Bu çalışma, kısmen Myotonic Distrofi Vakfı (MDF-FF-2014-0013) ve Amerikan Kalp Derneği&#39;nden (16SDG29320001) Bilim İnsanı Geliştirme Hibesi&#39;nden bir Fon A Üyesi Ödülüyle desteklendi.

Wildtype ve Nestin-GFP transgenik fareler, Minnesota Üniversitesi&#39;ndeki hayvan tesislerinde barındırıldı. Tüm deneysel prosedürler, Minnesota Üniversitesi&#39;ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve NIH Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu&#39;na uygun olarak hazırlandı. 1. Kas Diseksiyonu ve Tek Hücreli İzolasyon <ol><li> Tribromoetanol (250 mg / kg, ip) ile erişkin fareler (6-10 hafta, hem erkek hem de kadın) euthanize edin ve karın cildini% 70 etanol ile sterilize edin. NOT: Anestezi / ötenazi için ketaminin yerine ketamin yerine tribromoetanol kullanıldı, çünkü ketamin NMDA reseptörleri ile etkileşime girdi ve bu da potansiyel olarak çalışma üzerinde etkili olabilir. </li><li> Fareleri sırt üstü pozisyona getirin ve karın cildi üzerinde yatay bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Arka ayak bacak kaslarını ortaya çıkarmak için cildi elle ters yönde çekerek soyun. </li><li> CollecForseps ve makas kullanarak her iki arka bacaktaki kaslar. Buz üzerinde% 1 penisilin-streptomisin (P / S) takviyeli steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde saklayın. </li><li> Buzla soğutulmuş PBS&#39;de iki kez% 1&#39;lik P / S ile takviye edilmiş arka bacak kaslarını yıkayın ve steril 10 cm&#39;lik bir tablaya aktarın. </li><li> Sinirleri, kan damarlarını ve 2X büyütmede bir diseksiyon mikroskopu altında makas kullanarak bağ dokusunu dikkatle inceleyin. </li><li> Steril makas ve bıçaklar kullanarak kasları ince parçalara kesin (1-2 mm3). Gerekirse, kasların kurumamış olmasını sağlamak için az miktarda Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ekleyin. </li><li> Mekanik olarak, 10 mL&#39;lik bir serolojik pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak dokuyu parçalayın. </li><li> Karışıma yeni yapılmış sindirim çözeltisi (% 0.2 Tip 2 kollajenaz ile takviye edilmiş DMEM) ilave edin. 37 ° C&#39;de 2 saat gentl ile inkübe edinDakikada 35 devirde çalkalama. </li><li> Karışımı homojenize etmek için 18 G&#39;lik bir iğne kullanarak toz haline getirin. Daha sonra 500 xg&#39;de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve sonra pelleti% 0.25 tripsin / EDTA içinde tekrar süspanse edin. 37 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edin. Santrifüj adımını iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Solüsyona% 20 sığır fetüsü serumu (FBS) takviye edilmiş 10 mL DMEM ekleyin ve 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelleti kırmızı kan hücresi liziz tamponunda (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 ve 0.1 mM EDTA) tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelet ayırma tamponunda (20 mM HEPES, pH 7.0; 1 mM EDTA; Ca / Mg 2+ ücretsiz PBS, pH 7.0&#39;da% 1 BSA) tekrar süspansiyon haline getirin. Karışımı, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 40 mikron hücre süzgeçten geçirin. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve pelet 1 mL sıralama tamponunda yeniden süspanse edin. </li><li> SaymakHücre sayısının bir hemasitometre ile alınması ve tekli hücre süspansiyonunun sıralama tamponunda 5 x 106 / mL&#39;ye kadar seyreltilmesi. </li></ol> 2. Hücre boyama ve sıralama <ol><li> Kontrolleri ve numuneyi Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi hazırlayın. Tek hücreli süspansiyonu, ilgili antikorlarla, buz üzerinde, Tablo 1&#39;de açıklandığı üzere 30 dakika boyunca boyayın. </li><li> 5 dakika süreyle 500 xg&#39;de santrifüjleyin ve topakları ayırma tamponuyla iki kez yıkayın. </li><li> Tablo 1&#39;de belirtildiği gibi DAPI tek hücreli solüsyonlara ekleyin. PDGFRβ-PE-FMO kontrolü ve numune için DAPI tek renkli kontrol için 5 μg / mL DAPI (nihai konsantrasyon) ve 1 μg / mL DAPI kullanın. Deney boyunca tüm tüpleri buzda tutun. </li><li> Sıralayıcıyı ve yazılımı açın. İstendiğinde 100 μm&#39;lik bir ayırma yongasını tarayın ve takın. </li><li> Otomatik kurulumu gerçekleştirin ( örneğin, talaş hizalaması, damlacık kalibrasyonu, yan akım kalibrasyonu ve sıralama gecikmesi kalibrasyonuOn) otomatik kurulum boncukları yükleyerek sorulduğunda. </li><li> Otomatik kurulum tamamlandığında, &quot;Deneme&quot; sekmesine gidin, &quot;Yeni&quot; yi tıklayın ve &quot;Genel Şablonlar&quot; dan &quot;Boş Şablon&quot; u seçin. </li><li> &quot;Ölçüm Ayarları&quot; altında, &quot;FL1&quot; için &quot;DAPI&quot;, &quot;FL2&quot; için &quot;Nestin-GFP&quot; ve &quot;FL3&quot; için &quot;PDGFRβ&quot; girin. &quot;FL4&quot; - &quot;FL6&quot; kutularının işaretini kaldırın. </li><li> 405, 488 ve 561 lazerleri etkinleştirmek için kutuları işaretleyin ve &quot;Yeni Deneme Oluştur&quot; u tıklayın. </li><li> &quot;Kompanzasyon