This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Universit&#233; Paris Diderot and by the Minist&#232;re de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.); ANR grant ''Myeloten'' (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.

Tüm hayvan deneyleri Fransız Tarım Bakanlığı ve AB kurallarına uygun olarak Pasteur Enstitüsü Güvenliği Komitesi tarafından onaylanan bulundu. 1. Bir 96-yuvalı Tek hücreli Sıralama Plaka Hazırlama <ol><li> Belirli bir retro transkripsiyon tamponu 5.0 ul, düşük etilendiamintetraasetik asit (EDTA) TE tamponu (10 mM TE çözeltisi, pH 8, ve 0.1 mM EDTA solüsyonu, 1.3 ul ekleyerek 1.5 ml bir tüp içinde ön amplifikasyon karışımı hazırlanması 0.2 uM filtre ) ve Taq DNA polimeraz oyuk başına (Şekil 1a, 0.2 ul). </li><li> 96 oyuklu bir plaka üzerinde, her bir (en fazla 48 kuyu) &#39;de ön amplifikasyon karışımı 6.5 ul dağıtın. Bu plaka, 96 gözlü, tek-hücre sıralama levhasıdır. NOT: Bir elektronik pipet kullanarak bu protokol için tavsiye edilir. Bu hassas ve tekrarlanabilir hacim ölçümleri sağlar ve zaman kazandırır. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54858/54858fig1.jpg" /> <strong&gt; Şekil 1: 96 oyuklu plaka yükleme prosedürü. Bu deney kalan etkileyecek şekilde 96 oyuklu plakalar yükleme, çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. (A) plaka sıralama 96-iyi tek hücreden üzerinde ön amplifikasyon karışımı 0.2x tahlil karışımı ardından ilk dağıtılır. (B) her tek hücreli pozisyonunun rekor bir tablo üzerinde tutulmalıdır. İyi olmayan bir hücre, bir &quot;herhangi bir giriş&quot; de denir ve bir kontrol olarak kullanılabilir. İki sıra cDNA seyreltme (bir hücreye 10 5 hücre eşdeğer sıralı tek-in-on seyreltme) ile astar etkinliğini kontrol etmek kurtulmuş olabilir. 96 gözlü esey plâkasının (c), deney yükleme reaktif primerlerin ilave edilir, önce dağıtılır. her bir primer pozisyonda bir düzen tutmak için unutmayın. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54858/54858fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </a&gt; <ol start="3"><li> Her bir primerden 1.4 ul ekleyerek 1.5 ml bir tüp içinde bir 0.2x deney karışımı hazırlanması (primerler 20x, en fazla 48 farklı prob; bakınız Tablo 1). Düşük EDTA TE tamponu ile 140 ul son ses seviyesini ayarlayın. </li><li> Ön amplifikasyon karışımı içeren 96 gözlü, tek hücreli ayırma plakası 48 çukurlara 0.2X deney karışımı 2.5 ul dağıtın. Not: 9 ul olmalıdır 96 gözlü numune plakasının her çukuruna son hacim. </li><li> Bir kapak film ile plaka mühür. plaka vorteks ve 45 saniye boyunca 280 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. -20 ° C&#39;de 96-çukurlu bir hücre ayırma plakası saklayın veya hemen kullanın. </li></ol> 2. Tek Hücre Ayrılma <ol><li> CO2 dağıtım sistemi kullanılarak, hipoksi ile fare euthanize. Bir diseksiyon plaka üzerinde fare düzeltmek ve makas kullanılarak boyuna periton boşluğuna açılır. </li><li> karaciğer LAK kurtarın. <ol><li> Karaciğer izolasyon öncesinde, floş livhücreler ER-dolaşım. <ol><li> portal ven ortaya çıkarmak için, küçük ve farenin sol tarafına kalın bağırsak hareket; Portal ven periton boşluğuna en büyük ven olarak görünür. </li><li> 10 ml&#39;lik bir şırınga ve 0.45 mm&#39;lik bir iğne ile, damar üzerinden fosfat-tamponlu salin ortamı (PBS) ile karaciğer yıkayın. Karaciğer kızarma kolaylaştırmak için, makasla gastrik arter kesti. </li><li> safra kesesi kaldırmak için, forseps ile safra kesesi tabanını çimdik ve makas ile karaciğer ayırın. </li><li> karaciğer izole etmek, forseps ile karaciğer tabanını çimdik ve makas kullanılarak, periton boşluğuna geri kalanından karaciğer ayırın. </li><li> Roswell Park Memorial Institute 5 ml ortam (RPMI),% 2 fetal sığır serumu (FCS) içeren bir çömlekçi tüp içinde karaciğer aktarın. </li></ol></li></ol></li><li> Bir havan kullanılarak mekanik ayrışma ile karaciğer ayırmak. 15 ml&#39;lik bir tüpe orta aktarın. toplam hacim getirRPMI% 2 FCS ile 14 ml. hepatositler decant 15-20 dakika süreyle buz üzerinde hücre süspansiyonu bırakın. </li><li> 1 ml pipet kullanarak yeni bir 15 ml tüp içinde (hepatositler) olmadan süpernatant kurtarma (süpernatant 12 mi beklenebilir). 10 ° C&#39;de 7 dakika boyunca 120 xg&#39;de Spin. santrifüj sonra süpernatant atın. </li><li> Yoğunluk gradyan ortamı 14 ml adım 2.4 &#39;de elde edilen pelletini (örneğin, Percoll% 40). 20 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 600 x g&#39;de Spin. Aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> potasyum asetat, 1 ml (ACK) pelletini. 1 dakika için oda sıcaklığında bırakın. 1 dakika sonra, Hank Dengeli Tuzlu Çözeltisi (HBSS),% 2 FCS ile 14 ml toplam hacmi getirmek. 10 ° C&#39;de 7 dakika boyunca 120 xg&#39;de Spin. süpernatant atın. </li><li> hücreleri leke. <ol><li> Biyotinlenmiş antikor karışımı (Malzeme Tablosuna bakınız 300 ul pelletini, tüm biyotinlenmiş antikorlar söz eklemekEd) ve 1.5 ml tüp hücreleri aktarın. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca karanlıkta bırakın. </li><li> HBSS% 2 FCS ile 1 ml toplam hacmi getirmek. 10 ° C&#39;de 7 dakika boyunca 120 xg&#39;de Spin. (Malzeme Tablo bkz belirtilen tüm florokrom-bağlanmış antikor ekleyin) florokrom-bağlanmış antikor karışımı ve florokrom-eşlenik streptavidin 300 ul pelletini. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca karanlıkta bırakın. </li></ol></li><li> HBSS% 2 FCS ile 1 ml toplam hacmi getirmek. 10 ° C&#39;de 7 dakika boyunca 120 xg&#39;de Spin. 1 ml pipet kullanarak süpernatantı. 1 mi HBSS ve propidyum iyodür pelletini (Pi; 1: 4,000). NOT: yaygın ifade LAK hücre yüzey belirteçleri kullanırken, 3 popülasyonları tanımlanmıştır: NKp46 + IL-7Rα - NKp46 + IL-7Rα + ve NKp46 - IL-7Rα +. Tüm popülasyonları soy sıralanır - CD3 - CD4 - CD45.2 +. </li></ol> 3. Tek hücreli floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) <ol><li> Tek hücreler 13 sıralamak için FACS kullanın. Not: Farklı hücre tipleri, aynı 96-yuvalı, tek hücreli ayırma plakasında sıralanabilir (Şekil 2). <ol><li> de 0.2X deney karışımı ve 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakasında ön amplifikasyon karışımı içeren her bir hücre sıralamak için FACS kullanın. yeni hazırlanmış bir 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakası kullanarak veya -20 ° C&#39;de muhafaza edildiğinde bu eritin. <ol><li> FACS plaka tutucuya mühürlü bir 96 oyuklu plaka koyun. bir test olarak, boş bir 96 oyuklu plaka kullanınız. ile plaka yerleştirin A1-de solda ve deneyci doğru. </li><li> Doğrulama boncuklar A1-iyi merkezine bir düşüş elde etmek için levha tutucu ayarlayın. </li><li> A hattı tüm kuyuların ile adımı yineleyin 3.1.1.2 </li><li> 96 gözlü plaka conta ve oyuk başına kriteri 100, doğrulama boncuk çıkarın. d edinKuyuların merkezinde rop oluşumu. </li><li> düzgün ayarlanmış olduğunda, plaka sahibinin 96-kuyu tek hücreli sıralama plakasını yerleştirin. plaka düzeni ve kuyu başına sıralama 1 hücre çizin. Not: 96 oyuklu bir hücre ayırma plakası üzerinde, her hücrenin doğru yerleştirilmesi gereklidir. Bir plaka düzeni bir elektronik tablo yazılımı üzerinde tutulmalıdır. Plaka düzeni sonraki birkaç adımda (Şekil 1b) 14 kullanılır. hücreleri olmadan 96-kuyu örnek plaka üzerinde bir de içeren 0.2x tahlil karışımı ve Preamplıfikasyon karışımı bırakın. Bu da, bir No-girişli kontrol olarak kullanılır. bir cDNA seyreltme için 6 kuyu iki sıra boş. Bu kuyular, primer etkinlik (Şekil 1b) için kontrol olarak kullanılır. </li><li> -20 ° C&#39;de 96-çukurlu bir hücre ayırma plakası saklayın veya hemen kullanın. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Ön amplifikasyon <ol><li> taze veya 96-iyi çözülmüş tek hücreli sıralama plaka OBT kullanınAdım 3.1.1.6 yılında ained. (45 saniye için 280 xg) plaka vorteks ve aşağı doğru döndürün. </li><li> PCR 96-kuyu tek hücreli sıralama plaka koyun. Şekil 3 ve Tablo 2 &#39;de belirtilen program uyarınca ters transkripsiyon ve ön amplifikasyon gerçekleştirin. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54858/54858fig3.jpg" /> Şekil 3: Ön amplifikasyon programı. yeterli malzeme elde edebilmek için, sıralanmış tek hücreler üzerinde olduğundan belirli hedef genlerinin ön amplifikasyon gerekir. 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakası ön amplifikasyon programı izlemek için bir ısıl üzerine yüklenir. Ön amplifikasyon ürünleri daha sonra, düşük EDTA TE tamponu ile seyreltildi ve hemen kullanılır veya -20 ° C de dondurulabilir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54858/54858fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="3"><li> Ön amp sulandırmakher kuyuya düşük EDTA TE tamponu 36 ul ekleyerek örnekleri lified. </li><li> Bir kapak film ile plaka mühür. (45 saniye için 280 gr) plaka vorteks ve aşağı doğru döndürün. -20 ° C&#39;de önceden büyütülmüş, 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakası saklayın veya hemen kullanın. </li></ol> 5. 96-çukurlu bir numune plakası hazırlayın <ol><li> qPCR Master karışımı 175 ul ve örnek yükleme reaktif 17.5 ul ekleyerek ana karışımı 191 ul hazırlayın. </li><li> Yeni 96-kaynaklı tabaka üzerinde kaplanmıştır her bir (en fazla 48 kuyu) &#39;de ana karışımı 3.6 ul dağıtın. Bu 96-kuyu örnek levhasıdır. </li><li> Yeni 96-iyi levhaya 96 oyuklu bir örnek plakası öncesi amplifiye cDNA 2.9 ul aktarın. 96, tek bir hücre ayırma plakası ve 96-çukurlu bir örnek plakası arasındaki her bir numune için aynı pozisyonda tutmak. </li><li> Bir kapak film ile plaka mühür. (45 saniye için 280 xg) plaka vorteks ve aşağı doğru döndürün. ışıktan koruyarak buz üzerinde yeni bir 96 oyuklu plaka koyun. 96-kuyu s Mağaza-20 ° C&#39;de bol plaka hemen kullanabilir veya. </li></ol> 6. 96 oyuklu bir deney plakasının hazırlanması <ol><li> Yeni 96-kaynaklı tabaka üzerinde kaplanmıştır her bir (en fazla 48 kuyu) &#39;de deney yükleme reajanı 3 ul dağıtın. Bu plaka, 96 oyuklu bir deney plakası olarak adlandırılır. </li><li> Her bir oyuğa primerler 3 ul ekle. Bir tablo yazılım üzerinde bir düzen tutun (Şekil 1c ve Tablo 1; Tablo 1&#39;de listelenen tüm primerler kullanın). 