עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי מענק קרן-A-FO של קרן Dystrophy Myotonic (MDF-FF-2014-0013) ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני (16SDG29320001).

Wildtype ו Nestin-GFP מהונדס עכברים היו שוכנו במתקן החיות באוניברסיטת מינסוטה. כל הניסויים הניסויים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת מינסוטה היו בהתאם NIH מדריך לטיפול ושימוש של חיות מעבדה. 1. ניוון שרירים בודד בידוד התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בוגרים (6-10 שבועות, הן זכר והן נקבה) עם tribromoethanol (250 מ&quot;ג / ק&quot;ג, IP) ו לעקר את עור הבטן שלהם עם אתנול 70%. הערה: Tribromoethanol שימש כאן במקום קטמין עבור הרדמה / המתת חסד, כמו ketamine ידוע אינטראקציה עם קולטני NMDA, אשר עלולה להשפיע על המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכברים במצב שכיבה להשתמש איזמל לבצע חתך אופקית על עור הבטן. לקלף את העור ביד, מושך בכיוונים מנוגדים לחשוף את השרירים hindlimb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולקלא את השרירים משני hindlimbs באמצעות מלקחיים ומספריים. אחסן אותם ב סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בתוספת 1% פניצילין סטרפטומיצין (P / S) על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השרירים hindlimb גזור ב- PBS קר כקרח בתוספת 1% P / S פעמיים ולהעביר אותם צלחת סטרילית 10 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את העצבים, כלי הדם, ורקמות החיבור מן השרירים באמצעות מלקחיים ומספריים תחת מיקרוסקופ לנתיחה בהגדלה 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דק קוצצים את השרירים לחתיכות קטנות (1-2 מ&quot;מ 3 ) באמצעות מספריים סטריליים להבים. אם יש צורך, להוסיף כמות קטנה של Dulbecco השתנה נשר בינוני (DMEM) כדי להבטיח כי השרירים לא יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכני לשבור את הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה דרך פיפטה 10 מ&quot;ל סרולוגי 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טריים פתרון העיכול (DMEM בתוספת 0.2% סוג 2 collagenase) לתערובת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם עדיןE-agitation ב 35 סיבובים / דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate באמצעות מחט 18 G כדי homogenize את התערובת. ואז, צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ולאחר מכן resuspend גלולה 0.25% טריפסין / EDTA. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חזור על צעד צנטריפוגה פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של DMEM בתוספת 20% בסרום שור עוברית (FBS) לפתרון צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה במאגר תמוגה תא דם אדום (155 מ&quot;מ NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3 , ו 0.1 מ&quot;מ EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה במיון מיון (20 מ&quot;מ HEPES, pH 7.0, 1 מ&quot;מ EDTA, ו 1% BSA ב Ca / Mg 2 + חינם PBS, pH 7.0). סנן את התערובת באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג ההשעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מיון המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור אתמספר תא עם hemocytometer ו לדלל את ההשעיה תא בודד ל 5 x 10 6 / mL במאגר מיון. </li></ol> 2. תא מכתים ומיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפקדים ואת המדגם כמתואר בטבלה 1 . כתם ההשעיה תא בודד עם נוגדנים בהתאמה על קרח במשך 30 דקות, כמתואר בטבלה 1 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות ולשטוף את הכדורים פעמיים עם מיון המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DAPI לפתרונות תא בודד, כפי שצוין בטבלה 1. השתמש DAPI 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI (ריכוז סופי) עבור DAPI צבע אחד שליטה ו 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI עבור PDGFRβ-PE-FMO שליטה המדגם. שמור את כל הצינורות על הקרח לאורך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את סדרן ואת התוכנה. סרוק והכניס שבב מיון 100 מיקרומטר כאשר תתבקש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את ההגדרה האוטומטית ( כלומר, יישור שבב, כיול אגל, כיול זרם צד, ועיכוב מיון calibratiב) על ידי טעינת חרוזי ההתקנה אוטומטית כאשר תתבקש לעשות זאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ההגדרה האוטומטית הושלמה, עבור לכרטיסייה &quot;ניסוי&quot;, לחץ על &quot;חדש&quot; ובחר את &quot;תבנית ריקה&quot; מתוך &quot;תבניות ציבוריות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;הגדרות מדידה&quot;, הזן &quot;DAPI&quot; עבור &quot;FL1&quot;, &quot;Nestin-GFP&quot; עבור &quot;FL2&quot; ו &quot;PDGFRβ&quot; עבור &quot;FL3.