이 연구는 근력 근이영양증 재단 (MDF-FF-2014-0013)의 기금 지원과 미국 심장 협회 (16SDG29320001)의 과학자 개발 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

Wildtype과 Nestin-GFP 트랜스 제닉 마우스를 미네소타 대학의 동물 시설에 넣었다. 모든 실험 절차는 미네소타 대학의 동물 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 NIH 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 근육 해부 및 단세포 격리 <ol><li> 트 리브로 모에 타놀 (250 mg / kg, ip)으로 성인 생쥐 (남성과 여성 모두 6-10 주)를 안락사시키고 70 % 에탄올로 복부 피부를 살균하십시오. 참고 : ketamine이 NMDA 수용체와 상호 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에 마비 / 안락사를 위해 트라이 브로 모에탄올을 케타민 대신 여기에 사용했습니다. 이는 잠재적으로 연구에 영향을 미칠 수 있습니다. </li><li> 쥐를 앙와위에 놓고 메스를 사용하여 복부 피부에 수평 절개를하십시오. 뒷다리 근육을 드러내려면 반대 방향으로 당겨 피부를 손으로 떼어냅니다. </li><li> 콜렉포셉과 가위를 사용하여 두 개의 뒷다리에서 근육. 얼음에 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)을 보충 한 무균 인산 완충 식염수 (PBS)에 보관하십시오. </li><li> 1 % P / S 2 회 보충 된 얼음처럼 차가운 PBS에서 해부 된 뒷다리 근육을 씻고 멸균 10cm 플레이트로 옮깁니다. </li><li> 조심스럽게 2X 배율로 해부 현미경하에 포셉과 가위를 사용하여 근육, 혈관 및 결합 조직을 절개하십시오. </li><li> 가늘게 썰어 근육을 작은 조각 (1 ~ 2mm 3 )으로 멸균 가위와 칼을 사용하여 깎습니다. 필요한 경우, 근육이 건조되지 않도록하기 위해 DMEM (Dulbecco &#39;s Modified Eagle Medium)을 소량 첨가하십시오. </li><li> 기계적으로 10 ML 혈청 피펫을 통해 10 배 위아래로 pipetting하여 조직을 분해. </li><li> 혼합물에 새로 만든 소화 용액 (0.2 % 타입 2 collagenase가 보충 된 DMEM)을 첨가하십시오. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오.35 회전 / 분에서 교반. </li><li> 혼합물을 균질화하기 위해 18 G 바늘을 사용하여 분쇄하십시오. 그런 다음 500 xg에서 5 분간 원심 분리합니다. 뜨는을 버리고 0.25 % 트립신 / EDTA에 펠렛을 resuspend. 37에서 품어 ° C 10 분. 원심 분리 단계를 두 번 더 반복합니다. </li><li> 20 % 태아 소 혈청 (FBS)을 보충 한 DMEM 10 mL를 넣고 500 xg에서 5 분간 원심 분리한다. 상등액을 버리고 적혈구 용해 완충액 (155 MM NH 4 Cl, 10 MM KHCO 3 , 0.1 MM EDTA)에 펠렛을 resuspend. </li><li> 5 분 500 XG에서 원심 분리기. 뜨는을 버리고 정렬 버퍼 (20 MM HEPES, 산도 7.0, 1 MM EDTA, 그리고 칼슘 / Mg 2 + 무료 PBS, 산도 7.0에서 1 % BSA)에 펠렛을 resuspend. 혼합물을 40 μm 셀 여과기로 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. </li><li> 5 분 500 XG에서 원심 분리기. 뜨는을 버리고 정렬 버퍼 1 ML에 펠렛을 resuspend. </li><li> 카운트hemocytometer로 세포 수를 계산하고 정렬 버퍼에서 5 x 10 6 / mL로 단일 세포 현탁액을 희석. </li></ol> 2. 세포 염색 및 정렬 <ol><li> 표 1 에 설명 된대로 컨트롤과 샘플을 준비합니다. 표 1 에 설명 된대로 30 분 동안 얼음에 각 항체와 단일 세포 현탁액을 얼룩. </li><li> 5 분 500 XG에서 원심 분리기와 정렬 버퍼와 두 번 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 표 1에 표시된대로 단일 세포 솔루션에 DAPI를 추가합니다. PDGFRβ-PE-FMO 컨트롤 및 샘플에 대해 DAPI 단색 컨트롤에는 5 μg / mL DAPI (최종 농도)를 사용하고 DAPI 단일 색상 컨트롤에는 1 μg / mL DAPI를 사용합니다. 