Sihirbazını Başlat&quot; seçeneğini seçin ve kompanzasyonu ayarlamak için &quot;Kompanzasyon Sihirbazı&quot; yazılım talimatlarını takip edin. <ol><li> Renksiz kontrolü yükleyin ve &quot;Başlat&quot; ı tıklayın. &quot;Dedektör ve Eşik Ayarları&quot; nı tıklayın ve nüfusu ölçeğe yerleştirmek için FSC ve BSC dedektörlerinin sensör kazancını ayarlayın. </li><li> ilanSadece negatif popülasyonları histogramların sol tarafına yerleştirmek için FL1-FL3 floresans kanallarının kazanç seviyeleri. Verileri kaydetmek için &quot;Kaydet&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> İstendiğinde tek renkli kontrolleri teker teker yükleyin. Verileri kaydetmek için &quot;Başla ve Kaydet&quot; düğmesine tıklayın. Histogramlarda pozitif popülasyonlar için kapıları ayarlayın. &quot;İleri&quot; yi tıklayın. </li><li> &quot;Telafi&quot; sekmesindeki &quot;Matris Hesapla&quot; bölümüne gidin ve telafiyi gerçekleştirmek için &quot;Telafi Ayarlarını Hesaplayın&quot; panelinde &quot;Hesapla&quot; yı tıklayın. &quot;Telafi Sihirbazı&quot; ndan çıkmak için &quot;Bitir&quot; i tıklayın. </li></ol></li><li> PDGFRβ-PE-FMO kontrolünü yükleyin ve &quot;Başlat&quot; ı tıklayın. &quot;Tüm Olaylar&quot; arsa altındaki ilgi hücreleri etrafında bir poligon kapı (A Kapısı) çizin. </li><li> Alt çizgi oluşturmak için A Kapısının içinde çift tıklayın. Y eksenini DAPI olarak değiştirin ve canlı (DAPI düşük ) hücrelere çokgen kapıyı (Kapı B) çizin. I&#39;yi çift tıklayınB kapı kenarında bir çocuk komplosu oluşturmak. X ekseni FSC-H&#39;ye ve Y ekseni FSC-W&#39;ye değiştirin ve çiftleri yok etmek için, tekli noktaların etrafına bir çokgen kapı (Kapı C) çizin. </li><li> Alt çizgi oluşturmak için C Kapısının içinde çift tıklayın. X eksenini Nestin-GFP&#39;ye ve Y ekseni PDGFRβ-PE&#39;ye değiştirin. Verileri kaydetmek için &quot;Kaydet&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> Numuneyi yükleyin ve adım 2.11-2.12&#39;yi tekrarlayın. Kaydettikten sonra, numuneyi korumak için &quot;Duraklat&quot; düğmesine tıklayın. </li><li> PDGFRβ-PE-FMO kontrolü temelinde PDGFRβ + ve Nestin-GFP + hücreleri için geçiş sınırlarını tanımlayın. PDGFRβ + Nestin-GFP - ve PDGFRβ + Nestin-GFP + popülasyonları için kapıları çizin. </li><li> &quot;Sıralama Yöntemi&quot; altında, &quot;2 Yönlü Tüpler&quot; i seçin ve &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP - &quot; ve &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; hücrelerini sol ve sağ toplama tüplerine atayın.dönük olarak. Toplama aşamasında ayırma tamponuyla doldurulmuş 15 mL toplama tüplerini monte edin ve &quot;Toplama Toplama&quot; düğmesine tıklayın &quot;. </li><li> Örneği çalışmaya devam etmek için &quot;Devam Et&quot; düğmesini tıklayın. PDGFRβ + Nestin-GFP - (tip I perişitler) ve PDGFRβ + Nestin-GFP + (tip II perişitler) hücreleri toplamak için &quot;Sırala Başlat&quot; ı tıklayın. </li></ol> 3. Post-sıralama Analizleri <ol><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de sıralanmış hücreleri santrifüjleyin, pelleti perisit ortamın 1 mL&#39;sinde tekrar süspansiyon haline getirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve bir hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu sayın. </li><li> ~ 1 x 104 hücre / cm2&#39;de poli-D-lisin (PDL) ile kaplanmış lamelleri üzerinde Tohum tipi I ve tip II perisitler. Perisit ortamda 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile 3 gün süreyle büyür. </li><li> 3. günde, bir peroksit mikroskobu kullanılarak perisit morfolojisini (faz kontrastı altında) ve endojen Nestin-GFP ekspresyonunu inceleyin(Uyarma lazeri: 488 nm, uyarma filtresi: 470/40 nm ve emisyon filtresi: 515/30 nm). Görüntüleri 20X (0.45 NA) bir hedefin altında çekin. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi sırasıyla adipojenik ve miyojenik farklılaşmayı başlatmak için perisit ortamını adipojenik (fare MSC bazal ortam + adipojenik stimülatör takviyesi) ve miyojenik (DMEM +% 2 at serumu) besiyeri ile değiştirin 20 . Ortamı her 2-3 günde değiştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehid (PFA) içinde 17. günde (adipojenik / miyojenik farklılaşmadan 14 gün sonra) hücreleri düzeltin. NOT: Dikkat, PFA bir kanserojendir. </li><li> Daha önceki yayınlarda 19 , 20&#39;de açıklandığı gibi, perilipin (adiposit markörü) ve S-myozine (olgun miyotür / miyofiber markeri) karşı immünositokimya uygulayın. <ol><li> Sabit hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika PBS içinde 3 kez yıkayın. </li><li> Engelleme tamponu ekleyin (PBS% 5 eşek serumu,% 3 BSA ve% 0.3 Triton X-100 ile takviye edilmiştir) ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Hücreleri anti-perilipin (2 μg / mL) ve / veya anti-S-myosin (2 μg / mL) antikorları ile gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika PBS&#39;de 3 kez yıkayın. </li><li> Hücreleri 1 saat oda sıcaklığında Alexa 555 eşek anti-tavşan (4 ug / mL) ve / veya Alexa555 eşek anti-fare (4 ug / mL) antikorları ile inkübe edin. </li><li> Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika PBS&#39;de 3 kez yıkayın. </li><li> İmmünostained hücreleri DAPI içeren montaj ortamı ile monte edin (materyal tablosuna bakın). Bir floresan mikroskop (uyarma lazeri: 543 nm; 540/45 nm uyarım ve 600/50 nm emisyon) kullanarak perilipin ve S-miyozin ekspresyonunu inceleyin ve 40X&#39;lik bir hedef (0.60 NA) altında görüntü alın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+recruitment+after+injury:+lessons+for+regenerative+medicine.">Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine.</a> Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration.">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li><li>Relaix, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+are+essential+for+skeletal+muscle+regeneration:+the+cell+on+the+edge+returns+centre+stage.">Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage.</a> Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).</li><li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle.">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li><li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration.">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li><li>Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Pax7+and+Pax3+in+adult+regenerative+myogenesis.">Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis.</a> J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).</li><li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration.">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li><li>Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+and+migration+of+myogenic+cells+injected+into+pre-irradiated+muscles+of+mdx+mice.">Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice.</a> J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).</li><li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source.">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li><li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+myoblast+transfer:+a+possible+therapy+for+inherited+myopathies.">Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies.</a> Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).</li><li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration.">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li><li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle.">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li><li>Tamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle-derived+CD34+/45-+and+CD34-/45-+stem+cells+are+situated+hierarchically+upstream+of+Pax7++cells.">Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells.">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat Commun. 2, 499 (2011).</li><li>Mitchell, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+non-satellite+cell+muscle+resident+progenitor+during+postnatal+development.">Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development.</a> Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).</li><li>Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+skeletal+muscle+resident+progenitors+and+their+cell+fate+potentials.">Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials.</a> Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells.">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).</li><li>Kostallari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+the+myovascular+niche+promote+post-natal+myofiber+growth+and+satellite+cell+quiescence.">Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence.</a> Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation.">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li><li>Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+regulates+PDGFRbeta(+)+cell+stemness+and+muscle+development.">Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development.</a> Nat Commun. 7, 11415 (2016).</li><li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+pluripotent+cells+of+the+blood+brain+barrier.">Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier.</a> Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).</li><li>Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+microvascular+pericytes+exhibit+multipotential+stem+cell+activity.">CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+differentially+regulates+the+stemness+of+type+I+and+type+II+pericytes.">Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 28 (2017).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+multitasking+cells+in+the+regeneration+of+injured,+diseased,+and+aged+skeletal+muscle.">Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle.</a> Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).</li></ol>