&quot; בטל את הסימון של תיבות עבור &quot;FL4&quot; - &quot;FL6&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את התיבות כדי להפעיל את הלייזרים 405, 488 ו- 561 ולחץ על &quot;צור ניסוי חדש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את &quot;התחל פיצוי אשף&quot; ולאחר מכן פעל לפי &quot;אשף פיצוי&quot; התוכנה מבקשת להגדיר את הפיצוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את השליטה unstained ולחץ על &quot;התחל&quot;. לחץ על &quot;גלאי &amp; הגדרות סף&quot; ולהתאים את הרווח חיישן של FSC ו BSC גלאי למקום האוכלוסייה על הסולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוֹדָעָהרק את רמות הרווח של FL1-FL3 ערוצי הקרינה למקום אוכלוסיות שליליות בצד שמאל של היסטוגרמות. לחץ על כפתור &quot;הקלטה&quot; כדי להקליט את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען בודדים בצבע אחד אחד כאשר תתבקש. לחץ על &quot;התחל והקלט&quot; כדי להקליט את הנתונים. להתאים את השערים לאוכלוסיות חיוביות על היסטוגרמות. לחץ על &quot;הבא&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל &quot;חישוב מטריקס&quot; על הכרטיסייה &quot;פיצוי&quot; ולחץ על &quot;חישוב&quot; בלוח &quot;חישוב פיצוי הגדרות&quot; לבצע את הפיצוי. לחץ על &quot;סיום&quot; כדי לצאת מהאשף &quot;פיצוי&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את PDGFRβ-PE-FMO שליטה ולחץ על &quot;התחל&quot;. צייר שער מצולע (שער A) סביב התאים של עניין תחת העלילה &quot;כל האירועים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פעמיים בתוך שער A כדי ליצור מגרש ילדים. שנה את ציר Y ל- DAPI וצייר שער מצולע (שער B) סביב תאים חיים (DAPI) נמוכים . לחץ פעמיים על iNside שער B כדי ליצור מגרש הילד. לשנות את ציר ה- X כדי FSC-H ואת ציר Y ל- FSC-W ו לצייר שער מצולע (שער C) סביב singlets לחסל הכפולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פעמיים בתוך שער C כדי ליצור מגרש ילדים. שנה את ציר ה- X ל- Nestin-GFP ואת ציר ה- Y ל- PDGFRβ-PE. לחץ על כפתור &quot;הקלטה&quot; כדי להקליט את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם וחזור על הצעדים 2.11-2.12. לאחר ההקלטה, לחץ על &quot;השהה&quot; כדי לשמור על המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גבולות gating עבור PDGFRβ + ו Nestin-GFP + תאים המבוססים על PDGFRβ-PE-FMO שליטה. צייר השערים עבור האוכלוסייה PDGFRβ + Nestin-GFP - ו PDGFRβ + Nestin-GFP + אוכלוסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &quot;שיטת מיון&quot;, בחר &quot;2-way צינורות&quot; ולהקצות &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP - &quot; ו &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot; לתאי צינורות שמאל וימין, מחדשבצורה מדהימה. הרכבה מיון המיון מלא 15 מ&quot;ל צינורות איסוף על הבמה אוסף ולחץ על &quot;טען אוסף&quot; כפתור &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הלחצן &quot;המשך&quot; כדי לשמור על הדגימה פועלת. לחץ על &quot;התחל מיון&quot; כדי לאסוף PDGFRβ + Nestin-GFP - (סוג אני pericytes) ו PDGFRβ + Nestin-GFP + (סוג II pericytes) תאים. </li></ol> 3. לאחר מיון המיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים מיון ב 500 xg במשך 5 דקות, resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מדיום pericyte (ראה טבלה חומרים ), ולספור את צפיפות התא באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג זרע אני ואת סוג II pericytes על פולי- D- ליזין (PDL) מצופה coverslips ב ~ 1 x 10 4 תאים / ס&quot;מ 2 . לגדול במדיום pericyte במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, לבחון את המורפולוגיה pericyte (תחת בניגוד לעומת) אנדוגני Nestin-GFP ביטוי באמצעות מיקרו פלואורסצנטיהיקף (לייזר עירור: 488 ננומטר, מסנן עירור: 470/40 ננומטר, מסנן פליטה: 515/30 ננומטר). קחו תמונות תחת מטרה 20X (0.45 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום pericyte עם בינוני adipogenic (MSC העכבר הבסיס + בינוני adipogenic תוספת גירוי) ו myogenic (DMEM + 2% בסרום סוס) בינוני ליזום adipogenic ו myogenic בידול, בהתאמה, כפי שתואר לעיל 20 . שנה את המדיום כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים ביום 17 (14 ימים לאחר בידול