96 gözlü esey plâkasının her bir primerin doğru yerleştirilmesi sonraki birkaç adımda için gereklidir. <ol><li> numune sayısı 48 altında ise, kullanılmayan oyuklara yerine su primerler ekleyin. </li></ol></li><li> Bir kapak film ile plaka mühür. (45 saniye için 280 xg) plaka vorteks ve aşağı doğru döndürün. -20 ° C&#39;de 96 oyuklu bir deney plakası saklayın veya hemen kullanın. NOT: primerler tekrarlanan donma ve çözülme önlemek Preamplıfikasyon karışımı için primerler dağıtmak ve 96-wel için içinAynı zamanda L deney plakası. </li></ol> 7. Tek hücreli Gen-ifadesi Chip <ol><li> bankta entegre mikroakışkan devre (IFC) yerleştirin ve şapkalı şırınga kullanarak çek valfler. , Şırınga açın vana dik yerleştirin ve sıkıca basın. O-ring hareket etmelidir. Kontrol çizgisi sıvısı ile çip (tüberkülin 0.3 ml) doldurun. </li><li> İkinci valfli adımı yineleyin 7.1. NOT: Hiçbir sıvı çip dökülen edilmelidir. </li><li> çipin alttan mavi filmi çıkarın. IFC denetleyicisi içine çip yükleyin. IFC denetleyici ekranında, &quot;PRIME&quot; ve ardından &quot;RUN.&quot; mikroakışkan hatlarının kontrolü 10 dakika sürer. </li><li> çip çıkarın ve çip altındaki mavi filmi yeniden mühür. </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54858/54858fig4.jpg" /> Şekil 4: Tek hücreli multipleks gen ifadesi çip yükleme. Bu adımlar g gerektirirÖzellikle, tek hücreli çoklu gen sentezleme çip 96 oyuklu plakanın aktarım sırasında reat hassasiyet,. yükleme hataları ve hatalara önlemek için, son derece seri bir şekilde çalışarak tavsiye edilir. Her bir transfer için alınan ses pipetleme işlemi sırasında kontrol edilmelidir. Son olarak, kabarcıkları önlemek ve oluşması halinde, bunları çıkarmak için önemlidir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54858/54858figfourlarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="5"><li> 8 kanallı pipet transfer çip A1 tarafındaki (sol taraf) 96 oyuklu deney plakası 5 ul kullanılması. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, çip sol tarafını doldurun. hep ipuçları içine aynı hacimde çizmek için dikkatli olun. <ol><li> kabarcıklar oluşturmak etmeyin. kabarcıklar belirirse, 10 ul ipuçlarını kullanarak bunları kaldırın. çip her bir kuyunun değiştirme ipuçları. </li></ol></li><li> Sağ taraftaki o adımı yineleyin 7.596-iyi örnek plaka 5 ul kullanarak f çip. </li><li> çipin alttan mavi filmi çıkarın. IFC denetleyicisi içine çip yükleyin. IFC denetleyici ekranında, &quot;Run Script&quot; ve ardından &quot;RUN.&quot; mikroakışkan hatlarının yükleme 45 dakika sürer. </li><li> çip çıkarın ve çip altındaki mavi filmi yeniden mühür. </li></ol> 8. Çalışma Chip <ol><li> mikroakışkan qPCR bilgisayarda, &quot;Veri Toplama&quot; yazılımı seçin. Başladıktan sonra, &quot;Yeni Çalıştır&quot; ı seçin. </li><li> Seç &quot;Çıkar,&quot; çip altındaki mavi filmi çıkarın ve çip yükleyin. Soldaki ve deneyci doğru iyi A1 almak için çip yerleştirin. </li><li> On &quot;Proje ayarı&quot;, &quot;Hiçbiri&quot; ve ardından &quot;İleri.&quot; </li><li> &quot;Yeni çip run&quot;, &quot;Yeni yonga dizin&quot; (deney için bir klasör oluşturun) ve &quot;İleri seçin.&quot; </li><li> &quot;Gen ifadesi&quot; On &quot;seçeneğiniPasif referans = ROX &quot;(karboksi-x-rodamin) ve&quot; Tek prob; &quot;astar göre doğru filtreyi seçin seçin.&quot; Next &quot;. </li><li> Seç &quot;Gözat&quot; ve kullanılan primerler göre doğru programı seçin. NOT: &quot;Varsayılan-10dk-Hotstart.pcl&quot; tek hücreli çoklu RT-qPCR için en sık kullanılan programdır. </li><li> &quot;Başlat Çalıştır&quot; ı seçin. Reaksiyon yaklaşık 90 dakika sürer. </li><li> Bir kez seçin bitmiş &quot;Çıkar-Bitti.&quot; </li></ol> 9. Veri analizi <ol><li> &quot;Aç&quot; &quot;Dosya&quot; ve seçin &quot;Real-Time PCR Analizi&quot; yazılımını açın deneme klasörünü bulun ve seçin &quot;ChipRun.bml dosyasını.&quot; </li><li> &quot;Analiz View,&quot; &quot;Sonuçlar Tablo&quot; ve &quot;Isı Harita Görünümü üzerine tıklayın;&quot; &quot;X&quot; ile işaretlenmiş kutular eşik algılama seviyesinin altında ve / veya kötü amplifikasyon eğrileri vardı. </li><li> örnekleri adlandırın. &quot;Örnek Setup&quot; ve sel gitvb &quot;Yeni SBS 96.&quot; &quot;Mapping&quot; üzerine tıklayın ve &quot;...&quot; Kopyala ve elektronik tablo yazılımı örnek düzeni tasarımı yapıştırın. olarak yapıştırılan düzenini tanımlamak &quot;Örnek Adı.&quot; </li><li> tahlilleri adlandırın. Adımı tekrarlayın astar isimleri ile 9.3 &quot;Dedektör Kur.&quot; olarak yapıştırılan düzenini tanımlamak &quot;Dedektör Adı.&quot; </li><li> &quot;Analiz görünümü&quot; ve &quot;Analiz;&quot; Numune ve astar isimleri örnekleri ve primerler (Şekil 7) otomatik olarak ilişkilendirilir. </li><li> Ct, Delta Ct hesaplayın ve her numune için Değiştir katlayın. Bir iç kontrol (burada, GAPDH) gibi bir temizlik geni kullanın: ACt = Ct örnek - Ct iç kontrol (ΔCtsample-ΔCtnegative kontrolü) - Değişim = 2 Fold <ol><li> &quot;Dedektör Setup&quot; seçeneğini tıklayın ve hiçbir giriş kontrolü ile kuyu seçin (gen ifadesini normalleştirmek için bir iç kontrol olarak temizlik geni kullanın). Seç &quot;Editor &quot;,&quot; başvuru tanımlamak, &quot;ve&quot; Update &quot;. </li><li> yukarıda tanımlanan iç kontrol uygulanacağı tüm kuyu seçin. &quot;Testi olarak tanımlar.&quot; &quot;Editör&quot; i seçin ve Uygun bir referans geni seçin ve tıklayın &quot;Update.&quot; </li><li> iyi negatif kontrol seçmek için &quot;örnek Setup&quot; seçeneğini seçin. &quot;Editör&quot; seçiniz ve tanımlamak &quot;Reference.&quot; &quot;Update&quot; i tıklayın. </li><li> &quot;Analiz&quot;, &quot;Analiz Görünüm&quot; seçin ve Delta Ct ve Katlama Değişim otomatik olarak hesaplanacaktır. </li></ol></li><li> veri verir. Tablo Sonuçlar &quot;olarak kaydetmek, Export&quot; &quot;Dosya&quot; ve &quot;hedef klasörü seçin, ve vurmak&quot; Kaydet &quot;ve&quot; Çıkış. &quot; </li><li> Adımı tekrarlayın 9.7, ancak bunun yerine olarak kaydetmek &quot;Masa Sonuçları&quot; in &quot;HeatMap Sonuçları.&quot; </li></ol>