실험을하는 동안 모든 튜브를 얼음에 붙이십시오. </li><li> 분류기와 소프트웨어를 켜십시오. 메시지가 나타나면 100 μm 정렬 칩을 스캔하고 삽입하십시오. </li><li> 자동 설정 ( 예 : 칩 정렬, 물방울 교정, 사이드 스트림 교정 및 정렬 지연 교정자동 설치 구슬을 넣으십시오. </li><li> 자동 설정이 완료되면 &#39;실험&#39;탭으로 이동하여 &#39;새로 만들기&#39;를 클릭하고 &#39;공개 템플릿&#39;에서 &#39;빈 템플릿&#39;을 선택하십시오. </li><li> &quot;Measurement Settings&quot;에서 &quot;FL1&quot;에 대해서는 &quot;DAPI&quot;를, &quot;FL2&quot;에 대해서는 &quot;Nestin-GFP&quot;를, &quot;FL3&quot;에 대해서는 &quot;PDGFRβ&quot;를 입력하십시오. &quot;FL4&quot;- &quot;FL6&quot;의 확인란을 선택 취소하십시오. </li><li> 확인란을 선택하여 405, 488 및 561 레이저를 활성화하고 &quot;새 실험 만들기&quot;를 클릭하십시오. </li><li> &quot;보상 마법사 시작&quot;옵션을 선택하고 &quot;보상 마법사&quot;소프트웨어 프롬프트에 따라 보상을 설정하십시오. <ol><li> 염색되지 않은 컨트롤을로드하고 &quot;시작&quot;을 클릭하십시오. &quot;감지기 및 임계 값 설정&quot;을 클릭하고 FSC 및 BSC 감지기의 센서 이득을 조정하여 인구를 저울에 배치하십시오. </li><li> 광고히스토그램의 왼쪽에 음의 모집단을 배치하는 FL1-FL3 형광 채널의 게인 레벨. &quot;기록&quot;버튼을 클릭하여 데이터를 기록하십시오. </li><li> 메시지가 표시되면 단일 색상 컨트롤을 하나씩로드하십시오. &quot;시작 및 기록&quot;을 클릭하여 데이터를 기록하십시오. 히스토그램에서 양성 집단에 대한 게이트를 조정하십시오. &quot;다음&quot;을 클릭하십시오. </li><li> &quot;보상&quot;탭에서 &quot;매트릭스 계산&quot;으로 이동 한 다음 &quot;보상 설정 계산&quot;패널에서 &quot;계산&quot;을 클릭하여 보상을 수행하십시오. &quot;마침&quot;을 클릭하여 &quot;보상 마법사&quot;를 종료하십시오. </li></ol></li><li> PDGFRβ-PE-FMO 컨트롤을로드하고 &quot;시작&quot;을 클릭하십시오. &quot;모든 이벤트&quot;플롯 아래 관심있는 세포 주위에 다각형 게이트 (게이트 A)를 그립니다. </li><li> Gate A 내부를 두 번 클릭하여 하위 플롯을 만듭니다. Y 축을 DAPI로 변경하고 라이브 (DAPI 낮음 ) 셀 주위에 다각형 게이트 (게이트 B)를 그립니다. i를 두 번 클릭하십시오.자식 플롯을 만들려면 게이트 B 옆에 있습니다. X 축을 FSC-H로 변경하고 Y 축을 FSC-W로 변경하고 이중 선을 제거하기 위해 단일 선 둘레에 다각형 게이트 (게이트 C)를 그립니다. </li><li> Gate C 내부를 두 번 클릭하여 하위 플롯을 만듭니다. X 축을 Nestin-GFP로, Y 축을 PDGFRβ-PE로 변경하십시오. &quot;기록&quot;버튼을 클릭하여 데이터를 기록하십시오. </li><li> 샘플을로드하고 2.11-2.12 단계를 반복하십시오. 녹음 후 &quot;일시 중지&quot;를 클릭하여 샘플을 보존하십시오. </li><li> PDGFRβ-PE-FMO 컨트롤을 기반으로 PDGFRβ + 및 Nestin-GFP + 세포에 대한 게이팅 경계를 정의하십시오. PDGFRβ + Nestin-GFP 및 PDGFRβ + Nestin-GFP + 개체군을위한 게이트를 그립니다. </li><li> &quot;Sorting Method&quot;에서 &quot;Two-way Tubes&quot;를 선택하고 &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP - &quot;및 &quot;PDGFRβ + Nestin-GFP + &quot;세포를 왼쪽 및 오른쪽 수집 튜브에 할당하십시오.광적으로. 