אדיפוגני / myogenic) ב paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: זהירות, PFA הוא מסרטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע immunocytocochemistry נגד perilipin (סמן adipocyte) ו- S- myosin (בוגר myotube / myofiber בוגרת), כפי שתואר בפרסומים קודמים 19 , 20 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים קבוע 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חיץ חסימה (PBSבתוספת 5% סרום חמור, 3% BSA, ו 0.3% Triton X-100) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם antilodies perilipin (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו / או אנטי- S- מיוזין (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) נוגדנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם Alexa 555 חמור נגד ארנבת (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו / או Alexa555 חמור אנטי עכבר (4 ​​מיקרוגרם / מ&quot;ל) נוגדנים בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תאים immunostained עם המדידה הרכבה המכיל DAPI (ראה את טבלת החומרים). בחן perilipin ו- S- ביטוי myosin באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור לייזר: 543 ננומטר, עירור 540/45 ננומטר ו 600/50 ננומטר פליטת) ולקחת תמונות תחת מטרה 40X (0.60 NA). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+recruitment+after+injury:+lessons+for+regenerative+medicine.">Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine.</a> Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration.">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li><li>Relaix, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+are+essential+for+skeletal+muscle+regeneration:+the+cell+on+the+edge+returns+centre+stage.">Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage.</a> Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).</li><li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle.">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li><li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration.">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li><li>Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Pax7+and+Pax3+in+adult+regenerative+myogenesis.">Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis.</a> J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).</li><li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration.">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li><li>Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+and+migration+of+myogenic+cells+injected+into+pre-irradiated+muscles+of+mdx+mice.">Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice.</a> J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).</li><li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source.">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li><li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+myoblast+transfer:+a+possible+therapy+for+inherited+myopathies.">Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies.</a> Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).</li><li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration.">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li><li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle.">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li><li>Tamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle-derived+CD34+/45-+and+CD34-/45-+stem+cells+are+situated+hierarchically+upstream+of+Pax7++cells.">Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells.">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat Commun. 2, 499 (2011).</li><li>Mitchell, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+non-satellite+cell+muscle+resident+progenitor+during+postnatal+development.">Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development.</a> Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).</li><li>Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+skeletal+muscle+resident+progenitors+and+their+cell+fate+potentials.">Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials.</a> Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).