Os autores agradecer S-Y Choi (Universidade Nacional de Chonnam) comentários valiosos e leitura minuciosa de nosso manuscrito. Este trabalho foi financiado por um fundo de pesquisa da Universidade Nacional de Chungnam.

1. o Transgene Subcloning
<ol><li>Escolha um local de reconhecimento de enzima de restrição apropriada (ou sites) em MCS de pEUI(+) e subclone o gene de interesse na direção desejada (Figura 1). Nota: O ankyrin epítopo-tag EGFP ou bandeira repete domínio 13A (ANKRD13A) transgene foi subcloned no sítio de EcoRI do vetor pEUI(+) usando T4 DNA polimerase em uma sequência e ligadura-independente de clonagem método19.</li>
	<li>Linearizar o pEUI(+) com EcoRI durante 1 h a 37 ° C. Mix 50 ng / µ l de linearizada pEUI(+) com 40 ng / µ l de PCR amplificados EGFP ou ANKRD13A e reagir com T4 DNA polimerase (1 U) por 1 min à temperatura ambiente (RT) antes de incubação no gelo durante 10 min. adicionar 10 µ l da mistura diretamente a 100 µ l de reação DH10B células competentes para a transformação seguinte experimentam. Nota: Embora vários sites de reconhecimento da enzima de restrição foram adicionados para o MCS do pEUI(+) (figura 1B), recomendamos subcloning gene do alvo para o site da EcoRI, independente da ligadura clonagem tecnologia19,20.</li>
	<li>Verificar a inserção de sequenciação e depois purificar o DNA usando um kit de purificação de DNA que é apropriado para transfeccao.</li>
</ol>2. transientes do Transfection e tratamento Teb
<ol><li>Prepare quatro pratos cultura celular (60 mm de diâmetro) contendo recém passadas HEK293 células em 5 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) suplementadas com 5-10% de soro fetal bovino (FBS) e antibióticos (100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL). Daqui em diante, "meio de cultura celular" ou simplesmente "meio de cultura" representa o DMEM suplementado com FBS e antibióticos. Manter as células HEK293 a 37 ° C.</li>
	<li>Transfect 1 µ g de DNA purificado dentro das células HEK293 com densidade de 50-60% usando 3 µ l de reagente de transfeccao. Adicionar o reagente de Transfeccao para 200 µ l de diluente (DMEM sem FBS e antibióticos) que contém o DNA. Após a incubação da mistura reacional durante 30 min à RT, adicione a mistura de células HEK-293 sobre o prato de cultura. Usar dois pratos para transfeccao e deixar os outros dois não tratada como controles.</li>
	<li>Após 12-24 h de transfeccao, adicione Teb (concentrações finais, 0.2 - 10 µmol) para uma das amostras transfectadas e um dos controles não-transfectadas. Deixe as outras duas amostras não tratadas como controles experimentais. Nota: A solução estoque Teb (50mm dissolvido em Dimetilsulfóxido) pode ser diluída em meio de cultura celular, DMEM ou fosfato salino (PBS) a uma concentração adequada antes de adicionar a culturas de células de acordo com os parâmetros experimentais. No entanto, devido a baixa solubilidade de Teb em solução aquosa, evite preparar uma mistura de mestre com uma alta concentração de Teb no meio; em vez disso, substitua o meio de cultura de célula completa com meio fresco contendo Teb na concentração desejada.</li>
	<li>Cultivar as células Teb-tratados e não tratadas por 12-48 h a 37 ° C.</li>
	<li>Se usar o EGFP inserir, analise a expressão EGFP sob um microscópio fluorescente ( Figura 2). Caso contrário, colhem as células para um ensaio de immunoblotting.<ol>
<li>Para o ensaio de immunoblotting, enxágue as células duas vezes com PBS gelado e depois raspá-los com uma espátula de célula.</li>
		<li>Para empilhar as células, spin para baixo as colheitas em um tubo cônico de 15 mL a 21.000 x g por 2 min em 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Após descartar a PBS completamente, adicionar 0,5 mL do reagente de extração de proteínas de mamíferos gelada (M-PER), juntamente com o inibidor da protease (5 µ l de 100 x coquetel de inibidor de protease), para a pelota se as células são cultivadas em um prato de 60 mm.</li>
		<li>Ressuspender as células com várias rodadas de pipetagem e então incubar as células suspensas por 15 min a 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Girar a célula lisada a 21.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Transferi o sobrenadante aquoso para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		<li>Analise o sobrenadante por immunoblotting, seguintes protocolos padrão com anticorpos apropriados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. geração de linhas de células HEK293 estável com integração Genomic do Gene Switch pEUI(+)