Tüm yazarların ifşa ettikleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Perisitler kılcal damarların 21 , 26 abluminal yüzeyinde bulunan çok-enerjili perivasküler hücreler 22 , 23&#39;tür . İskelet kaslarında, perisitler adipogenik ve / veya miyojenik yolaklarda 19 , 20 , 24 arasında ayrım yapabilir. Son çalışmalar, farklı markör ekspresyonu ve belirgin farklılaşma potansiyelleri olan perisitlerin iki alt popülasyonunu ortaya çıkardı 19,24,25. Tip I (NG2 + Nestin - ) perisitler adipogenikken, tip II (NG2 + Nestin + ) perisitler miyojeniktir. Bu alt popülasyonların in vitro çalışmalar için izolasyonu, NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transjenik fare hattını gerektirir. Bu saflaştırmanın bağımlılığıProtokolü, çift geçişli fareler üzerindeki uygulamasını önemli ölçüde sınırlar ve dolayısıyla pericyte alt popülasyonlarının biyolojisi üzerinde araştırma yapar. Bu video makalesi, fare iskelet kaslarından tip I ve tip II perisit izolasyonu için alternatif bir yöntem göstermektedir. Bu yeni yöntem hala hücre ayırma için FACS tabanlı bir tekniğe dayanmaktadır. Bununla birlikte, transgenik NG2-DsRed flüoresan kullanmak yerine, endojen PDGFRβ sinyalini hedef alır. Bu, NG2-DsRed ekspresyonunun iskelet kasında 19 PDGFRβ ile birlikte lokalize olduğu gözlemine dayanmaktadır. Özgün yöntemle karşılaştırıldığında, bu protokolün birçok avantajı vardır. Birincisi, NG2-DsRed genetik altyapısını gerektirmez, ancak Nestin-GFP geçmişi hala gereklidir. İkincisi, NG2&#39;yi hedeflemek yerine, bu protokol, doğrulanmış ve piyasada bulunan antikorlar ile iyi tanımlanmış bir markör olan PDGFRβ&#39;ı kullanmaktadır. Üçüncüsü, bo&#39;nun aynı anda izolasyonuna izin verirT tip I ve tip II perisitlerdir. Örneğin, bu protokol kullanılarak izole edilen PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + hücreleri, farklı diferansiasyon özellikleri sergilemektedir. Spesifik olarak, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , ancak PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + hücreleri, yağ hücrelerinde adipostatik koşullarda ayrım yaparken, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , ancak PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , Hücreler miyojenik koşullar altında miyogenik farklılaşmaya maruz kalırlar. Bu veriler, NG2-DsRed + Nestin-GFP - hücrelerinin (tip I perisitler) adipogenik olduğunu ve NG2-DsRed + Nestin-GFP + hücrelerinin (tip II perisitler) miyojenik olduğunu gösteren önceki raporlarla tutarlıdır 19 , 24 , izole PDGFRβ -PE + Nestin-GFP - ve PDGFRβ-PE + NEstin-GFP + hücreleri, sırasıyla, tip I ve tip II perisitlerdir. Birlikte, bu sonuçlar, bu yeni protokolün, perisit alt popülasyonlarının fare iskelet kaslarından ve muhtemelen diğer dokulardan nispeten kolay izolasyonu / saflaştırılmasına izin verdiğini önermektedir. Bu, çevresel biyoloji ve çeşitli hastalıklar için terapötik çevirileri üzerine çalışmaları destekleyecektir. Bununla birlikte, bu yöntemin PDGFRβ kullanımı nedeniyle bir sınırlaması olduğunu belirtmek gerekir. Önceki bir çalışmada, PW1 + interstisyel hücrelerin (PIC&#39;ler) PDGFRβ 20&#39;yi de eksprese ettiği gösterilmiştir. Dolayısıyla, izole PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + popülasyonları, PIC&#39;leri içerebilir. Bununla birlikte, perisitlerin iskelet kasında PIC&#39;lerden daha fazla olduğu ve perisitlerin benimkinden geçmediği göz önüne alındığında, bu periferik perifitlerin perisit farklılaşmasına katkısı sınırlıdırOgenesis 19 , 25 . Bu yöntem kullanılarak tip I ve tip II perisitler sırasıyla% 9.5 ve% 2.1 verimle elde edildi. Bu sayılar, çift transjenik farelerde 19 bildirilen verimlerle sırasıyla% 2.8 ve% 3.4 karşılaştırılabilirdi. Hafif farklılık, farklı geçiş stratejileri veya sindirim protokollerine bağlı olabilir. Bu sonuçlar yine önerilen protokolün perisit alt tiplerini iskelet kaslarından izole etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu protokolün kritik adımları aşağıdaki noktaları içerir: (1) iskelet kaslarının tamamen kıyılmış olduğundan ve 10 mL serolojik pipetten kolayca geçebildiğinden emin olun. Büyük kas blokları enzimatik sindirime müdahale eder ve verimi önemli ölçüde düşürür. (2) Kas sindirimi için yeni yapılmış kolajenaz çözeltisini kullanın ve inkübasyon sırasında hafifçe çalkalamaya (35 devir / dakika) izin verin. (3)Boyama ve ayırma adımları boyunca buz üzerinde kontrol ve numune alma. (4) Kapı sınırlarını ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın. Farklılaşma yeteneğine ek olarak, tip I ve tip II perisitler de farklı morfolojiyi göstermektedir. Özellikle, tip I perişitlerin kısa süreçleri ve nispeten büyük çekirdekli yuvarlak hücre gövdeleri vardır. Öte yandan tip II perisitler, genellikle uzun ve ince süreçler ve küçük çekirdeklerle küçük hücreli cisimcikler içerir. Morfolojik farklılıklar, tip I ve tip II perisitlerin doğal olarak perisitlerin heterojen yapısı ile uyumlu olduğunu göstermektedir 21 . Tip I ve tip II perisitlerin yanı sıra altta yatan moleküler mekanizmalar arasındaki farkı neden / sürdüren şey, belirsizliğini koruyor ve daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyuyor. Bu izolasyon protokolü, bu önemli soruları cevaplamaya yardımcı olacaktır.