</li><li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells.">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).</li><li>Kostallari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+the+myovascular+niche+promote+post-natal+myofiber+growth+and+satellite+cell+quiescence.">Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence.</a> Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation.">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li><li>Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+regulates+PDGFRbeta(+)+cell+stemness+and+muscle+development.">Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development.</a> Nat Commun. 7, 11415 (2016).</li><li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+developmental,+physiological,+and+pathological+perspectives,+problems,+and+promises.">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+pluripotent+cells+of+the+blood+brain+barrier.">Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier.</a> Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).</li><li>Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+microvascular+pericytes+exhibit+multipotential+stem+cell+activity.">CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential.">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).</li><li>Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+differentially+regulates+the+stemness+of+type+I+and+type+II+pericytes.">Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 28 (2017).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes:+multitasking+cells+in+the+regeneration+of+injured,+diseased,+and+aged+skeletal+muscle.">Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle.</a> Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).</li></ol>

לכל המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Pericytes הם תאים multivotent perivascular 22 , 23 הממוקם על פני השטח abluminal של נימי 21 , 26 . בשרירי השלד, pericytes מסוגלים להבדיל לאורך נתיבים adipogenic ו / או myogenic 19 , 20 , 24 . מחקרים שנערכו לאחרונה חשפו שתי תת-קבוצות של פרסיטים, עם ביטוי סמן שונה והבדלים ברורים שונים 19 , 24 , 25 . סוג אני (NG2 + Nestin - ) pericytes הם adipogenic, ואילו סוג II (NG2 + Nestin + ) pericytes הם myogenic. בידוד של subpopulations אלה עבור במבחנה מחקרים דורש NG2-DsRed ו Nestin-GFP קו עכבר מהונדס פעמיים. התלות של הטיהור הזהפרוטוקול על עכברים פעמיים מהונדס מגביל באופן משמעותי את היישום שלה ובכך מחקר על הביולוגיה של subycopulations pericyte. מאמר זה וידאו ממחיש שיטה חלופית לבידוד של סוג I ו pericytes סוג II מן שרירי השלד העכבר. שיטה חדשה זו עדיין מסתמכת על טכניקה מבוססת FACS על הפרדת תאים. עם זאת, במקום ניצול מהונדס NG2-DsRed מהונדס, הוא מכוון את האות PDGFRβ אנדוגני. זה מבוסס על התצפית כי ביטוי NG2-DsRed co-localizes עם PDGFRβ בשרירי השלד 19 . בהשוואה לשיטה המקורית, פרוטוקול זה יש מספר יתרונות. ראשית, היא אינה דורשת רקע גנטי NG2-DsRed, למרות הרקע Nestin-GFP עדיין נחוץ. שנית, במקום מיקוד NG2, פרוטוקול זה משתמש PDGFRβ, מאפיין היטב מאופיין עם נוגדנים מאומתים זמינים מסחרית. שלישית, היא מאפשרת בידוד בו זמנית של boסוג אני ו סוג II pericytes. לדוגמה, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + תאים מבודדים באמצעות פרוטוקול זה להפגין יכולות הבחנה שונות. באופן ספציפי, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - , אבל לא PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , תאים להבדיל adipocytes במצב adipogenic, ואילו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , אבל לא PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - , תאים עוברים בידול myogenic תחת מצב myogenic. נתונים אלה עולים בקנה אחד עם דוחות קודמים מראה כי NG2-DsRed + Nestin-GFP - תאים (סוג אני pericytes) הם adipogenic ו NG2-DsRed + Nestin-GFP + תאים (סוג II pericytes) הם myogenic 19 , 24 , מה שמרמז כי בודדים PDGFRβ -PE + Nestin-GFP - ו- PDGFRβ-PE + Nאסטין- GFP + תאים אכן סוג אני ואת סוג II pericytes, בהתאמה. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך פרוטוקול חדש זה מאפשר בידוד / טיהור קל יחסית של subpopulations pericyte של שרירי השלד העכבר, ואולי רקמות אחרות. זה יעודד מחקרים על ביולוגיה pericyte ואת התרגום הטיפולי שלהם עבור הפרעות שונות. יצוין, עם זאת, כי יש מגבלה של שיטה זו בשל השימוש PDGFRβ. זה הוכח במחקר קודם כי PW1 + תאים interstitial (PICs) גם להביע PDGFRβ 20 . לכן, בודדים PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + אוכלוסיות עשוי להכיל PICs. עם זאת, התרומה של אלה PICs כדי הפרדת pericyte מוגבל, בהתחשב בכך pericytes במספר PICs בשרירי השלד 20 ואת סוג זה אני pericytes לא עוברים שליOgenesis 19 , 25 . בשיטה זו, הקלד I ו II סוג pericytes התקבלו תשואות של 9.5% ו 2.1%, בהתאמה. מספרים אלה היו דומים לתשואות שדווחו על 2.8% ו -3.4%, בהתאמה, בעכברים הכפולים-טרנסגניים 19 . הבדל קל עשוי להיות בשל אסטרטגיות gating שונים או פרוטוקולי עיכול. תוצאות אלו שוב מציעות כי הפרוטוקול המוצע ניתן להשתמש כדי לבודד תת סוגים של pericytes של שרירי השלד. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים את הנקודות הבאות: (1) ודא כי שרירי השלד הם טחון לחלוטין ויכול בקלות לעבור דרך פיפטה סרולוגית 10 מ&quot;ל. גושי שרירים גדולים מפריעים לעיכול אנזימטי ומפחיתים באופן משמעותי את התשואה. (2) השתמש טריים collagenase פתרון לעיכול שרירים ולאפשר תסיסה עדינה (35 סיבובים / דקות) במהלך הדגירה. (3) לשמור עלשולטת ומדגם על הקרח לאורך מכתים ומדרגות מיון. (4) השתמש בפקדי FMO כדי להגדיר גבולות gating. בנוסף יכולת בידול, הקלד אני סוג II pericytes גם להראות מורפולוגיה שונים. באופן ספציפי, סוג אני pericytes יש תאים עגולים התא, עם תהליכים קצרים גרעינים גדולים יחסית. סוג II pericytes, לעומת זאת, בדרך כלל יש גוף תאים קטנים, עם תהליכים ארוכים ודקים גרעינים קטנים. ההבדלים המורפולוגיים מצביעים על כך שסוג I ו- II pericytes הם שונים במהותם, אשר עולים בקנה אחד עם הטבע ההטרוגני של pericytes 21 . מה גורם / שומרת את ההבדל בין סוג I ו pericytes סוג II, כמו גם את המנגנונים המולקולריים הבסיסית, להישאר לא ברור ודורשים חקירה נוספת. פרוטוקול בידוד זה יעזור לענות על שאלות חשובות אלה.

ניוון שרירים הוא הפרעה ניוונית שרירית כי אין טיפולים יעילים עד כה. פיתוח טיפולים המקדמים התחדשות רקמות תמיד היה עניין רב. התחדשות רקמות ותיקון לאחר נזק תלוי בתאי גזע תושב / תאים אב 1 . תאי לוויין מחויבים תאים מבשר myogenic התורמים התחדשות שרירים 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . השימוש הקליני שלהם, לעומת זאת, הוא הקשו על ידי הגירה מוגבלת שלהם שיעור הישרדות נמוך לאחר ההזרקה, כמו גם על ידי יכולת ירידה שלהם בידול לאחר הגברה במבחנה 8 , 9 , 10 , 11 . בנוסף satelliתאי T, שרירי השלד מכילים גם אוכלוסיות תאים רבים אחרים עם פוטנציאל myogenic 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , כגון טסיות הנגזרות גורם גדילה ביתא (PDGFRβ) תאים interstitial אינטראקטיביים. ישנן ראיות מראה כי שריר הנגזרות PDGFRβ תאים + מסוגלים להבדיל לתאי myogenic ולשפר פתולוגיה שריר לתפקד 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ בעיקר תוויות pericytes 21 , אשר תאים perivascular עם pluripotency 22 , 23 . בנוסף PDGFRβ, סמנים רבים אחרים, כולל Neuron-Glial 2 (NG2) ו CD146, משמשים גם אניDentify pericytes 21 . עם זאת, יש לציין כי אף אחד מהסימנים הללו אינו ספציפי ל- pericyte 21 . מחקרים שנערכו לאחרונה חשפו שני תת-סוגים של פריסיטים בשרירים, הנקראים סוג I וסוג II, המבטאים סמנים מולקולריים שונים ומבצעים פונקציות שונות 19 , 24 , 25 . ביוכימית, סוג אני pericytes הם NG2 + Nestin - , ואילו סוג II pericytes הם NG2 + Nestin + 19 , 24 . באופן פונקציונלי, סוג אני pericytes יכול לעבור בידול אדיפוגני, תורם הצטברות שומן ו / או פיברוזיס, ואילו סוג II pericytes יכול להבדיל לאורך מסלול myogenic, תורם התחדשות שרירים 19 , 24 , 25 . תוצאות אלה מראות כי: (1) סוג אני pericytes עשוי bE ממוקד לטיפול בהפרעות ניווניות שומן / פיברוזיס, ו (2) סוג II pericytes יש פוטנציאל טיפולי רב עבור ניוון שרירים. חקירה נוספת ואפיון של אוכלוסיות אלה דורשות פרוטוקול בידוד המאפשר הפרדה מסוג I ו percytes סוג II ברמה גבוהה של טוהר. נכון לעכשיו, בידוד subpopulations pericyte מסתמך על NG2-DsRed ו Nestin-GFP עכברים מהונדסים פעמיים 19 , 24 . הזמינות של עכברים NG2-DsRed ואת האיכות של רוב הנוגדנים NG2 להגביל את השימוש הנרחב של שיטה זו. בהתחשב בכך שכל NG2 + pericytes גם להביע PDGFRβ בשרירי השלד 19 , 20 , 24 , אנו משער כי NG2 ניתן להחליף PDGFRβ לבידוד pericytes ו subpopulations שלהם. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACSמשתמש מכתים PDGFRβ ואת האות Nestin-GFP. שיטה זו היא פחות תובענית עבור החוקרים כי: (1) זה אינו דורש את הרקע NG2-DsRed ו (2) הוא משתמש נוגדנים PDGFRβ זמינים מסחרית, אשר מאופיינים היטב. בנוסף, הוא מאפשר בידוד סימולטני של סוג I ו- II pericytes בטוהר גבוה, ומאפשר חקירה נוספת של ביולוגיה ופוטנציאל טיפולי של subpopulations אלה pericyte. בעקבות טיהור, תאים אלה יכולים להיות גדלים בתרבות, המורפולוגיות שלהם יכול להיות דמיינו. עבודה זו גם מראה כי סוג I ו percytes סוג II מבודד באמצעות שיטה זו, כמו אלה מטוהרים מן העכברים מהונדס פעמיים, הם אדיפוגניים ו myogenic, בהתאמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Cell Sorter</td>