수집 버퍼에 채워진 15 mL 수집 튜브를 수집 스테이지에 놓고 &quot;Load Collection&quot;버튼을 클릭하십시오. </li><li> 샘플을 계속 실행하려면 &quot;재시작&quot;버튼을 클릭하십시오. PDGFRβ + Nestin - GFP - (유형 I pericytes)와 PDGFRβ + Nestin - GFP + (유형 II pericytes) 세포를 수집하려면 &quot;정렬 시작&quot;을 클릭하십시오. </li></ol> 3. 포스트 정렬 분석 <ol><li> 5 분 500 XG에 정렬 된 세포를 원심 분리기, pericyte 매체 ( 물질 표 참조) 1 ML에 펠렛을 resuspend, hemocytometer를 사용하여 세포 밀도를 계산합니다. </li><li> ~ 1 x 104 세포 / cm2에서 poly-D-lysine (PDL) 코팅 된 coverslips에 종자 타입 I과 타입 II pericytes. 3 % pericyte medium에서 37 ℃, 5 % CO2로 성장시킨다. </li><li> 3 일째, perisste 형태 (위상차 하에서)와 내인성 Nestin-GFP 발현을 형광 마이크로범위 (여기 레이저 : 488 nm, 여기 필터 : 470/40 nm, 방출 필터 : 515/30 nm). 20X 대물 렌즈 (0.45 NA)로 이미지를 촬영하십시오. </li><li> 지방 세포를 지방 세포 (마우스 MSC 기초 매체 + 지방 생성 자극 보조제) 및 근육 형성 (DMEM + 2 % 말 혈청) 매체로 대체하여 이전에 설명한 바와 같이 지방 형성 및 근원 분화를 각각 개시한다. 매 2-3 일마다 매체를 교체하십시오. </li><li> 상온에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 17 일 (지방 형성 / 근원 분화 후 14 일)에 세포를 고정시켰다. 참고 :주의 사항 : PFA는 발암 물질입니다. </li><li> 이전의 발행물 19 , 20 에 설명 된대로 perilipin (지방 세포 마커) 및 S - myosin (성숙한 myotube / myofiber 마커)에 대한 면역 세포 화학 검사를 수행합니다. <ol><li> 상온에서 10 분 동안 고정 된 세포를 PBS로 3 번 씻으십시오. </li><li> 블로킹 완충액 (PBS5 % 당나귀 혈청, 3 % BSA 및 0.3 % Triton X-100으로 보충)를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양 하였다. </li><li> 안티 perilipin (2 μg / ML) 및 / 또는 안티 S - myosin (2 μg / ML) 항체 4 ° C 하룻밤 세포를 품어. </li><li> 실온에서 10 분 동안 PBS로 세포를 3 번 ​​씻으십시오. </li><li> 1 시간 동안 실온에서 알렉사 555 당나귀 안티 토끼 (4 μg / ML) 및 / 또는 Alexa555 당나귀 안티 마우스 (4 μg / ML) 항체와 세포를 품어. </li><li> 실온에서 10 분 동안 PBS로 세포를 3 번 ​​씻으십시오. </li><li> DAPI를 포함하는 장착 매체로 면역 염색 세포를 장착하십시오 (물질 표 참조). 형광 현미경 (여기 레이저 : 543 nm, 540 / 45 nm excitation과 600/50 nm emission)을 사용하여 perilipin과 S-myosin 발현을 검사하고 40X 대물 렌즈 (0.60 NA)에서 이미지를 촬영하십시오. </li></ol></li></ol>

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각질 세포는 모세 혈관 21 , 26 의 반 관절 표면에 위치한 다 능성 혈관 주위 세포 22 , 23 입니다. 골격근에서, 혈관 주위 세포는 지방 형성 및 / 또는 근원 형성 경로 19 , 20 , 24를 따라 분화 할 수 있습니다. 최근의 연구에 따르면 마커 발현이 두 가지이고 19 , 24 , 25의 독특한 분화 잠재력을 가진 두 가지 혈관 주위 세포가 발견되었습니다. Type I (NG2 + Nestin - ) 혈관 주위 세포는 지방 형성 성이며, II 형 (NG2 + Nestin + ) 혈관 주위 세포는 근원 성이다. 생체 외 연구를위한 이들 하위 집단의 격리는 NG2-DsRed 및 Nestin-GFP 이중 - 형질 전환 마우스 라인을 필요로합니다. 이 정화의 의존성프로토콜은 이중 트랜스 제닉 생쥐에 대한 적용이 크게 제한되어 있고, 따라서 말초 혈소판 하위 집단의 생물학적 연구를하고 있습니다. 