Kas distrofisi şimdiye kadar etkili bir tedavisi olmayan bir kas dejeneratif bozukluğudur. Doku yenilenmesini teşvik eden terapilerin gelişimi daima büyük ilgi gördü. Hasar sonrası doku rejenerasyonu ve onarımı yerleşik kök hücrelere / progenitör hücrelere bağlıdır 1 . Uydu hücreleri, kas yenilenmesine 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 katkıda bulunan miyojenik prekürsör hücrelere adanmıştır. Bununla birlikte, bunların klinik kullanımı, sınırlı göç ve enjeksiyondan sonra düşük hayatta kalma oranlarının yanı sıra , in vitro amplifikasyon sonrasında azalmış farklılaşma yetenekleri nedeniyle engellenmektedir 8 , 9 , 10 , 11 . Satelli&#39;ye ek olarakIskelet kasları, trombosit türevi büyüme faktörü reseptör-beta (PDGFRp) -pozitif interstisyel hücreler gibi miyojenik potansiyeli 12 , 13 , 14 , 15 , 16 olan birçok hücre popülasyonunu da içerir. Kas türevi PDGFRβ + hücrelerinin, miyojenik hücrelere farklılaşabildiklerini ve kas patolojisini geliştirdiklerini ve 14 , 17 , 18 , 19 , 20 nolu fonksiyonları yerine getirebildiklerini gösteren kanıtlar vardır. PDGFRβ çoğunlukla pluripotik 22 , 23 olan perivasküler hücreler olan perisitleri 21 işaret eder. PDGFRβ&#39;ya ilaveten, Neuron-Glial 2 (NG2) ve CD146 da dahil olmak üzere birçok diğer belirteçler, iPerisitleri dentify 21 . Bununla birlikte, bu belirteçlerin hiçbirinin çevreye özgü olmadığına dikkat edilmelidir. Son çalışmalar, tip I ve tip II olarak adlandırılan, farklı moleküler belirteçleri ifade eden ve farklı fonksiyonlar 19 , 24 , 25 gösteren kas perisitlerinin iki alt türünü ortaya çıkarmıştır. Biyokimyasal olarak, tip I perisitler NG2 + Nestin - iken, tip II perisitler NG2 + Nestin + 19 , 24&#39;tür. Fonksiyonel olarak, tip I perisitler adipogenik farklılaşmaya maruz kalabilirler, yağ birikimi ve / veya fibrozise katkıda bulunurlar, oysa tip II perisitler miyojenik yol boyunca ayırt ederek kas yenilenmesine katkıda bulunurlar 19 , 24 , 25 . Bu sonuçlar şunu göstermektedir: (1) tip I perisitler bYağlı dejeneratif bozuklukların / fibrozun tedavisinde hedeflenen ve (2) tip II perisitlerin, kas distrofisi için büyük terapötik potansiyele sahip olduklarını göstermiştir. Bu popülasyonların daha fazla araştırılması ve karakterizasyonu, tip I ve tip II perisitlerin yüksek saflıkta ayrılmasını sağlayan bir izolasyon protokolü gerektirir. Şu anda, perisit alt popülasyonlarının izolasyonu NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transjenik fareler 19 , 24&#39;e dayanmaktadır. NG2-DsRed farelerin mevcudiyeti ve çoğu NG2 antikorunun kalitesi, bu yöntemin yaygın kullanımını sınırlar. Tüm NG2 + perisitlerinin ayrıca 19 , 20 , 24 iskelet kaslarındaki PDGFRβ&#39;yı eksprese ettiği göz önüne alındığında, percyit&#39;lerin izolasyonu ve alt popülasyonları için NG2&#39;nin PDGFRβ ile değiştirilebileceği hipotezi altındayız. Bu çalışma, FACS tabanlı bir protokolü tanımlamaktadır.PDGFRβ boyama ve Nestin-GFP sinyalini kullanır. Bu yöntem araştırmacılar için daha az talepkar, çünkü: (1) NG2-DsRed fonunu gerektirmez ve (2) iyi karakterize edilmiş ticari olarak temin edilebilir PDGFRβ antikorlarını kullanır. İlaveten, tip I ve tip II perisitlerin yüksek saflıkta eşzamanlı olarak izole edilmesini sağlar ve bu perisit alt popülasyonlarının biyolojik ve terapötik potansiyelleri hakkında daha fazla araştırma yapılmasına izin verir. Saflaştırmanın ardından, bu hücreler kültürde yetiştirilebilir ve morfolojileri görselleştirilebilir. Bu çalışma aynı zamanda, çift transgenik farelerden saflaştırılanlar gibi bu yöntemi kullanarak izole edilen tip I ve tip II perisitlerin sırasıyla adipojenik ve miyojenik olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH800</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Setup Beads</td><td>Sony</td><td>LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte Growth Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC Basal Medium (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&amp;beta;-PE Antibody</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin Antibody</td><td>Sigma</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>S-Myosin Antibody</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-rabbit antibody&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-mouse antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G Needles</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serological Pipette</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles

Perisitler perivasküler multipotent hücreler olup, farklı organlarda hatta aynı dokuda heterojenlik gösterirler. İskelet kaslarında, farklı moleküler belirteçleri ifade eden ve ayırdedici özelliklere sahip en az iki perisit alt popülasyonu (tip I ve tip II olarak adlandırılır) bulunur. NG2-DsRed ve Nestin-GFP çift transgenik fareler kullanılarak, tip I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) ve tip II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) perisitler başarıyla izole edilmiştir. Bununla birlikte, bu çift transgenik farelerin mevcudiyeti bu saflaştırma yönteminin yaygın kullanılmasını engeller. Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna izin veren alternatif bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, floresanla aktive hücre ayırma (FACS) tekniğini kullanır ve Nestin-GFP sinyaliyle birlikte NG2 yerine PDGFRβ&#39;yı hedef alır. İzolasyondan sonra, I ve ty yazınPe II pericyitler farklı morfolojilere sahiptir. Buna ek olarak, çift transgenik farelerden izole edilenler gibi bu yeni yöntemle izole edilen tip I ve tip II perisitler sırasıyla adipojenik ve miyojeniktir. Bu sonuçlar, bu protokolün perisit alt popülasyonlarını iskelet kaslarından ve muhtemelen diğer dokulardan izole etmek için kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Lazer yoğunluğu ve kanal dengelemesi de dahil olmak üzere FACS parametreleri, lekesiz kontrol ve tek renkli kontrollerin sonuçlarına dayanarak düzeltilir. PDGFRβ-PE-FMO kontrolü, PDGFRβ-PE + popülasyonu için kapıyı ayarlamak için kullanılır ( Şekil 1A ). PDGFRβ-PE - hücreleri arasında, Nestin-GFP + ve Nestin-GFP&#39;yi temsil eden iki popülasyon açıkça ayrılır ( Şekil 1A ). PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP popülasyonları için geçiş sınırları, PDGFRβ-PE + ve Nestin-GFP + için kapıyı temel alır ( Şekil 1A ). Bu sınırlar, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (tip II perisitler) ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (tip I perisit) tanımlamak ve sıralamak için kullanılırEs) hücrelerini ( Şekil 1B ) göstermektedir . İzole PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + hücreleri tek hücreli çözeltideki toplam hücrelerin sırasıyla sırasıyla% 9.5 ve% 2.1&#39;ini oluşturmaktadır. FACS ile izole edilmiş tip I ve tip II perisitler, kültürde üç gün sonra morfolojik farklılıkları göstermektedir. Tip I perişitler, yuvarlak hücre cisimcikleri ve kısa süreçlerle amoeboid morfolojiyi gösterir ( Şekil 2 ). Bununla birlikte, Tip II perisitler, küçük hücreli bedenler ve uzun, ince işlemlerle karakterize edilen dallanmış morfolojiyi göstermektedir ( Şekil 2 ). Tip II perisitlerin çoğu Nestin-GFP + olarak kalırken, tip I perisitler Nestin-GFP&#39;dir - ( Şekil 2 ). Buna ek olarak, tip I, ancak tip II değil, pericy.Tes, adipogenik ortamda 14 gün sonra perilipin ifade eden adipositleri ayırt eder ( Şekil 3 ). Tip I değil, tip II, perisitler, myogenik ortamda 14 gün sonra S-myosin ifade eden miyotlara farklılaşmaktadır ( Şekil 4 ). Bu sonuçlar tip I perisitlerin adipogenik olduğunu, tip II perisitlerin miyojenik olduğunu kuvvetle göstermektedir. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig1.jpg" /> Şekil 1 : Gating sınırları ve temsili sıralama. ( A ) PDGFRβ-PE-Nutin-GFP - ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + geçit sınırlarını gösteren, PDGFRβ-PE-FMO kontrolünün floresan arsa. ( B ) PDGFRβ-PE + Nestin-GFP dağılımını gösteren numunenin temsili floresan düzeni <s(Tip I perisitler) ve PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (tip II perişitler) hücreleridir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig2.jpg" /> Şekil 2: Sınıf I ve tip II perisitlerdeki morfoloji ve Nestin-GFP ekspresyonu. Sınıflandırılmış tip I ve tip II perisitler lamelleri üzerine ekildi ve 3 gün süreyle perisit ortamda yetiştirildi. Tip I perisitler, kısa proseslere sahip yuvarlak hücreli cisimler ve flüoresan mikroskop altında (eksitasyon Lazeri: 488 nm, uyarma ve emisyon filtreleri: sırasıyla 470/40 nm ve 515/30 nm) endojen GFP sinyali vermedi. Tip II perisitler, uzun ve ince işlemlerle birlikte küçük hücre gövdeleri gösterdi ve a&#39;nın altında güçlü bir endojen GFP sinyali gösterdi.Floresan mikroskopu aynı ayarlar altında. Tartı çubuğu = 100 μm <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig3.jpg" /> Şekil 3: Sınıf I ve tip II perisitlerin adipojenik farklılaşması. Sınıflandırılmış tip I ve tip II perisitler, perisit ortamda 3 gün süreyle yetiştirildi. Daha sonra 14 gün boyunca adipojenik ortamda farklılaştılar. Hücreler sabitlendi ve anti-perilipin antikoru ile immüno-lekelendi, ardından Alexa555 eşek anti-tavşan antikoru uygulandı. İmmünositokimya, floresan mikroskobunda (uyarıcı lazer: 543 nm, uyarılma ve emisyon filtreleri: 540/45 nm ve 600/50 nm, saygı) adiposit işaretleyici perilipin (kırmızı) ifade eden tip I fakat tip II olmayan perisitleri gösterdi<html> yanıtını verdiler). Ölçek çubuğu = 50 μm <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig3large.jpg" target="_blank">Bu şekli daha büyük görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig4.jpg" /> Şekil 4 : Sınıf I ve tip II perisitlerin miyojenik olarak farklılaşması. Sınıflandırılmış tip I ve tip II perisitler 3 gün boyunca perisit ortamda yetiştirildi ve daha sonra 14 gün süreyle miyojenik ortam içinde farklılaştırıldı. Hücreler sabitlendi ve anti-S-miyozin antikoru ve Alexa555 eşek anti-fare antikoru ile immüno-lekelendi. İmmünositokimya, floresan mikroskop altında (eksitasyon lazeri: 543 nm, uyarılma ve emisyon filtreleri: 540/45 nm ve 600/50 nm), olgun miyotür / miyofiber markeri S-miyozini (kırmızı) ifade eden, tip II değil, tip II perisitlerin gösterdi , sırasıyla). Ölçek çubuğu = 50 μm//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Tüpler </td><td> boyanma </td></tr><tr><td> Renksiz kontrol </td><td> Vahşi tipli farelerden tek hücre süspansiyonu </td></tr><tr><td> DAPI tek renkli kontrol (ölü hücrenin dışlanması) </td><td> Vahşi tipli farelerden + DAPI (5 ug / mL) tek hücre süspansiyonu, </td></tr><tr><td> GFP tek renkli kontrol </td><td> Nestin-GFP farelerinden tek hücre süspansiyonu </td></tr><tr><td> PE tek renkli kontrol </td><td> OneComp eBeads + PDGFRβ-PE antikoru (4 ug / mL) </td></tr><tr><td> PE-FMO kontrolü </td><td> Nestin-GFP farelerinden tek hücre süspansiyonu + DAPI (1 ug / mL) </td></tr><tr><td> Numune </td><td> Nestin-GFP farelerinden + PDGFRβ-PE antikorundan (4 ug / mL) tek hücre süspansiyonu +DAPI (1 ug / mL) </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Tek renk kontrolleri, PDGFRβ-PE-FMO kontrolü ve kas örneği için boyama protokolü.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles at JoVE.com