			<td style="width:173px;">Sony</td>
			<td style="width:133px;">SH800</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Automatic Setup Beads</td>
			<td style="width:173px;">Sony</td>
			<td style="width:133px;">LE-B3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DMEM</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Avertin&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Pericyte Growth Medium</td>
			<td style="width:173px;">ScienCell</td>
			<td style="width:133px;">1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">MSC Basal Medium (Mouse)</td>
			<td style="width:173px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:133px;">5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)</td>
			<td style="width:173px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:133px;">5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">16000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Collagenase Type 2</td>
			<td style="width:173px;">Worthington</td>
			<td style="width:133px;">LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">0.25% Trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">PDL</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">PDGFR&#946;-PE Antibody</td>
			<td style="width:173px;">eBioscience</td>
			<td style="width:133px;">12-1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Perilipin Antibody</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">P1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">S-Myosin Antibody</td>
			<td style="width:173px;">DSHB</td>
			<td style="width:133px;">MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Alexa 555-anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Alexa 555-anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:173px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:133px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">HEPES</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:311px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:311px;">KHCO3</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">P184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">PBS</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">18G Needles</td>
			<td style="width:173px;">BD</td>
			<td style="width:133px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10ml Serological Pipette</td>
			<td style="width:173px;">BD</td>
			<td style="width:133px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles

Pericytes הם תאים multipotent perivascular המציגים הטרוגניות באיברים שונים או אפילו בתוך הרקמה זהה. בשרירי השלד, יש לפחות שתי תת-אוכלוסיות (הנקראות סוג I וסוג II), המבטאות סמנים מולקולריים שונים ויש להן יכולות הבחנה שונות. באמצעות NG2-DsRed ו Nestin-GFP עכברים פעמיים מהונדס, סוג אני (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) וסוג II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) פריסיטים היו מבודדים בהצלחה. עם זאת, הזמינות של עכברים אלה פעמיים מהונדס מונע את השימוש הנרחב של שיטה זו טיהור. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול חלופי המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד. פרוטוקול זה מנצל את הקרינה המופעל תא מיון (FACS) טכניקה מטרות PDGFRβ, ולא NG2, יחד עם האות Nestin-GFP. לאחר בידוד, הקלד אני ו tyPe II pericytes להראות מורפולוגיות שונות. בנוסף, סוג I ו percytes סוג II מבודדים בשיטה חדשה זו, כמו אלה מבודד מן העכברים מהונדס פעמיים, הם אדיפוגניים ו myogenic, בהתאמה. תוצאות אלו מראות כי פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לבודד subpopulations pericyte של שרירי השלד ואולי מתוך רקמות אחרות.