이 동영상 기사는 마우스 골격근에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포를 분리하는 대체 방법을 설명합니다. 이 새로운 방법은 여전히 ​​세포 분리를위한 FACS 기반 기술에 의존합니다. 그러나 형질 전환 NG2-DsRed 형광을 이용하는 대신 내인성 PDGFRβ 신호를 표적으로 삼습니다. 이것은 NG2-DsRed 발현이 골격근에서 PDGFRβ와 공존한다는 관찰에 기초하고있다. 원래의 방법에 비해이 프로토콜에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, Nestin-GFP 배경이 여전히 필요하지만 NG2-DsRed 유전 배경은 필요하지 않습니다. 둘째, NG2를 타겟팅하는 대신,이 프로토콜은 PDGFRβ를 사용합니다. PDGFRβ는 유효성이 확인되고 상업적으로 이용 가능한 항체가있는 잘 특성화 된 마커입니다. 셋째, 보의 동시 격리가 가능합니다.제 I 형 및 제 II 형 혈소판 형 혈관 형성 질환이있다. 예를 들어,이 프로토콜을 사용하여 분리 된 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP 및 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + 세포는 별개의 분화능을 입증합니다. 특히, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + 는 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP +가 아닌 지방간 상태로 지방 세포로 분화되지만, PDGFRβ-PE + Nestin- myogenic 조건 하에서 세포가 근원적 인 분화를 겪는다. 이 데이터는 NG2-DsRed + Nestin-GFP- 세포 (유형 I 혈관 주위 세포)가 지방 형성 세포이고 NG2-DsRed + Nestin-GFP + 세포 (II 혈관 주위 세포)가 근원 성 19 , 24 인 것을 보여주는 이전의보고와 일치하며, 이는 분리 된 PDGFRβ -PE + Nestin-GFP 및 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + 세포는 실제로 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포입니다. 함께, 이러한 결과는이 새로운 프로토콜이 마우스 골격 근육과 아마도 다른 조직으로부터의 주변 세포 (pericyte subpopulation)의 분리 / 정제를 비교적 쉽게 허용 함을 시사한다. 이것은 pericyte 생물학 및 다양한 질환에 대한 치료 번역에 대한 연구를 촉진 할 것입니다. 그러나 PDGFRβ를 사용하기 때문에이 방법에는 한계가 있음을 유의해야합니다. 이전 연구에서 PW1 + 간질 세포 (PICs)도 PDGFRβ 20 을 발현한다는 것이 밝혀졌습니다. 따라서 분리 된 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP 및 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + 개체군에는 PIC가 포함될 수 있습니다. 그러나, pericytes가 골격근의 PIC보다 많으며 pericyte differentiation에이 PIC의 기여는 제한적입니다.창세기 19 , 25 . 이 방법을 사용하여 I 형과 II 형 혈관 주위 세포가 각각 9.5 %와 2.1 %의 수율로 얻어졌다. 이 수는 double transgenic mice에서 각각 2.8 %와 3.4 %의보고 된 수확량과 비교되었다. 약간의 차이는 다른 게이팅 전략이나 소화 프로토콜 때문일 수 있습니다. 이 결과는 제안 된 프로토콜이 골격근으로부터 혈소판의 아형을 분리하는데 사용될 수 있음을 다시 한번 시사한다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다 : (1) 골격근이 완전히 다져져 있고 10mL 혈청 피펫을 쉽게 통과 할 수 있는지 확인하십시오. 큰 근육 블록은 효소 소화를 방해하고 수확량을 크게 줄입니다. (2) 근육 소화를 위해 새로 만든 콜라게나 제 용액을 사용하고 부화 동안 부드러운 교반 (35 회전 / 분)이 가능하도록하십시오. (3)컨트롤 및 샘플링 얼룩 및 정렬 단계를 통해 얼음에. (4) FMO 제어기를 사용하여 게이팅 경계를 설정하십시오. 분화 능력 이외에, 타입 I 및 타입 II의 세포주는 또한 상이한 형태를 나타낸다. 구체적으로, 유형 I의 세포는 둥근 세포체를 가지고 있으며 짧은 과정과 상대적으로 큰 핵을 가지고 있습니다. 반면에, II 형 세포주는 길고 가느 다란 과정과 작은 핵이있는 작은 세포체를 가지고 있습니다. 형태 학적 차이는 제 1 형과 제 2 형 혈관 주위 세포가 본질적으로 다르다는 것을 보여 주며 혈관 주위 세포의 이종 성질과 일치한다. Type I과 Type II 혈관 주위 세포의 차이와 근본적인 분자 기전의 원인은 명확하지 않으며 추가 조사가 필요합니다. 이 격리 프로토콜은 이러한 중요한 질문에 대답하는 데 도움이됩니다.