<ol><li>Transfect 5-10 µ g do pEUI(+) purificado com o transgene em células HEK293 confluente de 50-60% em uma placa de cultura de célula de diâmetro 90mm, usando 15-30 µ l de reagente de transfeccao. Adicionar o reagente de Transfeccao para 500 µ l de diluente (DMEM sem FBS e antibióticos) que contém o DNA. Após a incubação da mistura reacional durante 30 min à RT, adicione a mistura de células HEK-293 sobre o prato de cultura.</li>
	<li>Após o transfeccao, permitir que o transfectants a crescer e expressar os produtos de genes de resistência a puromicina em meio de cultura não-seletivo (sem puromicina) por 24-48 h a 37 ° C.</li>
	<li>Dissocia as células desde os pratos de cultura por tripsinização. Após descartar o meio de cultura, enxágue o transfectants com PBS pré-aquecido (37 ° C), adicionar 1 mL de ácido de 0,25% tripsina/ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incube por 1 min a 37 ° C. Após têmpera o tripsina/EDTA pela adição de meio de cultura previamente aquecido (10 mL, 37 ° C), colher as células com uma espátula de célula, seguida de centrifugação em um tubo cônico de 15 mL a 21.000 x g por 2 min 18-25 ° c.</li>
	<li>Ressuspender o transfectants em 50 mL de meio de cultura previamente aquecido (37 ° C) e 10 mL de células de transferência em pratos de cultura de células frescas de 90 mm. Cultura de células a 37 ° C até 50-60% confluência antes a puromicina (em geral, isso leva cerca de 24-48 h).</li>
	<li>Cultive a transfectants a 37 ° C em meio de cultura celular suplementado com 3 puromicina µ g/mL, por 3-4 semanas. Durante o período de seleção, altere o meio de cultura celular contendo puromicina (3 µ g/mL) a cada 2-3 dias para manter a pressão de seleção. Quando as células se tornam totalmente confluentes, dividi-los seguindo os procedimentos em etapas 3.3-3.4, com meio de cultura contendo puromicina. Descarte as células restantes do meio de cultura, se não necessária. Nota: As condições de seleção puromicina devem ser estabelecidas experimentalmente para tipos específicos de célula. Usamos 3 µ g/mL de puromicina em meio de cultura celular; Isso foi o suficiente para induzir a morte celular em HEK293 não transfectadas.</li>
	<li>Colher as células das colônias individuais, usando um cilindro de clonagem e siga as instruções do fabricante.<ol>
<li>Descarte o meio de cultura celular. Lave a placa duas vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS para remover células flutuantes.</li>
		<li>Usando uma pinça estéril, conjunto cilindro de clonagem sobre as colónias individuais.</li>
		<li>Adicione 0,2 mL de 0.35% tripsina/EDTA para cada cilindro.</li>
		<li>Incube o prato a 37 ° C por 1 min, até que as células são desanexadas e em seguida, adicione algumas gotas de meio de cultura previamente aquecido (37 ° C) para os cilindros.</li>
		<li>Transferi as células de cada cilindro individual aos poços de uma placa de 6, com 2 mL de meio de cultura e 1 µ g/mL de puromicina em cada poço. Nota: Quando as células se tornam confluentes, ampliar a cultura. Agora clone(s) pode ser estabelecida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manter os clones individuais em meio de cultura celular suplementado com 1 µ g/mL de puromicina.</li>
	<li>Valide as colônias individuais testando sua sensibilidade ao tratamento Teb (concentração final, 10 µM) por 24 h. teste a capacidade de resposta dos clones para o Teb, analisando o nível de expressão do transgene com immunoblotting. Selecione um clone desejado (ou clones). Cultive um Teb-tratados e uma amostra não tratada em meio de cultura para 12-48 h a 37 ° C antes de analisar o nível de indução do transgene. O nível de expressão do transgene pode ser medido através de immunoblotting, seguindo os procedimentos em etapas 2.5.1 - 2.5.7.</li>
</ol>4. depleção de Teb
<ol><li>Saciar os estímulos Teb, substituindo Teb contendo meio de cultura celular com meio Teb-livre. Nota: Recomenda-se substituir a mídia de crescimento sem primeiro repropagação as células em um prato de cultura nova. Teb residual aparece aferrar-se ao prato plástico e irá provocar uma expressão forte background do transgene. Antes repropagação as células numa placa de cultura nova, enxágue as células colhidas diversas vezes com meio de cultura ou PBS.<ol>
<li>Dissocia as células desde os pratos de cultura por tripsinização. Após descartar o Teb contendo meio de cultura, enxágue as células Teb-estimulada duas vezes com PBS pré-aquecido (37 ° C), adicionar 1 mL de 0,25% tripsina/EDTA e incubar durante 1 min a 37 ° C. Após têmpera o tripsina/EDTA adicionando pré-aquecido Teb-livre meio de cultura (10 mL, 37 ° C), colher as células com uma espátula de célula, seguida de centrifugação em um tubo cônico de 15 mL a 21.000 x g por 2 min 18-25 ° c.</li>