<ol>
	<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bead-Based+Microfluidic+Approach+to+Integrated+Single-Cell+Gene+Expression+Analysis+by+Quantitative+RT-PCR.">A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR.</a> RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).</li><li>Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics.">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li><li>Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Sch&#252;tte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+transcriptional+networks+in+blood+stem+and+progenitor+cells+using+high-throughput+single+cell+gene+expression+analysis.">Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis.</a> Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).</li><li>Chea, S., Schmutz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Gene+Expression+Analyses+Reveal+Heterogeneous+Responsiveness+of+Fetal+Innate+Lymphoid+Progenitors+to+Notch+Signaling.">Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling.</a> Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).</li><li>Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+defines+the+divergence+between+the+innate+lymphoid+cell+lineage+and+lymphoid+tissue+-+inducer+cell+lineage.">Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage.</a> Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).</li><li>Spits, H., Artis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+-+a+proposal+for+uniform+nomenclature.">Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).</li><li>Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells-+how+did+we+miss+them.">Innate lymphoid cells- how did we miss them.</a> Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).</li><li>Vallentin, B., Barlogis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Lymphoid+Cells+in+Cancer.">Innate Lymphoid Cells in Cancer.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).</li><li>Monticelli, L. a., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphoid+cells+promote+lung+tissue+homeostasis+following+acute+influenza+virus+infection.">Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection.</a> Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phenotypic+and+functional+properties+of+liver-resident+NK+cells+and+mucosal+ILC1s.">Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s.</a> J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).</li><li>Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Programs+Define+Molecular+Characteristics+of+Innate+Lymphoid+Cell+Classes+and+Subsets.">Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets.</a> Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).</li><li>Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+dynamics+of+native+haematopoiesis.">Clonal dynamics of native haematopoiesis.</a> Nature. 2 (2), 322-327 (2015).</li><li>Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Single+Cells+from+Zebrafish+Embryos.">Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).</li><li>Klose, C., Flach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Type+1+ILCs+from+a+Common+Progenitor+to+All+Helper-like+Innate+Lymhpoid+Cell+Lineages.">Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages.</a> Cell. 157, 340-356 (2014).</li><li>Dicle, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+Approaches+to+Single-Cell+Analysis+in+Developmental+Biology.">Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology.</a> MHR. 22, 182-192 (2016).</li><li>Setty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wishbone+identifies+bifurcating+developmental+trajectories+from+single-cell+data.">Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data.</a> Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol klonal düzeyde ayrıntılı gen ifadesi bilgilerini nasıl elde edileceği anlatılır. Burada, karaciğer LAK bölme heterojenite araştırdık. (Yaygın olarak dile LAK yüzey belirteçleri göre) farklı LAK popülasyonlarının tek hücreli sıralama sonra, numuneler belirli önceden seçilen genler için önceden çoğaltılmıştır. Daha sonra elde edilen cDNA&#39;sı ve primerler A çoklu RT-qPCR mikroakışkan çip üzerine yüklendi. Son olarak, 48 tek hücre 48 farklı gen ekspresyonunu elde etti. Gen ifadesi sonuçları gen imzası ve hücre popülasyonu ilişkilerini araştırmak için bir online yazılım üzerinden analiz edilmiştir. Bu tekniğin başlıca avantajı, aynı anda birden fazla gen ekspresyonunu değerlendirmek için yeteneğidir. Aynı zamanda klonal düzeyde ve çok nadir popülasyonlar üzerinde çalışmaya olanak sağlar. gen ifadesi klonal düzeyde değerlendirilir beri geleneksel RT-qPCR yöntemlerinin aksine, tek hücreli çoklu RT-qPCR, hiçbir ortalama bir etkiye sahiptir. BöyleceBir popülasyon içindeki heterojen tespit ve analiz edilebilir. Sadece çok az sayıda hücre