근이영양증은 지금까지 효과적인 치료법이없는 근육 퇴행성 장애입니다. 조직 재생을 촉진시키는 치료제 개발은 언제나 큰 관심사였습니다. 조직 재생 및 손상 후의 수리는 상주하는 줄기 세포 / 전구 세포에 달려 있습니다 1 . 위성 세포는 근육 재생 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7에 기여하는 근원 전구 세포입니다. 그러나 그들의 임상 적 사용은 주사 후 제한된 이동 및 낮은 생존율뿐만 아니라 시험관 내 증폭 8 , 9 , 10 , 11 후에 감소 된 분화능에 의해 방해 받는다. satelli 외에도te 세포에서 골격근은 또한 혈소판 유래 성장 인자 수용체 - 베타 (PDGFRβ) - 양성 간질 세포와 같은 근육 형성 잠재력이 12 , 13 , 14 , 15 , 16 인 많은 다른 세포 집단을 포함한다. 근육에서 파생 된 PDGFRβ + 세포가 근원 세포로 분화되어 근육 병리학 및 기능을 향상시킬 수 있다는 증거가있다 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ는 우세하게 혈관 주위 세포 인 다 혈관 주위 세포 21 을 나타냅니다. 22 , 23 . PDGFRβ 외에도 Neuron-Glial 2 (NG2) 및 CD146을 비롯한 많은 다른 마커가 i혈관 주위 세포를 확인하십시오 21 . 그러나 이들 마커 중 어느 것도 둘 다 pericyte-specific 21 이 아님을주의해야합니다. 최근 연구에 의하면 유형 I과 유형 II라고 불리는 근육 주변 세포의 두 가지 유형이 밝혀 졌는데, 이는 서로 다른 분자 표지를 나타내며 별개의 기능을 수행합니다 19 , 24 , 25 . 생화학 적으로, 유형 I 주변 세포는 NG2 + Nestin - 이고, 유형 II 주변 세포는 NG2 + Nestin + 19 , 24 이다. 기능적으로 유형 I의 세포주는 지방 축적 및 / 또는 섬유화에 기여하는 지방 형성 분화를 겪을 수 있지만 유형 II의 혈관 주위 세포는 근원적 인 경로를 따라 분화되어 근육 재생에 기여할 수있다 19 , 24 , 25 . 이러한 결과는 다음을 입증합니다 : (1) 유형 I 혈소판은 b지방 퇴행성 장애 / 섬유증의 치료를 목표로하는, 및 (2) II 형 혈관 주위 세포는 근이영양증에 대한 치료 가능성이 크다. 이러한 개체군에 대한 추가 조사와 특성 규명을 위해서는 높은 수준의 순도에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포의 분리를 가능하게하는 격리 프로토콜이 필요합니다. 현재, pericyte subpopulations의 고립은 NG2 - DsRed 및 Nestin - GFP 이중 transgenic 마우스 19 , 24 에 의존합니다. NG2-DsRed 생쥐의 유용성과 대부분의 NG2 항체의 품질은이 방법의 광범위한 사용을 제한합니다. 모든 NG2 + 혈관 주위 세포가 골격근 19 , 20 , 24 에서 PDGFRβ도 발현한다는 것을 감안할 때 우리는 혈관 주위 세포와 그 모집단의 분리를 위해 NG2가 PDGFRβ로 대체 될 수 있다고 가정한다. 이 작업은 FACS 기반 프로토콜을 설명합니다.PDGFRβ 염색 및 Nestin-GFP 신호를 사용합니다. 이 방법은 (1) NG2-DsRed 배경을 필요로하지 않으며 (2) 잘 특성화 된 상업적으로 이용 가능한 PDGFRβ 항체를 사용하기 때문에 조사자에게는 덜 까다로운 방법입니다. 또한 I 형과 II 형 혈관 주위 세포를 고순도로 동시에 분리 할 수있어 이러한 혈관 주위 세포 집단의 생물학적 특성과 치료 가능성을 연구 할 수 있습니다. 정화 후, 이들 세포는 배양 물에서 배양 될 수 있고, 그 형태는 시각화 될 수있다. 이 연구는 또한 이중 형질 전환 마우스에서 정제 된 것과 같은이 방법을 사용하여 분리 된 I 형 및 II 형 세포 주변 세포가 각각 지방 형성 및 근육 형성이라는 것을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Cell Sorter</td>