		<li>Ressuspender as células em 50 mL de meio cultura pré-aquecido Teb-free (37 ° C) e transferir 5ml das células para três pratos de cultura de células frescas de 60mm. Cultura de células a 37 ° C por 24, 48 e 72 h, respectivamente.</li>
		<li>As células em pontos diferentes do tempo da colheita e medir o nível de expressão do transgene usando immunoblotting. Nota: Nestas condições experimentais, a expressão do transgene tornou-se indetectável pós-cultura de aproximadamente 3 dias das células no meio cultural Teb-livre (Figura 3). O nível de expressão do transgene pode ser medido pelo immunoblotting, conforme etapas 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems.">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).</li><li>Clackson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+gene+expression+systems.">Regulated gene expression systems.</a> Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).</li><li>Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatable+lentiviral+system.">Gene regulatable lentiviral system.</a> Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP/mTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse.">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+and+mTOR:+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer.">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).</li><li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+mifepristone+(MFP).">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li><li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+mifepristone:+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies.">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li><li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes.">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li><li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptors+and+their+biological+actions.">Ecdysone receptors and their biological actions.</a> Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).</li><li>Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ligands+and+coligands+for+the+ecdysone-regulated+gene+switch.">Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).</li><li>Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor:+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression,+and+reduced+size.">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues.">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).</li><li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+regulation+of+zebrafish+gene+expression.">Small-molecule regulation of zebrafish gene expression.</a> Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).</li><li>Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-inducible,+ecdysone+receptor-based+gene+expression+system+for+plants.">Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants.</a> Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).</li><li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetOn+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Jeong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+sequence-+and+ligation-independent+cloning+as+a+rapid+and+versatile+cloning+method+for+functional+genomics+studies.">One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone-inducible+gene+expression+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).</li><li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+insecticidal+activity+of+benzoheterocyclic+analogues+of+N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide:+Part+1.+Design+of+benzoheterocyclic+analogues.">Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues.</a> Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).</li><li>Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse.">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li><li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide,+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist.">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li><li>McConnell, M. J., Imperiale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adenovirus+and+its+use+as+a+vector+for+gene+therapy.">Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).</li><li>Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+skin+diseases.">Gene therapy for skin diseases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).</li><li>Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Gene+Therapy:+Translational+and+Clinical+Outlook.">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li><li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats.">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li><li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter.">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li></ol>