gen ifadesi üzerinde geniş bilgi elde etmek için gerekli beri tek hücreli RT-qPCR ifadesi, çok nadir popülasyonlar üzerinde çalışmaya olanak sağlar. Ayrıca, farklı hücre popülasyonu aynı plaka üzerinde test edilebilir. Bu online veri araçları, hücre popülasyonu ilişkileri değerlendirilmesi ile, popülasyonlar arasındaki gen imza farklılıkların tespit edilmesini sağlar ve. Bu teknik, aynı zamanda diğer avantajlar sağlar. Tek hücreli çoklu RT-qPCR son mikroakışkan avans yararı vardır. IFC odalarında gerekli Ciltler nanoliter düzeyi aşmamaktadır. Böylece, reaktifler, az miktarlarda deney maliyetini azaltarak, kullanılır. Son olarak, pipetle çalışma aşamasına toplam sayısı bu şekilde pipetleme hata olasılığını kısıtlanmaktadır. adımları tüm hücreler için eş zamanlı olarak ve hızlı ve zaman tasarrufu sağlayan bir şekilde çalışmasına imkan vermektedir, çok kanallı bir pipet ile yapılabilir. elde edilen sonuçlarklonal düzeyde güvenilir ve tekrarlanabilir, ve sağlam veri analizi gerçekleştirmek için de kullanılabilir. Tek hücreli çoklu RT-qPCR, ancak, bazı sınırlamalar getirmekte etmez. İlk olarak, bu teknik, bir mikroakışkan çip mikroakışkan çip kontrol ve belirli bir ısıl olarak pahalı ve özel ekipman gerektirmektedir. Geleneksel RT-qPCR ile, çok sayıda çalışma istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar elde etmek için gerekli beri geleneksel RT-qPCR yöntemlerinin aksine, bu teknik, zaman ve reaktif tasarrufu olduğunu. Bu protokol, 48 gen için gen ekspresyonunu elde etmek için bir yöntem sunmaktadır. 96-96 multipleks RT qPCR mikroakışkan cips mevcuttur. Bu yongalar, aynı zamanda 96 hücrelerinden 96 gen için gen ekspresyonunu değerlendirmek. Hassas ve hücre saflık maksimal olması gerektiğinden hücre sıralama sırasında, başlangıç ​​hücre az sayıda ihtiyaç vardır. Ancak, daha küçük bir hücre sayısı ile, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR geni exp sıralamak mümkün olduğunudışarı yansıması (aşama 3) hazırlandı. Son olarak, tek hücreli çoklu RT-qPCR hassas bir yöntemdir. Farklı testler, deneyler başlamadan önce yapılmalıdır. Örneğin, primer hedef özgüllük için, primerler yükseltme verimliliği için ve hedef için görece rekabet test edilmelidir. protokolün birkaç adım dikkatle yapılmalıdır. Pipetleme hata riskini arttırabilir, aynı zamanda örnekler ve deneyler bir sayıda bir araya getirildiğinde küçük hacimlerde manipülasyonlar (Adım 1, 4, 5, 6, ve 7). Bütün reaktifler ve karışımlar homojen bir çözelti sağlamak için önceden pipetleme için vortekslendi edilmelidir. Ön amplifikasyon (adım 4) esnasında buharlaşma aynı zamanda nihai sonuçlar etkileyebilir. Plakalar her zaman düzgün, uygun bir kapak film ile kapatılmalıdır. strateji sıralama plakalar içinde kuyu ölü hücreleri veya birden çok hücre önlemek için çok hassas (adım 3) olması gerekir. istifleme makineleri FACS artık tek hücreli sıralama ind ile donatılmıştıriyi her sıralı spesifik hangi hücre kaydedebilirsiniz eski yazılım. Bu yeni araç, gen imzalar hücre yüzey işaretleyici yoğunluğu korelasyon olup olmadığını belirlenmesi için ilgi olacaktır. cips örnek ve tahlil pozisyonları bu deney için gerekli olduğu gibi, titizlikle organize (1 adım 5 ve 6) olmalıdır. Son olarak, astar (adım 1 ve 6) seçimi kritik bir adımdır. Her astar daha önce açıklanan sonuçların ya da beklenen sonuçlara göre seçilmelidir. değerlendirilen genlerin kümesindeki primerlerin rastgele seçim deney nihai okuma bozabilir. Bundan başka, hücre sıralama için kullanılan hücre yüzey işaretleyici ile ilişkili primerler hazırlık geninin olan kontrol olarak kullanılması gerekir. klonal düzeyde multipleks gen ifadesini değerlendirirken, önceki araştırmalarda daha karaciğer LAK heterojen bölmenin daha iyi karakterizasyonu sunmaktadır. Online yazılım tarafından sağlanan bu teknik, daha doğrusu d açıklarSadece hücre yüzey işaretlerini kullanarak çalışmalara göre homeostasis karaciğerde ILC&#39;nin ifferent alt kümeler. Ayrıca, hücre popülasyonu ilişkilerini değerlendirmek ve farklılaşma ağları inşa etmek mümkündür. tek hücreli gen ifadesinin dayalı gen imzaları, aynı zamanda hücre popülasyonu özelliklerini ayırt etmek ve potansiyel rolleri incelemek için önemli araçlardır. Tek hücreli çoklu RT-qPCR güvenilir veri elde etmek için bir gen ekspresyon analizi için iyi tekniklerden biridir. Bu veriler biyoinformatik yazılımı 15 ile kolayca yönetilebilir. Bu mikrodizileri veya RNA sekansları gibi gen ekspresyon çalışmaları için diğer teknikler, ile ilgili olarak, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR yüksek hassasiyet mevcuttur. Tek hücre analizi diğer yaklaşımlar anlatılmıştır ve tek hücreli çoklu RT-qPCR 15, 16 birbirini tamamlayan teknikler kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik allowin, bir primer kombinasyonu ile yapılabilirg kullanıcıları kişiselleştirilmiş gen imzaları bakmak için. Bir çok diğer uygulamalar bu teknik ile kullanılabilir. Örneğin, gelişim boyunca hücrelerin zaman akışı gen ekspresyonu geliştirme sırasında molekül profilinin değiştirilmesi değerlendirmek için yapılabilir. hücreler üzerindeki ilaç etkileri de gen ekspresyonu üzerindeki ilaç etkinliğini eşiğini belirlemek için bir ilaç seyreltmesi ile araştırılabilir.

Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, doğuştan lenfoid hücreler (Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar) giderek incelenmiştir. antijene spesifik reseptörlere karşı olmamasına rağmen, lenfoid soyuna aittir ve doku homeostazında ve iltihaplanma önemli sentineli temsil etmektedir. Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar şu transkripsiyon faktörü kombinasyonları kendi ifadesi ve sitokinler 6, 7 üretme yetenekleri göre üç gruba ayrılır. Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar belirli sitokin üretimi 8, 9 vasıtasıyla çeşitli organlarda çok sayıda homeostatik ve patofizyolojik durumlara katkıda bulunur. Bu hücrelerin rolünü anlamak mümkün, organın başına çeşitli LAK alt popülasyonlar belirlemek ve bunların gelişim ilişkilerini belirlemek önemlidir. Buna ek olarak, farklı alt arasındaki plastisite olayları ile ilgili edilmiştir. heterojenitesini inceleyerekBir organın içinde mevcut hücre, bunlann olgunlaşma aşamasına sınırlandırmak için ve özel fonksiyonları ayırt etmek mümkündür. Tek hücreli çoklu RT-qPCR tekniğini göstermek için, karaciğer Laboratuvarlar Arası Karşılaştırmalar aynı LAK grupta (tip 1 LAK) 10 içinde kendi heterojenite özel bir vurgu ile, seçildi. İlk olarak, akış sitometrisi kullanılarak, üç farklı LAK popülasyonları karaciğerde karakterize edilmiştir. iki nüfus az hepatik LAK popülasyonları (doğuştan efektörlerinin% 5&#39;ten az) ise Grup 1 ILC doğuştan efektör yaklaşık% 80&#39;ini oluşturmaktadır. Bu popülasyonlar LAK nüfusun yaygın olarak dile hücre yüzey belirteçleri kullanılarak dizildi. Sonuç olarak, karaciğerde LAK popülasyonları başka büyük oranda benzer bir bakmak sınıflandırılmaktadır. Tek hücreli çoklu RT-qPCR derhal bu popülasyonların 11 heterojenitesini araştırmak için en iyi tekniklerden biri olarak ortaya çıkmıştır </s&gt; Yukarı. İki ana özellikleri tek hücreli çoklu RT-qPCR tekniğin yararlanan belirlenir. İlk olarak, klonal düzeyde bakarak, görünüşe göre benzer gelişim aşamalarını göstermek hücreler arasında karşılaştırma için hücre spesifik gen ifadesi kurtarmak mümkündür. Daha sonra, gen ekspresyonunun önceden seçilmiş bir kombinasyon bakarak, biz bir zaman noktasında eş zamanlı olarak gen ekspresyonu göre yeni gen imza belirleyecektir. tekniği klonal düzeyinde gerçekleştirilir, çünkü bu yönleri, daha az nüfus, hücrelerin geniş bir sayısı için sentezleme verilerinin bir çok çeşitli toplama izin verir. Böylece, karaciğer ILC heterojenite yeterli değerlendirilebilir. Daha sonra, bir küresel ILC fenotipe sahip tüm hücreleri sıralayarak, karaciğer LAK popülasyonlarının çok gen ekspresyonu geniş bir genel son derece nadir popülasyonları temsil etse de, elde edilir. Bir Mikroakışkan tabanlı çip bile deney sağlarHücre maddesinin küçük bir miktar. Bunun bir sonucu olarak, nadir bir hücre popülasyonlarının gen ekspresyon profilleri elde edilebilir. Online gen imza analiz yazılımı, hücre popülasyonu kümeleri ve potansiyel hücre ilişkileri kullanılarak araştırılabilir. Sonuç olarak, fonksiyonel test in vivo düzeyde kümelenme verileri doğrulamak için gerçekleştirilebilir. Genlerin onlarca aynı çip 3, 11, 12, yüzlerce ya da daha fazla tek hücreler üzerinde eş zamanlı olarak değerlendirilebilir. Deneyin tasarımı Deney en uzun ve en önemli parçasıdır. test edilecek hipoteze ilgili genlerin belirlenmesi, ilgili sonuçlar elde etmek için her şeyden önemlidir. İkincisi, ve özel kontroller (örneğin sıralama için kullanılan bilinen yüzey belirteçleri gibi) iç kontrol ihtiyaç vardır. Bu primer amplifikasyon özgüllük, amplifikasyon verimliliğini ve t test etmek çok önemlidirastar rekabet o yokluğu. Bir hücrenin birden çok gen ekspresyonu, aynı zamanda değerlendirilir Bu nedenle, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR ile çalışan bir zaman kazandıran bir tekniktir. tüm hücreler için reaktiflerin aynı çip ve karışımı kullanılarak manipülasyon olası hataları sınırlar ve örnekler arasındaki tekrarlanabilirlik sağlar. Tamamen tek hücreli çoklu RT-qPCR farklı yönlerini örnekler ve genlerin çok çeşitli duyarlılık büyük bir seviyeye sahip, klonal düzeyde son derece güvenilir sonuçlar üretimine olanak sağlamaktadır. Elde edilen sonuçlar biyoistatistiksel testler için güçlü ve sağlam veri sunuyoruz. Bunun nedeni, maddenin çok küçük miktarlarda çalışma sağlar ve ayrıntılı sonuçlara yol açar yöntemin mikroakışkan yönüne elde edilebilir. Son olarak, çevrimiçi yazılım kullanarak, istenilen popülasyonları karşılaştırmak mümkündür.