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna olanak tanıyan bir FACS tabanlı protokolü açıklamaktadır.

Fare İskelet Kasılarından Tip I ve Tip II Perisitlerin İzolasyonu

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K Görüntüleme.  University of Minnesota.  Bu çalışma, tip I ve tip II perisitlerin iskelet kaslarından kolay ve aynı anda izolasyonuna olanak tanıyan bir FACS tabanlı protokolü açıklamaktadır. 

Video: Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Birincil fare iskelet kas mikrovasküler endotel hücre izolasyon

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Biyoloji

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Tıp

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

Erken Doğum Sonrası Gelişimde Emery-Dreifuss Musküler Distrofi'nin Murine Modelinden Tek Miyofiber İzolasyon ve Kültür

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells (MuSCs) have the ability to make new muscle, whereas fibro-adipogenic progenitors (FAPs) contribute to stromal supporting tissues and have the ability to make fibroblasts and adipocytes. Both MuSCs and FAPs reside in a state of prolonged reversible cell cycle exit, called quiescence. The quiescent state is key to their function. Quiescent stem cells are commonly purified from multiple muscle tissues pooled together in a single sample. However, recent studies have revealed distinct differences in the molecular profiles and quiescence depth of MuSCs isolated from different muscles. The present protocol describes the isolation and study of MuSCs and FAPs from individual skeletal muscles and presents strategies to perform molecular analysis of stem cell activation. It details how to isolate and digest muscles of different developmental origin, thicknesses, and functions, such as the diaphragm, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), and the masseter muscles. MuSCs and FAPs are purified by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and analyzed by immunofluorescence staining and 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay.

This protocol describes the isolation of muscle stem cells and fibro-adipogenic progenitors from individual skeletal muscles in mice. The protocol involves single muscle dissection, stem cell isolation by fluorescence activated cell sorting, purity assessment by immunofluorescence staining, and quantitative measurement of S-phase entry by 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine incorporation assay.

Sessiz Kök Hücre Popülasyonlarının Bireysel İskelet Kaslarından İzolasyonu

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...