הפרמטרים של FACS, כולל עוצמת הלייזר ותגמול הערוץ, מתוקנים על סמך תוצאות הבקרה הבלתי מבוקרת ובקרות בצבע יחיד. PDGFRβ-PE-FMO שליטה משמש לקבוע את gating עבור האוכלוסייה PDGFRβ-PE + ( איור 1 א ). בין PDGFRβ-PE תאים, שתי אוכלוסיות המייצג Nestin-GFP + ו Nestin-GFP - תאים מופרדים בבירור ( איור 1 א ). גבולות Gating עבור PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - אוכלוסיות נקבעים על בסיס gating עבור PDGFRβ-PE + ו Nestin-GFP + ( איור 1 א ). גבולות אלה משמשים להגדיר ומיון PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (סוג II pericytes) ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (סוג אני pericytEs) תאים מן המדגם ( איור 1 ב ). מבודד PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + תאים חשבון עבור 9.5% ו 2.1% מכלל התאים פתרון תא בודד, בהתאמה. סוג FACS מבודדים אני ואת סוג II pericytes להפגין הבדלים מורפולוגיים לאחר שלושה ימים בתרבות. סוג אני pericytes להציג מורפולוגיה אמביאידית, עם גופי תא עגול ותהליכים קצרים ( איור 2 ). סוג II pericytes, עם זאת, להראות מורפולוגיה מסועפת, המאופיינת על ידי גופים תאים קטנים ותהליכים ארוכים, רזה ( איור 2 ). בשלב זה, רוב סוג II pericytes להישאר Nestin-GFP + , בעוד סוג אני pericytes הם Nestin-GFP - ( איור 2 ). בנוסף, הקלד I, אבל לא סוג II, pericyTES להבדיל peripipin- להביע אדיפוציטים לאחר 14 ימים במדיום adipogenic ( איור 3 ). סוג II, אבל לא להקליד אני, pericytes להבדיל לתוך S- מיוזין להביע מיוטובים לאחר 14 ימים במדיום myogenic ( איור 4 ). תוצאות אלו מצביעות באופן חזק על סוג pericytes אני adipogenic, ואילו סוג II pericytes הם myogenic. <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig1.jpg" /> איור 1 : גבולות הזזה ומיון מייצג. ( א ) חלקת פלואורסצנטי של PDGFRβ-PE-FMO שליטה, הוכחת PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + גבולות gating. ( ב ) נציג פלורסנט העלילה של המדגם מראה את ההפצה של PDGFRβ-PE + Nestin-GFP <sUp&gt; - (סוג אני pericytes) ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (סוג II pericytes) תאים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig2.jpg" /> איור 2: מורפולוגיה הביטוי Nestin-GFP במיון סוג I ו pericytes סוג II. מיון סוג אני ו per II סוג II היו seeded על coverslips וגדל בינוני pericyte במשך 3 ימים. סוג אני pericytes הראה תא גוף עגול, עם תהליכים קצרים, ולא אות אנדוגני GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור לייזר: 488 ננומטר, עירור מסננים פליטה: 470/40 ננומטר ו 515/30 ננומטר, בהתאמה). סוג II pericytes הפגינו גופי התא הקטן, עם תהליכים ארוכים ודקים, ואת האות GFP אנדוגני חזק תחתמיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת אותן הגדרות. סולם בר = 100 מיקרומטר <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig3.jpg" /> איור 3: בידול אדיפוגני של מיון סוג I ו percytes סוג II. סוג מסודר I ו- II סוג pericytes גדלו במדיום pericyte במשך 3 ימים. הם נבדלו אז במדיום אדיפוגני למשך 14 ימים. התאים היו קבועים ו immunostained עם נוגדן אנטי פריליפין ואחריו Alexa555 חמור אנטי ארנב נוגדן. Immunocytochemistry הראה כי סוג אני, אבל לא סוג II, pericytes הביע את סמן peripipin אדיפוציטים (אדום) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (לייזר עירור: 543 ננומטר, עירור מסננים פליטה: 540/45 ננומטר ו 600/50 ננומטר, כבוד<html> ). סולם בר = 50 מיקרומטר <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig4.jpg" /> איור 4 : בידול Myogenic של סוג מיון אני וסוג II pericytes. מיון מסוג I ו II סוג pericytes גדלו במדיום pericyte במשך 3 ימים היו נבדלו אז במדיום myogenic במשך 14 ימים. התאים היו קבועים immunostained עם נוגדנים אנטי S- נוגדנים ו Alexa555 חמור נוגדנים עכבר. Immunocytochemistry הראה כי סוג II, אבל לא להקליד אני, pericytes הביע את myotube בוגרת / סמן myofiber