single-cell gene expression using multiplex rt-qpcr to characterize heterogeneity of rare lymphoid populations

Gen ifadesi heterojen lenfoid toplumlarda araştırmak için ilginç bir özelliktir. Bu hücrelerde gen ifadesi hücre aktivasyonu, stres veya uyarılması sırasında değişir. Tek hücreli çoklu gen sentezleme gen 1, 2, 3 onlarca aynı anda değerlendirilmesine olanak sağlar. Tek hücre düzeyinde, çoklu gen ekspresyonu popülasyon heterogenitesi 4, 5 belirler. Olgun hücreleri arasında farklı öncül aşamalarında olası karışımını ve aynı zamanda uyaranlara hücre yanıtlarının çeşitliliği hem de belirleyerek nüfus heterojenite ayrımı sağlar. Doğuştan lenfoid hücreleri (LAK) en son bağışıklık tepkisi 6, 7 doğuştan efektörlerinin bir popülasyon olarak tarif edilmiştir. LAK kendisinden Bu protokolde, hücre heterojenlikhepatik bölme homeostazındaki sırasında incelenmiştir. Şu anda, gen ekspresyonunu değerlendirmek için en yaygın olarak kullanılan bir teknik, RT-qPCR olup. Bu metot ölçümlerinin gen aynı anda yalnızca tek bir gen. birden çok hücre bir test için gerekli çünkü ek olarak, bu yöntem, gen ekspresyonunun heterojen tahmin edilemez. Bu popülasyonun ortalama gen ekspresyonunun ölçülmesi yol açar. gen çok sayıda değerlendirilirken, RT-qPCR bir zaman-, reagent- ve numune alıcı bir yöntemdir olur. Bu nedenle, ticaret-off küresel resim eksik riskini artıran değerlendirilebilir genler ya da hücre popülasyonlarının sayısını sınırlamak. Bu yazının tek hücreli çoklu RT-qPCR bu sınırlamaları aşmak için nasıl kullanılabileceği anlatılmaktadır. Bu teknik son Mikroakiskan teknolojik gelişmeler 1, 2 yararlanmıştır. Multipleks RT-qPCR fiş meydana gelen reaksiyonlar tarifeler yoknanoliter düzeyi eed. Bu nedenle, tek bir hücre, gen ekspresyonu, hem de aynı anda birden fazla gen ekspresyonu, Örnek, bir reagent- uygulandı, ve maliyet-etkin bir şekilde olabilir. 5 farklı gelişim aşamalarında veya farklı koşullar altında 4 bir popülasyon içindeki hücre alt arasındaki klonal düzeyde hücre gen imza heterojenitesini test etmek mümkündür. tek hücre düzeyinde koşulları, çok sayıda nadir nüfus üzerinde çalışmak artık bir kısıtlamadır.

Lenfoid popülasyonları gen ekspresyonunda büyük bir çeşitlilik gösterir. Bu protokol, karaciğer LAK bölmesi heterojenite tek hücreli çoklu RT-qPCR gen ekspresyonunu kullanılarak araştırılmıştır. Diğer gen sentezleme tekniklerinin aksine, tek hücreli bir çoklu RT-qPCR gen ekspresyonu, aynı zamanda, daha nadir, birkaç popülasyonda ilgili bir çalışma sağlar. klonal düzeyde yüksek hassasiyet ile birleştiğinde Bu özgüllük, bir popülasyon içindeki gen imzaları farklılıkların incelenmesi için ve nadir popülasyonları arasında sağlar. Bir örnek olarak, 4-haftalık farenin karaciğerlerinden 3 LAK popülasyonlarının gen imzaları değerlendirildi. Diğer iki karaciğerde (soy-negatif hücrelerin% 1&#39;den daha az) nadir ise bir popülasyon, kolayca tespit edilebilecek kadar sıktır. 96 oyuklu bir hücre ayırma plakası ve 96 oyuklu bir deney plakası, karaciğer dissectio önce hazırlandın ve ayrışma (Şekil 1). Her karışım steril bir başlık altında hazırlanan ve hacim hassas ve tekrarlanabilirlik için bir elektronik pipet ile dağıtıldı. Tüm reaktifler homojenliğini korumak için pipetleme önce vortekslenmiştir. hazırlandıktan sonra, 96-gözlü hücre ayırma plakası hücre sıralama kadar dondurulabilir ve 96 gözlü hücre deney plakası IFC yüklenene kadar dondurulabilir. Karaciğerleri disseke ve tek hücre süspansiyonları içine ayrışmış edildi. Hücreler, lekeli ve çözülmüş 96 gözlü, tek-hücreli ayırma plakaları üzerinde dizildi. FACS kullanılarak, 3 LAK popülasyonları yaygın olarak ifade LAK işaretçileri göre (Şekil 2) kriteri edildi. Hücre Ayırma işleminden sonra cDNA sentezlendi, ve spesifik hedef genler (Şekil 3 ve Tablo 2) amplifiye edilmiştir. Ön amplifikasyon aşamasından sonra, cDNA, düşük EDTA TE tamponunda seyreltildi. Tek hücrelerden Topraklar ve cDNA Fi (IFC çip üzerine yüklendirakamları 4 ve 5A). Elde edilen sonuçlar (Şekil 7) daha kolay okuma ve analiz (Şekil 7b) için basitleştirilmiştir. Düzgün ya da yanlış yüklenmiş fiş örnekleri (Şekil 5) gösterilmektedir. Farklı yükseltme sinyalleri ile uygun şekilde yüklenebilir çip (Şekil 6) içinde bir FAM şekli gösterilmektedir. Sonuçlar, uygun hücre sıralama, ön amplifikasyon ve yüklemeden sonra, LAK popülasyon yetişkin vahşi tip farelerin karaciğerinde gen ekspresyonu (Şekil 7), heterojen görünür olduğunu göstermektedir. Çevrimiçi yazılım, hücreye özel bir gen ekspresyon profili (Şekil 7 ve 8) ve hücre popülasyonu ilişkileri (Şekil 8) kullanılarak tespit edilebilir. Her sıralanmış nüfus gen ifadesinde zenginleştirilmiş spesifik bir gen imzası vardır. Örneğin, hücreler NKp46 olarak sıralanır - IL-7Rα + e sahipRORC, grup 3 LAK ana transkripsiyon faktörünün nriched ekspresyonu; Rora bir RORC -homologous transkripsiyon faktörü; ve IL-23R ve Cxcr6, karaciğerde grup 3 LAK hepatik markerlerin iki önemli reseptörleri. Aynı gözlemler NKp46 + IL-7Rα yapılabilir - ve NKp46 + IL-7Rα + popülasyonlan üzerinde izlenmiştir. Her hücre geçersiz kuyu dışlamak için temizlik gen ifadesi (HPRT, Kanun ve