			<td style="width:173px;">Sony</td>
			<td style="width:133px;">SH800</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Automatic Setup Beads</td>
			<td style="width:173px;">Sony</td>
			<td style="width:133px;">LE-B3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DMEM</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Avertin&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Pericyte Growth Medium</td>
			<td style="width:173px;">ScienCell</td>
			<td style="width:133px;">1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">MSC Basal Medium (Mouse)</td>
			<td style="width:173px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:133px;">5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)</td>
			<td style="width:173px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:133px;">5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">16000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Collagenase Type 2</td>
			<td style="width:173px;">Worthington</td>
			<td style="width:133px;">LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">0.25% Trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">PDL</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">PDGFR&#946;-PE Antibody</td>
			<td style="width:173px;">eBioscience</td>
			<td style="width:133px;">12-1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Perilipin Antibody</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">P1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">S-Myosin Antibody</td>
			<td style="width:173px;">DSHB</td>
			<td style="width:133px;">MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Alexa 555-anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Alexa 555-anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:173px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:133px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">HEPES</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:311px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:311px;">KHCO3</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">P184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">PBS</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">18G Needles</td>
			<td style="width:173px;">BD</td>
			<td style="width:133px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10ml Serological Pipette</td>
			<td style="width:173px;">BD</td>
			<td style="width:133px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles

각질 세포는 여러 기관 또는 심지어 같은 조직 내에서 이질성을 나타내는 혈관 주변의 다 분화능 세포입니다. 골격근에는 여러 분자 마커를 표현하고 뚜렷한 분화능을 갖는 적어도 2 개의 일주 체형 하위 집단 (유형 I 및 유형 II라고 함)이 있습니다. NG2-DsRed 및 Nestin-GFP 이중 - 형질 전환 마우스를 사용하여, 유형 I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) 및 유형 II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) 혈관 주위 세포가 성공적으로 분리되었다. 그러나 이러한 double-transgenic mice의 유용성은이 정제 방법의 광범위한 사용을 방해합니다. 이 연구는 골격근으로부터 I 형 및 II 형 세포를 쉽고 동시에 분리 할 수있는 대체 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 형광 활성화 세포 정렬 (FACS) 기술을 이용하고 Nestin-GFP 신호와 함께 NG2보다는 PDGFRβ를 표적으로 삼습니다. 격리 후 I 및 ty를 입력하십시오.pe II 혈관 주위 세포는 별개의 형태를 나타낸다. 또한 이중 형질 전환 마우스에서 분리 된 것과 같은이 새로운 방법으로 분리 된 1 형 및 2 형 혈관 주위 세포는 각각 지방 형성 및 근육 형성이다. 이 결과는이 프로토콜이 골격근과 아마도 다른 조직으로부터 일주 전 세포 모집단을 분리하는데 사용될 수 있음을 시사한다.

레이저 강도 및 채널 보정을 포함한 FACS 매개 변수는 염색되지 않은 컨트롤 및 단색 컨트롤의 결과를 기반으로 보정됩니다. PDGFRβ-PE-FMO 대조군은 PDGFRβ-PE + 집단 ( 그림 1A )에 대한 게이팅을 설정하는 데 사용됩니다. PDGFRβ-PE 세포 중 Nestin-GFP + 와 Nestin-GFP - 세포를 나타내는 두 집단이 명확하게 분리되어있다 ( 그림 1A ). PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + 및 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP의 게이팅 경계는 PDGFRβ-PE + 및 Nestin-GFP + ( 그림 1A )에 대한 게이팅을 기반으로 설정됩니다. 이 경계선은 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (II 형 혈관 주위 세포)와 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP (type I pericyt)를 정의하고 분류하는 데 사용됩니다es) 세포 ( 그림 1B ). 분리 된 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - 와 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + 세포가 각각 단일 세포 용액에서 전체 세포의 9.5 %와 2.1 %를 차지한다. FACS로 분리 된 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포는 배양 3 일 후에 형태 학적 차이를 나타낸다. Type I pericytes는 둥근 세포 몸체와 짧은 과정을 가진 amoeboid 형태를 나타낸다 ( 그림 2 ). 그러나 II 형 세포는 세포 구조가 작고 길고 얇은 과정을 특징으로하는 분화 된 형태를 나타낸다 ( 그림 2 ). 이 때, 대부분의 제 2 형 혈관 주위 세포는 Nestin-GFP + 로 남아 있고, 제 1 형 혈관 주위 세포는 Nestin-GFP입니다 ( 그림 2 ). 또한 타입 I, 타입 II, 페리 타입이 아닙니다.tes는 지방 생성 배지에서 14 일 후 perilipin을 발현하는 지방 세포로 분화한다 ( 그림 3 ). II 형은 I 형은 아니지만 혈관 주위 세포에서 14 일 후에 S- myosin을 발현하는 myotubes로 분화한다 ( 그림 4 ). 