifade hücreleri RNASeq sonuçları yol araçları ve gen Ontoloji (GO) terimleri kullanarak basit hesaplamalı analiz tarafından takip sıralanmış. Son olarak, nicel ters transkriptaz PCR (qRT-PCR) tarafından gen ifade değişiklikleri doğrulama için bir strateji dahil ettik. Bu protokoller deneysel koşullar, genetik mutantlar veya çevre koşullarının karşılaştırılması dahil olmak üzere geniş bir tabi Zebra balığı embriyolar için geçerlidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriZol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>dissociation buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSMax</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T200100</td>
			<td>dissociation buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FirstStrand cDNA conversion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td>cDNA conversion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td>qRT-PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-105-9042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuebingen</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ins2a:mCherry</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polypropylene tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consensus Path DB</td>
			<td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Enrichment Analysis</td>
			<td colspan="2">http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish

Küresel gen ifade değişiklikleri yeni yollar gözlenen fenotipleri temel tanımlamak için değerli bir araç analizidir. Zebra balığı yalıtım hayvanlar çok sayıda gelen RNA'ın bütün hayvan veya tek tek hücre popülasyonlarının kolaylığı nedeniyle gelen tüm transcriptome hızlı değerlendirilmesi için mükemmel bir modeldir. Burada küresel gen ifade analiz Zebra balığı embriyo RNA sıralama (RNASeq) kullanarak bir protokol sunulmuştur. Biz hazırlık RNA'ın bütün embriyo veya hücre içinde Transjenik hayvanlar sıralama kullanarak elde edilen hücre popülasyonlarının tanımlamak. Biz de zenginleştirilmiş yolları ve gen Ontoloji (GO) koşulları küresel gen ifade veri kümesi tanımlamak için RNASeq veri çözümlemesi için bir yaklaşımı açıklamak. Son olarak, nicel transkriptaz PCR (qRT-PCR) kullanarak gen ifade değişiklikleri doğrulamak için bir protokol sağlar. Bu protokollerin denetim karşılaştırmalı analizi ve deneysel Zebra balığı kümesi için roman gen ifade değişiklikleri tanımlamak için kullanılabilir ve moleküler fenotipleri ilgi içgörü sağlamak.