Temos sem conflitos de interesse relacionados a este relatório.

A principal desvantagem do uso de um interruptor de expressão do gene binário é a necessidade de entregar simultaneamente dois plasmídeos separados (motorista e efetoras) para a célula de destino. Isso pode levar a uma distribuição desigual de plasmídeos e resultam em uma resposta inconsistente do interruptor para o indutores1,2,3. Outra deficiência do sistema de dois vetores é que um mínimo de duas rodadas de seleção antibióticos são necessários para identificar promissores linhas celulares. Portanto, uma gene-inducible gaveta que compõem uma unidade há muito tempo tem sido procurada para uso em pesquisas biológicas. O interruptor de expressão do transgene singular pEUI(+) está contido em um único vetor, equipado com todas as unidades regulamentares necessárias para estimulação do transgene. Assim, o nível de indução do transgene, subcloned em pEUI(+), é dependente da quantidade de DNA transfectada no experimento de transfecção transiente e dosagem do indutor de química. Além disso, testamos ainda mais o uso do vetor pEUI(+), gerando uma linha de celular estável, contendo uma única cópia do transgene ANKRD13A 15. A linha de celulares estabelecidas mostrou alta sensibilidade ao tratamento Teb (Figura 3). Coletivamente, sua alta sensibilidade, reversibilidade e baixa leakiness15, juntamente com limitada variação no nível de expressão fazem pEUI(+) uma ferramenta valiosa molecular e celular para manipular a expressão do gene alvo.
Entre os vários sistemas de gene inducible, selecionamos a gaveta de indução do gene GvEcR-dependente. O GvEcR tem várias vantagens sobre outros sistemas: em primeiro lugar, a natureza lipofílica de vários análogos de isoinokosterone usado como indutores químicos (incluindo Teb) é vantajosa para penetração eficiente das membranas celulares,21; em segundo lugar, não há nenhum Col orthologs em vertebrados, então ecdiesteroide agonistas não influenciam a função de endogenamente expressa receptores nucleares21,,22; em terceiro lugar, ecdiesteroide é inócuos em vertebrados e rapidamente apuradas entre a circulação sistema na vivo21,23; e em quarto lugar, já que numerosos agonistas isoinokosterone foram desenvolvidas até o momento, escolhendo o tamanho ideal de moléculas pequenas, pesquisadores podem evitar complicações indesejáveis13,22,24. Embora o pEUI(+) mostra alta sensibilidade para Teb, testando a capacidade de resposta dos pEUI(+) aos outras agonistas ecdiesteroide pode revelar valiosa. A existência dos agonistas de EcR não-esteroides, tais como metoxifenozida, que são mais solúveis em água do Teb24 pode alargar o âmbito das aplicações de pEUI(+). Embora a expressão do transgene em pEUI(+) é relativamente mais fraca do que em um sistema Tet-On15, o nível de indução de transgene pode ser aumentado pela adição de uma multi cópia do domínio de transactivation VP16 (dados não mostrados). Aplicações recentes da terapia do gene têm focado a entrega segura de um gene alvo em células ou tecidos que não possuem o produto respectivo gene funcional devido a doença genética25,26,27. No entanto, não regulamentados transgene sob o controle dos promotores constitutivos tecido-específica ou virais pode provocar hiperexpressão do gene do alvo, o que eleva a possibilidade de dano de tecido local28,29. Assim, a aplicação de um interruptor de gene confiável para a terapia do gene pode evitar complicações indesejadas. O vetor de pEUI(+) fornece uma ferramenta conveniente e poderosa para controlar a expressão do transgene em estudos clínicos e biológicos. Atualmente, estamos desenvolvendo um vetor de Lentivirus singular com base em GvEcR para aumentar o leque de aplicação do nosso sistema.