S- myosiber (אדום) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (לייזר עירור: 543 ננומטר, מסננים עירור ו פליטה: 540/45 ננומטר ו 600/50 ננומטר , בהתאמה). סולם בר = 50 מיקרומטר//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> צינורות </td><td> הַכתָמָה </td></tr><tr><td> שליטה ללא שליטה </td><td> ההשעיה תא בודד מן עכברים wildtype </td></tr><tr><td> DAPI שליטה בצבע יחיד (אי הכללת תאים מתים) </td><td> ההשעיה תא בודד מ wildtype עכברים + DAPI (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> GFP צבע אחד שליטה </td><td> ההשעיה תא בודד מעכברים Nestin-GFP </td></tr><tr><td> PE צבע יחיד שליטה </td><td> OneComp eBeads + PDGFRβ-PE נוגדן (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> PE-FMO שליטה </td><td> ההשעיה תא בודד מעכברים Nestin-GFP + DAPI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> לִטעוֹם </td><td> ההשעיה תא בודד מעכברים Nestin-GFP + PDGFRβ-PE נוגדן (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) +DAPI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td></tr></tbody></table> טבלה 1: פרוטוקול מכתים עבור פקדי צבע יחיד, PDGFRβ-PE-FMO שליטה, מדגם שריר.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles at JoVE.com

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K Views.  University of Minnesota.  עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד. 

Video: Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories due to the large size of the pancreatic duct that allows for ready collagenase injection and subsequent tissue perfusion. In contrast, islet isolation from small pancreata, like that of neonatal mice, is challenging because perfusion is not readily achievable in the small pancreata. Here we describe a detailed simple procedure that recovers substantial numbers of islets from newly born mice with visual assistance. Freshly dissected whole pancreata were digested with 0.5 mg/mL collagenase IV dissolved in Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) at 37 &#176;C, in microcentrifuge tubes. Tubes were tapped regularly to aid tissue dispersal. When most of the tissue was dispersed to small clusters around 1 mm, lysates were washed three to four times with culture media with 10% fetal bovine serum (FBS). Islet clusters, devoid of recognizable acinar tissues, can then be recovered under dissecting stereoscope. This method recovers 20 - 80 small- to large-sized islets per pancreas of newly born mouse. These islets are suitable for most conceivable downstream assays, including insulin secretion, gene expression, and culture. An example of insulin secretion assay is presented to validate the isolation process. The genetic background and degree of digestion are the largest factors determining the yield. Freshly made collagenase solution with high activity is preferred, as it aids in endocrine-exocrine isolation. The presence of cations [calcium (Ca2+) and magnesium (Mg2+)] in all solutions and fetal bovine serum in the wash/picking media are necessary for good yield of islets with proper integrity. A dissecting scope with good contrast and magnification will also help.

We describe a protocol herein for isolating intact islets from neonatal mice. Pancreata were partially digested with collagenase, followed by washing and hand picking. 20 - 80 islet clusters can be obtained per pancreas from newly born mice, which are suitable for several islet studies.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

בידוד והבידול של מכשולים ראשוניים מתוך שריר השלד של העכבר Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...