GAPDH) kontrol edilir; en az iki temizlik genler geçerli gibi değerleri dikkate ifade edilmelidir. İlginçtir, bu teknik NKp46 + IL-7Rα iki alt popülasyonlar olarak tanımlanmasını sağlar - gen imzaları dayalı. Bu iki imza arasındaki farklar farklı fonksiyonel deneyler diğer setleri tarafından onaylanmış olması gerekir. <img alt="şekil 2" src=&quot;/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2: FACS hücre stratejisi. Çıkan 4 haftalık farelerden izole edilmiş karaciğer hücrelerinin temsilidir. (A) FSC-A / SSC-A yolluk, (b) FSC-H / FSC-W çiftli ayrımcılık, (c, d ve e) canlı, soy-negatif CD45.2 + CD4 - CD3 - hücreleri yolluk. -, NKp46 + IL-7Rα + ve NKp46 - IL-7Rα + NKp46 + IL-7Rα: (f) yaygın şekilde eksprese LAK hücre yüzeyi işaretçileri kullanarak, 3 popülasyonları tanımlandığı gibidir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54858/54858fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54858/54858fig5.jpg" /> Şekil 5: düzgün ROX rakamları (a) Ve yanlış (b) cips yüklendi. (A) Düzgün yüklü tek hücreli multipleks gen ifadesi yonga düz çizgiler ve satırlarla görünmelidir. Her bir tepkime haznesi doldurulmuş ve aynı boyuta sahiptir. (B) Yanlış yüklenen tek hücreli multipleks gen ifadesi çip. Boş satırlar ve reaksiyon odaları satır (yeşil kare) yanı sıra, bükme hatları (mavi kare) görünür. Bu özellikler uygunsuz &quot;PRIME&quot; veya &quot;LOAD&quot; adımlar nedeniyle, hem de IFC kuyularında kalan kabarcıklar olabilir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54858/54858fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54858/54858fig6.jpg" /> Şekil 6: FAM düzgün yüklenmiş çip (Floresein amidite) figür. Birkaç döngüden sonra (numuneler üzerinde ve astar bağlı<html> ) Değerlendirildi s, tepkime haznesi parlaklık farklılıklar görünmelidir. amplifikasyon sinyali ile reaksiyon odaları sıfır veya düşük büyütme sinyalleri (yeşil kare) ile reaksiyon odaları daha parlak (mavi kare) görünmelidir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54858/54858fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54858/54858fig7.jpg" /> Şekil 7 (a) ve sonra (b) bu değişikliklerin önce elde edilen ısı haritası. (A) Doğrudan ısı haritası analizi veya tahlil / numune sipariş değişiklik olmadan elde edilmiştir. (B) Değiştirilmiş ısı haritası örnek ve tahlil adı tanımından sonra elde edildi. hiçbir amplifikasyon oluşursa hiçbir giriş kuyuları (mavi kare) elde edilir. Verimsiz primerler (yeşil kare). cDNA seyreltme testi (mor kare).<html> e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/54858/54858fig8.jpg" /> Şekil 8: Tek hücre popülasyonu kümeleme. Bir veri analiz yazılımı popülasyonları arasındaki kümeleme belirlemek için kullanılır. Ücretsiz kümeleme yazılımı online olarak mevcuttur. Tek bir hücrenin bütün ifade profilini değerlendirerek, yazılım gen imzaları ve hücre popülasyonu ilişkileri görüntüleyebilirsiniz. Kırmızı NKp46 + IL-7Rα +, ve yeşil NKp46- IL-7Rα + vardır - mavi NKp46 + IL-7Rα şunlardır: Her kare bir hücreyi temsil eder. Her nüfus spesifik bir gen imzası vardır. NKp46 + IL-7Rα içinde - nüfusun, iki imza nüfus heterojenite doğrulayan, görülebilir.4858 / 54858fig8large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Astarlar </td></tr><tr><td> Actb </td><td> Il-23R </td></tr><tr><td> Aes </td><td> Il-2RA </td></tr><tr><td> Ahr </td><td> Il-2RB </td></tr><tr><td> Bcl2 </td><td> II-7RA </td></tr><tr><td> c-myc </td><td> Klr5 </td></tr><tr><td> Cbfb </td><td> Lef1 </td></tr><tr><td> CD27 </td><td> Ncr1 </td></tr><tr><td> Cd49a </td><td> Nfil3 </td></tr><tr><td> Cd49b </td><td> Notch1 </td></tr><tr><td> CXCR5 </td><td> Notch2 </td></tr><tr><td> Cxcr6 </td><td> Rora </td></tr><tr><td> Eomes </td><td> RORC </td></tr><tr><td> Ets1 </td><td> Runx3 </td></tr><tr><td> Foxo1 </td><td> Tbx21 </td></tr><tr><td> GAPDH </td><td> t-CF3 </td></tr><tr><td> Gata3 </td><td> Tcf7 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> Tle1 </td></tr><tr><td> Hes1 </td><td> Tle3 </td></tr><tr><td> hprt </td><td> Tsc22d3 </td></tr><tr><td> id2 </td><td> Tnfrsf11a </td></tr><tr><td> Il-12rb2 </td><td> Toksikoloji </td></tr><tr><td> Il-18r1 </td><td> Zbtb16 </td></tr><tr><td> Il-1rl1 </td><td> Zbtb7b </td></tr><tr><td> IL-22 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1: Primer listesi.<img alt="Tablo 2" src="/files/ftp_upload/54858/54858table2.jpg" /> Tablo 2: Ön amplifikasyon programı. Preamplıfikasyon programının her adım döngülerinin zaman, sıcaklık ve sayı konusunda tam bilgi ile gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations at JoVE.com

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir.

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

single-cell-gene-expression-using-multiplex-rt-qpcr-to-characterize

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.9K Görüntüleme.  Institut Pasteur.  Bu protokol klonal düzeyde genlerin büyük bir dizi ifadesini değerlendirmek açıklamaktadır. Tek hücreli RT-qPCR örnekleri ve yüzlerce genin için güçlü bir hassasiyetle oldukça güvenilir sonuçlar verir. 

Video: Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...