Vários genes diferentes switches tem sido explorados por sua capacidade de regular precisamente a expressão do transgene em cultura de células e modelos animais, com diferentes graus de sucesso1,2,3. Sistemas de interruptor de gene potencial devem conhecer vários critérios rigorosos, incluindo: precisão direcional expressão do transgene, capacidade de resposta de dosagem e tempo-dependente para indutores, leakiness insignificante do promotor, reversibilidade do transgene ativação através da remoção de indutor e níveis de toxicidade do indutor toleráveis para linhas celulares e animais de laboratório a1,2,3. Indutores de várias pequenas moléculas têm sido explorados, incluindo tetraciclina4,5, rapamicina6,7,8, mifepristone9,10, e isoinokosterone11,12,13,14. Em geral, estes sistemas exigem pelo menos dois plasmídeos contendo duas ou três unidades discretas de expressão, um ou dois dos quais compõem um elemento regulatório (plasmídeo indutor) que vincula um indutor de pequenas moléculas para obter atividade transcricional; e outro plasmídeo (plasmídeo efetoras) contendo o transgene sob o controle de uma região de DNA reguladora que permite o acesso do elemento indutor-limite regulamentar. A principal desvantagem do sistema binário é que ele requer a introdução concomitante dos dois vetores (indutor e efetoras) na célula alvo. Em experimentos de expressão do transgene transitória, o transfection simultâneo de dois plasmídeos inevitavelmente produz uma população de células que isoladamente é transfectadas com o indutor ou o efetor, ou co transfectadas desigualmente. Além disso, o sistema binário requer pelo menos duas rodadas de seleção antibiótica para estabelecer linhas de célula estável, que é demorado e trabalhoso. Assim, combinar todos os componentes necessários para a expressão do transgene e regulamento em um único vetor seria o ideal para garantir a expressão concomitante de todos os elementos necessários em uma única célula e permitir a regulação da expressão do transgene através do tratamento com indutores de pequenas moléculas.
Para superar as deficiências do gene binário switches, recentemente desenvolvemos um interruptor de gene singular, usando uma Drosophila melanogaster gene Col-baseado sistema inducible15. Isoinokosterone Medeia a expressão genética quando se liga ao heterodímero Col/ultraspiracle (USP), que por sua vez induz a vinculação da colectânea de DNA dos elementos reguladores3,11. O receptor de vertebrados retinoide X (RXR), um ortholog de insecto USP, recrutas EcR para formar um ativador transcricional ativo16. Assim, a expressão orientada de um transgene em células de vertebrados ou tecido, o EcR e RXR devem ser co expressa simultaneamente antes de ser estimulado por isoinokosterone ou seus agonistas. Desde que o recurso heterodimérica dSwitch gene Col-baseado pode ser influenciado pela endógena RXR nível, Padidam et al. substituídos os domínios DNA EcR-vinculação e ativação com ligação de GAL4 DNA heteróloga, herpes simplex vírus proteína vmw65 domínios de ativação (VP16) fundiram-se ao domínio de ligação ligante EcR, que depois tornou-se insensível ao RXR endógena e formou um homodímero para ganhar a atividade transcricional17. O interruptor de gene Col-baseado foi melhorado através da construção de uma proteína quimérico composta por domínio de ativação VP16 mínimo combinado com GvEcR, que formou um homodímero e localizadas no citosol na ausência do agonista isoinokosterone, Teb16, 18. Por ligação a Teb, o GvEcR mudou sua localização subcellular do citosol para o núcleo de reconhecer um promotor híbrido composto de zebrafish E1b promotor mínimo combinado com um conjunto de dez repetidas sequências de ativação upstream (UASs) para iniciar o transcrição do gene alvo16.
Para simplificar o gene Col-baseado anteriormente relatado muda16,18, nós combinamos os recursos binários do sistema em um único vetor equipado com todos os elementos necessários para estimular expressão do transgene e então designado o vetor recém-gerado, pEUI(+) (número de adesão GenBank: KP123436, figura 1A)15. O efetor respondendo para o driver de GvEcR (doravante driver) consiste em dez em tandem UAS repete ao lado de um promotor de E1b mínimo seguido de um local de clonagem múltipla (MCS) com EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII sequências de reconhecimento (figura 1B). Além disso facilitar a seleção de transfectadas cells, uma puromicina orientada por promotor de SV40 N-acetil-gene transferase (PAC) foi colocada entre as regiões de driver e efetoras para manter a linha celular estável (Figura 1).
Descreveremos um protocolo detalhado para a modulação transitória e estável da expressão do transgene usando pEUI(+). Além disso, nós fornecemos instruções detalhadas para o uso bem sucedido de Teb como um agonista isoinokosterone.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEUI(+)</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The patent license was transferred to TransLab Inc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gene-Fect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;">TLC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tebufenozide</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">S001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:71px;">SPL life science</td>
			<td style="width:119px;">11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse FLAG M2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-alpha tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">CP06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td style="width:71px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740410.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M-PER Mammalian Protein 
			Extraction Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Protease inhibitor Cock. III</td>
			<td style="width:71px;">T&#38;I</td>
			<td style="width:119px;">BPI-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

Controle preciso da expressão do transgene é desejável em estudos clínicos e biológicos. No entanto, porque o recurso binário de interruptores de gene empregado atualmente requer a transferência de duas unidades de expressão terapêutica simultaneamente em uma única célula, a aplicação prática do sistema de terapia genética é limitada. Para simplificar o sistema de expressão do transgene, geramos um interruptor de gene designado como pEUI(+), englobando um conjunto completo de módulos de expressão do transgene em um único vetor. Compreendendo o domínio GAL4 DNA-ligando e col modificado (GvEcR), um mínimo domínio de ativação VP16 fundido com um domínio de ligação a GAL4 DNA, bem como um receptor de isoinokosterone de Drosophila modificado (EcR), o interruptor do recém-desenvolvido gene singular é altamente responsivos à administração de um indutor químico de maneira tempo e dose-dependente. O vetor de pEUI(+) é uma ferramenta potencialmente poderosa para melhorar o controle da expressão do transgene em pesquisas biológicas e estudos pré-clínicos. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a modulação de uma expressão do transgene transitória e estável usando vetor de pEUI(+) pelo tratamento de tebufenozide (Teb). Além disso, partilhamos diretrizes importantes para o uso de Teb como um indutor químico.

