Son zamanlarda, serebral perisitlerin rolü nörolojik bozukluklar ve beyin fonksiyonu belirgin hale gelmiştir. Bu nedenle, bu hücreler için kültür güvenilir bir yöntem geliştirilmesi zorunludur. Murine serebral perisit lerin çıkarılması na yönelik protokolümüz, in vitro çalışmalar ve perisitlerin yüksek saflıkta ve hücre verimi ile sağlanması için güvenilir bir aracı temsil eder.
Anupriya Mehra ile prosedürü göstermek Lucie Dehouck, benim laboratuvar bir teknisyen olacak. Belirli bir patojen içermeyen dört ila altı haftalık erkek C57BL/6 fareden beyni steril kuru tiftiksiz bir mendilin üzerine yerleştirerek ve beyincik, striatum ve oksipital sinirleri çıkarmak için kavisli uç forceps kullanarak başlayın. Tüm görünür menenjler kaldırmak ve baş aşağı beyin dokusu açmak için bir pamuklu bez kullanın.
Hafif dışa inme ile loblar açın ve görünür kan damarlarının tüm kaldırın. Daha sonra menenjsiz beyin dokusunu 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve 15 mililitre soğuk yıkama tamponu B.To dokuyu homojenize edin, beyin örneğini bir Dounce doku öğütücü harç tüpüne aktarın ve tüpe 3-4 mililitre yıkama tamponu Ekleyin. 55 kez doku kıyma için gevşek bir havaneli kullanın, sonra tampon B yıkama ile havaneli durulayın ve sıkı bir havaneli ile doku bulamaç kıyma 25 kez.
Homojenizasyonun sonunda, iki 50 mililitrelik tüpler arasındaki bulamaç eşit aliquot ve soğuk% 30 büyükbaş serum albumin dextran hacmi 1.5 kat ekleyin. Sonra şiddetle bulamaç karıştırmak için tüpleri sallayın. Vasküler fraksiyonu izole etmek için, santrifüj ile hücreleri tortu ve iki yeni tüpler içine supernatants transfer.
B tamponu buz üzerinde yıkama pelet saklayın. B buz üzerinde üç mililitre soğuk yıkama tampon B pelet resuspend. Hasat edilen süpernatanları santrifüj edin ve bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
Supernatants atın ve yıkama tampon B.Then resuspended pelet havuz ve taze soğuk yıkama tampon B.Further 10 milimetrelik pipet ile hücreleri ayrıştırın 10 mililitre havuzlu hücre süspansiyon son hacmi getirmek üç mililitre pelet yeniden askıya altı pelet görünür kalan kümeleri görünür ve bir vakum filtresi montaj ve bir nylon örgü süzgeç ikulaklık hücre filtrelemek için bir vakum filtresi montaj ve bir nylon örgü süzgeç kullanın. Bir Petri kabına süzgeç yerleştirin ve taze yıkama tampon B ile örgü temizleyin ve herhangi bir kılcal kurtarmak için kazıma. Sonra taze bir filtre ile ikinci bir filtreleme gerçekleştirin.
Filtrasyonu iki tüp arasında eşit olarak bölün ve hücreleri santrifüj ile toplayın. Supernatants attıktan sonra, enzimler ile önceden ısınmış yıkama tampon B içeren tek bir tüp içine pelet havuz ve tüp için önceden ısıtılmış Kollajenaz / Dispase ekleyin. 30 mililitre soğuk yıkama tamponu B.Collect santrifüj ile hücreleri toplamak ve dikkatle supernatant atın reaksiyonu durdurmadan önce 37 santigrat derece tam 33 dakika bir sallayarak masa suyu banyosutüp tüp yerleştirin.
Hızlı ama dikkatlice tampon B altı kez yıkama pelet askıya ve süspansiyon tekrar santrifüj. Supernatant attıktan sonra, tam DMEM orta 18 mililitre pelet resuspend ve üç Matrigel kaplı altı iyi plakadokuz kuyularda tam DMEM hücre süspansiyon iki mililitre tohum. Hücre kültürlerini steril 37 derece 5%5 karbondioksit kuvöze yerleştirin ve her kuyudaki enkazı dikkatlice çıkarmadan önce 24 saat boyunca taze DMEM ortamı ekleyin.
48 saat sonra, her 48 saatte bir orta yı değiştirin. 8-10. günde hücreler %100 birleştiğinde perisit kültür ortamındaki hücreleri yeni jelatin kaplı altı kuyulu plakalara aktarın ve hücreleri altı ila yedi gün boyunca hücre kültür kuvözlerine geri döndürün. Daha sonra 17.
Pasaj sıfırdan ikinci bölüme kadar, endotel hücrelerinin ve perisitlerde kademeli artışın tespit edilebildiği spesifik morfolojik özellikler vardır. Sıfır kültürlü bir pasajda, mikrodamarlardan gelişen uzamış endotel hücreleri bolmiktarda bulunur. Bu bolluk birinci geçitten sonra azalır ve ikinci ayetten sonra yoktur.
Aksine, perisitler erken kültürlerde nadir dörtgen hücreler olarak görünür ve ikinci geçit ile bol hale gelir. NG2, CD146 ve PDGFR beta ekspresyonunun değerlendirilmesi, perisit kültürünün saflığını nicel PCR, immünositokimya ve Batı lekelerine göre değerlendirmek için kullanılabilir. Enzim sindirimi protokolün başarısı için kritik bir adımdır.
Enzim konsantrasyonlarını ve kuluçka süresini kesinlikle izlediğinden emin olun.