Differentially sıralanması genlerin ifade:
Alström sendromu ve Bardet-Biedl Sendromu (BBS) Zebra balığı modellerinin larva aşamasında differentially ifade genlerin tanımlamak için biz de alms1 hedef veya ek yeri engelleme-ecek içine enjekte edilerek bbs1 transkript önceden doğrulanmış vahşi-türü Zebra balığı embriyo16,17. Fertilizasyon (dpf) 5 gün post, RNA'ın iki çoğaltır MO, denetimle enjekte embriyo yanı sıra her koşul yukarıdaki Bölüm 3'te açıklandığı gibi elde. RNA her örnekten bir derinliğe kadar sıralı ~ 120 milyon okur ile ~ 107 milyon Zebra balığı genom hizalanmış okur. Genom eksonik bölgeler için eşlenen hizalanmış okuma % 85-90 arasında.
1.348 toplam genler Alström modelinde önemli ölçüde değiştirildi ve 471 toplam genler BBS modelinde önemli ölçüde değişti. Gen ifadesinin modelleri veya değişiklikleri modellerinden birini benzersiz arasında paylaşılan değişiklikleri Bölüm 4.2 anlatıldığı tespit edilmiştir. 1,084 toplam genler Alström modelinde benzersiz olarak değiştirildi, 612 yukarı düzenlenmekte ve 472 aşağı düzenlenmekte ve 207 genler BBS modeli, 176 yukarı düzenlenir ve down-regüle 31 (Şekil 2, Tablo S1ve Tablo S2) benzersiz olarak değiştirildi. Her iki model önemli ölçüde değiştirilecek 264 genler bulundu, 73 yukarı düzenlenir ve 182 aşağı düzenlenir ve 9 ters değişiklikleri ifade (Şekil 2, Tablo S1ve S2 tablo (bkz: iki model arasında gösterdi Ek Tables.xlsx)). İki model arasında differentially ifade gen tutarsız numaraları bbs1 ve alms1 farklı geliştirme aşamalarında etkileme öneririz.
İlginçtir, daha az sayıda gen değişiklikleri BBS modelindeki önermek o alms1 5 dpf aşamada gelişiminde önemli bir rol rol şilep ile adaya Alström modelindeki differentially ifade genler çok sayıda öneririz bbs1 bu saat noktada önemli olmayabilir. Buna ek olarak, önceki transcriptomic analizleri 2 dpf, ters18önerdi.
Zenginleştirilmiş yolları ve gen kaynakta Alström sendromu, Zebra balığı modeli belirlenmesi:
Daha iyi bir şekilde Alström modeli moleküler profil aydınlatmak için yollar ve zenginleştirilmiş differentially ifade genlerinde gen kaynakta tespit edilmiştir. Zenginleştirilmiş yolları ConsensusPathDB sorgulayarak belirlenmiştir ve zenginleştirilmiş Gene kaynakta bölümleri 4.3-4.5 içinde açıklandığı gibi Gene Ontoloji Konsorsiyumu sorgulayarak belirlenmiştir. Alström içinde yukarı düzenlenir genler arasında en yüksek oranda zenginleştirilmiş, model tarafından genlerin numarası veya zenginleştirme, etmedik analiz edildi. 31 toplam yolları Alström modelinde yukarı düzenlenir. "Metabolizma" geniş gruplama bir yana, en çok etkilenen yolları 32 ile 20 gen, doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemiyle idi (şekil 3A). Olaylar da vardı sinyal aşağı akım β-hücre reseptör bağışıklık sistemi up-yönetmelikte bu model öne zenginleştirilmiş. Birkaç sinyal yolları da Alström modelindeki Alström Sendromu Derneği ile birincil cilium disfonksiyon, hücre (şekil 3A) önemli bir sinyal gönderme Merkezi ile tutarlı yukarı düzenlenir genler arasında zenginleştirilmiş. Buna ek olarak, yukarı düzenlenmiş üç yolları insülin salgılanması ile ilişkili: yağ asitleri bağlı GPR40, serbest yağ asitleri ve asetilkolin (şekil 3A). Bu son derece penetrant insülin direnci ve tip 2 diyabet fenotipleri Alström hastalarda ile tutarlıdır. Altı git şartları Alström modelinde, eritrosit farklılaşma, eritrosit Homeostazı, myeloid hücre homeostazı ve homeostatik işlemleri (şekil 3B) de dahil olmak üzere yukarı düzenlenir genler arasında zenginleştirilmiş. Yukarı düzenlenir yolları içe değerlendirmek için modeli yukarı düzenlenir yolları yapıldı Alström yol ağının (şekil 3 c) oluşturulur. Birbirine bağlı yollar büyük düğüm bağlantısı bağışıklık sistemi ile ilgili ve küçük düğümlerden biri üç insülin yasal yolları arasındaki bağlantıyı ortaya iken sinyal yolları arasında yüksek derecede saptandı. Son olarak, her iki up - veya aşağı-düzenlenmiş Alström modeldir idi 5 gen hedefleri değerlendirilmesi RNASeq tarafından tanımlanan gen ifade değişiklikleri doğrulanmadı. Gen ifade değişiklik yapmasına qRT-PCR atıklarla, gck, bmb, btr26, ve ifi35, denetime göre yön RNASeq (şekil 4A-B) tarafından gözlenen recapitulated.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56187/56187fig1.jpg"> 
Şekil 1. Gen ifade analiz sonra çekirdek veya satıcı tarafından sağlanan RNASeq temsilcisi çıktı. Özellik kimliği ENSEMBL gen kimlik numarasını gösterir. Okuma sayıları okuma Denetim veya genom bu gen için hizalı deneysel örnekleri sayısı gösterir. Kat değişim ve kat değişim günlüğü deneysel arasında gen ifade değişiklik derecesini belirtmek ve örnek'a deneysel örnek yönde ifade pozitif (artış) kontrol veya ifadede (azalış) negatif deneysel örnek yönde. P-değeri ve FDR sonuçları önemini belirlemek için istatistiksel testler. RNASeq deneyler için daha sıkı FDR değeri 0,05 önem belirlemek için kullanılır. Gene_symbol NCBI gen kimliği gösterir ve gene_name gen tam adını listeler. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56187/56187fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56187/56187fig2.jpg"> 
Şekil 2. Differentially ifade BBS ve Alström modelleri genlerinde. Genler yukarı düzenlenir (kırmızı) veya aşağı düzenlenir (sarı) alms1 enjekte MO (yeşil) embriyo, bbs1 enjekte MO (turuncu) embriyo veya standart kontrol enjekte MO embriyolar için karşılaştırıldığında her iki numarası. * Genleri ikimiz de değişti ama ifade değişimler karşısında olan süreyi gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56187/56187fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56187/56187fig3.jpg"> 
Fkullanarak 3. Upregulated yolları ve zenginleştirilmiş GO açısından Alström modeli. (A)Upregulated yolları genler sayısına göre. (B) Upregulated gidin kat zenginleştirme tarafından şart. (C) yolu bağlantısı upregulated yollar Alström modeldir. En az %20 tarafından belirlenen yol bağlantıları yolları arasında gen paylaşılan ve en az 2 genlerin örtüşmesi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56187/56187fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56187/56187fig4.jpg"> 
Şekil 4. gen ifade değişiklikleri doğrulanmasını qRT-PCR. Gen ifadesinin RNASeq tarafından tanımlanan değişimler 5 dpf embriyo yaş ve tedavi eşleşen denetim, alms1 veya bbs1 mo(a)alt mRNA ifade qRT-PCR kullanarak genlerin gösterilen genlerin ile enjekte teyit edildi. (B) eşdeğer veriler okunur gösteren RNASeq dataset nesnesinden sayar. Tüm veri denetimi göre vardır ve qRT-PCR aktin için normalleştirilmiş. atıklarla, asteroit homolog 1; Gck, glucokinase; BMB, brambleberry; btr26, kana susamış ilgili gen ailesi, üye 26; ifi35, interferon kaynaklı protein 35. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56187/56187fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish at JoVE.com