O interruptor de gene singular GvEcR-baseado é retratado na figura 1A. O vetor pEUI(+) foi otimizado para a expressão do transgene regulamentado pelo tratamento com Teb. A região de efetor de pEUI(+) inclui um 10xUAS e um E1b promotor mínimo seguido por um MCS contendo sites de reconhecimento de enzima de restrição EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI e AflII. Um sinal de poli SV40 foi adicionado para trás os MCS (figura 1B). Um gene do PAC foi inserido entre as regiões de driver e efetoras de pEUI(+) para conferir resistência a puromicina.
Para avaliar a atividade e leakiness de pEUI(+), nós subcloned EGFP no site do MCS EcoRI (pEUI(+)-EGFP), transitoriamente transfectadas construção de plasmídeo em células HEK293 e administrado Teb em diferentes concentrações para 24 h ( A Figura 2). Enquanto vector simulado transfectants não mostrou fluorescente sinais independentemente do tratamento Teb (Figura 2A, B), pEUI (+)-EGFP transfectants tornou-se progressivamente sensibilizada para o aumento da quantidade de Teb (Figura 2–F ). Mais importante, pEUI (+)-EGFP transfectants sem tratamento de Teb não eliciar detectáveis sinais EGFP sob um microscópio fluorescente (Figura 2).
Para validar ainda mais a capacidade de resposta do pEUI(+) para Teb, nós subcloned um gene de ANKRD13A bandeira epítopo-marcados para o sítio de EcoRI de pEUI(+), transferido a construção em células HEK293 e então, sujeitou-os a puromicina por 3 semanas para estabelecer uma linha de celular desejado com o transgene de ANKRD13A . Analisamos a expressão do transgene ANKRD13A após um tratamento de 24 h com Teb e a linha de celulares estabelecidas respondeu bem (Figura 3). Mais demonstrámos a reversibilidade do gene pEUI(+) interruptor por esgotar Teb da mídia cultural. Como mostrado na Figura 3, a expressão ANKRD13A não era mais detectável quando nós cultivadas as células em media Teb-free.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig1.jpg"> Figura 1 . Diagrama esquemático da pEUI(+). (A), o mapa do vetor de pEUI(+) foi construído. Um promotor CMV conduz a expressão constitutiva de GvEcR. O GvEcR Teb-limite será translocar para o núcleo e vincular o 10xUAS cis-agindo sequências reguladoras para estimular a expressão do transgene inserido no MCS. (B) a sequência de informações entre os colchetes no (A) contém as sequências de efetor inteira de pEUI(+). As setas representam os locais de reconhecimento de enzima de restrição individual incluídos em MCS. <a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig2.jpg"> Figura 2 . Interruptor de gene singular com base em GvEcR responde ao tratamento de Teb. Células HEK293 foram transfectadas com o DNA especificado constrói. Após 24h de transfeccao, as células foram estimuladas por 24 h com Teb na concentração indicada. EGFP transgene atividade foi observada sob um microscópio fluorescente. Transfectants simulado com pEUI(+) não mostrou qualquer fluorescência detectável com (A) ou sem tratamento de Teb (B). (C–E) A intensidade fluorescente em pEUI (+)-EGFP-células transfectadas aumenta de forma dose-dependente Teb. Escala da barra, 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57494/57494fig3.jpg"> Figura 3 . HEK293 células estàvel abrigando pEUI (+) / bandeira-ANKRD13A responder reversivelmente para a administração de Teb. BANDEIRA epítopo-tag ANKRD13A expressão foi provocada por tratamento de Teb (1,5 µM). Após 24 h de tratamento com Teb, as células foram trocadas para mídia de abandono Teb durante o tempo indicado. A quantidade relativa de ANKRD13A foi medida pela mancha ocidental com anticorpo anti-FLAG. O nível de expressão endógena de α-tubulina foi medido com anticorpo anti-α-tubulina como um controle. O asterisco branco indica uma espécie de cross-reactive não identificada. <a href="/files/ftp_upload/57494/57494fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness at JoVE.com

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Um isoinokosterone baseado no Receptor Singular Gene interruptor para deliberada expressão do Transgene com robustez, reversibilidade e insignificante Leakiness

Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação da expressão do transgene usando pEUI(+) singular gene interruptor por tebufenozide tratamento.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K visualizações.  Chungnam National University. Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação da expressão do transgene usando pEUI(+) singular gene interruptor por tebufenozide tratamento.

Vídeo: An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genética

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Expressão gênica em camadas de aleurona cevada bombardeado com maior Throughput de medição

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

Gene candidato teste em estudos de coorte clínica com genotipagem multiplexada e espectrometria de massa

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...