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

Bu iletişim kuralı Zebra balığı embriyolar, larva, Bütün transcriptome analiz için bir yaklaşım sunar veya hücre sıralanır. RNA izolasyonu, RNASeq veri yolu çözümlemesi ve qRT PCR dayalı doğrulama gen ifade değişiklikleri içerir.

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.7K Görüntüleme.  University of Maryland School of Medicine. Bu iletişim kuralı Zebra balığı embriyolar, larva, Bütün transcriptome analiz için bir yaklaşım sunar veya hücre sıralanır. RNA izolasyonu, RNASeq veri yolu çözümlemesi ve qRT PCR dayalı doğrulama gen ifade değişiklikleri içerir.

Video: Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genetik

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, underlies the only known cure of human immunodeficiency virus (HIV-1) infection, and shows immense promise in the treatment of genetic diseases such as beta thalassemia. Our group has developed a protocol to model HSPC gene therapy in nonhuman primates (NHPs), allowing scientists to optimize many of the same reagents and techniques that are applied in the clinic. Here, we describe methods for purifying CD34+ HSPCs and long-term persisting hematopoietic stem cell (HSC) subsets from primed bone marrow (BM). Identical techniques can be employed for the purification of other HSPC sources (e.g., mobilized peripheral blood stem cells [PBSCs]). Outlined is a 2 day protocol in which cells are purified, cultured, modified with lentivirus (LV), and prepared for infusion back into the autologous host. Key readouts of success include the purity of the CD34+ HSPC population, the ability of purified HSPCs to form morphologically distinct colonies in semisolid media, and, most importantly, gene modification efficiency. The key advantage to HSPC gene therapy is the ability to provide a source of long-lived cells that give rise to all hematopoietic cell types. As such, these methods have been used to model therapies for cancer, genetic diseases, and infectious diseases. In each case, therapeutic efficacy is established by enhancing the function of distinct HSPC progeny, including red blood cells, T cells, B cells, and/or myeloid subsets. The methods to isolate, modify, and prepare HSPC products are directly applicable and translatable to multiple diseases in human patients.

The goal of this protocol is to isolate nonhuman primate CD34+ cells from primed bone marrow, to gene-modify these cells with lentiviral vectors, and to prepare a product for infusion into the autologous host. The total protocol length is approximately 48 h.

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...