이 결과는 제 1 형 혈관 주위 세포가 지방 형성 세포이고, 제 2 형 혈관 주위 세포는 근원 성 인 것을 강력하게 나타낸다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig1.jpg" /> 그림 1 : 게이팅 경계 및 대표 정렬. ( A ) PDGFRβ-PE + FMO 컨트롤의 형광 플롯, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP 및 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + 게이팅 경계를 시연 함. ( B ) PDGFRβ-PE + Nestin-GFP의 분포를 보여주는 샘플의 대표 형광 도표 <s(type I pericytes) 및 PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (II pericytes) 세포를 포함한다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig2.jpg" /> 그림 2 : 정렬 된 유형 I 및 유형 II의 세포 주변에서의 형태 및 Nestin-GFP 발현. Sorted type I과 type II pericytes를 coverslips에 뿌리고 3 일 동안 pericyte 배지에서 성장시켰다. Type I pericytes는 형광 현미경 (여기 레이저 : 488 nm, 여기 및 방출 필터 : 각각 470/40 nm 및 515/30 nm)에서 짧은 과정 및 내인성 GFP 신호가없는 둥근 세포 체를 보였다. Type II의 세포주는 길고 가느 다란 과정을 가진 작은 세포 몸체와 강력한 내인성 GFP 신호를 보여 주었다.같은 설정에서 형광 현미경. 스케일 바 = 100 μm <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig3.jpg" /> 그림 3 : 분류 된 유형 I 및 유형 II 혈관 주위 세포의 지방 세포 분화. 정렬 된 I 형 및 II 형 세포주는 3 일 동안 주위 세포에서 재배되었다. 그런 다음 지방 생성 배지에서 14 일 동안 분화시켰다. 세포를 항 - 페리 릴핀 항체 및 Alexa555 당나귀 항 - 토끼 항체로 고정하고 면역 염색 하였다. Immunocytochemistry는 type II가 아닌 I 형이 형광 현미경 (excitation laser : 543 nm; 여기와 방출 필터 : 540/45 nm과 600/50 nm, 존경) 하에서 지방 세포 마커 페리 틸린 (적색)<html> ively). 스케일 바 = 50 μm <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig4.jpg" /> 그림 4 : 분류 된 유형 I 및 유형 II 혈관 주위 세포의 근원적 인 분화. 분류 된 I 형 및 II 형 세포주는 3 일 동안 주변 세포에서 성장한 다음 근원 형성 기질에서 14 일 동안 분화되었다. 세포를 항 -S- 미오신 항체 및 Alexa555 당나귀 항 마우스 항체로 고정하고 면역 염색 하였다. Immunocytochemistry는 type I이 아닌 II 형이 형광 현미경 (여기 레이저 : 543 nm, 여기와 방출 필터 : 540/45 nm와 600/50 nm) 하에서 성숙한 myotube / 근섬유 마커 S-myosin (적색) , 각각). 스케일 바 = 50 μm//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 튜브 </td><td> 더럽히는 것 </td></tr><tr><td> 염색되지 않은 대조군 </td><td> 야생형 마우스의 단일 세포 현탁액 </td></tr><tr><td> DAPI 단색 컨트롤 (사상 세포 배제) </td><td> 야생형 마우스 + DAPI (5 μg / mL)에서 단일 세포 현탁액 </td></tr><tr><td> GFP 단색 컨트롤 </td><td> Nestin-GFP 마우스의 단일 세포 현탁액 </td></tr><tr><td> PE 단색 제어 </td><td> OneComp eBeads + PDGFRβ-PE 항체 (4 μg / mL) </td></tr><tr><td> PE-FMO 제어 </td><td> Nestin-GFP 마우스 + DAPI (1 μg / mL)의 단일 세포 현탁액 </td></tr><tr><td> 견본 </td><td> Nestin-GFP 마우스 + PDGFRβ-PE 항체 (4 μg / mL) +DAPI (1 μg / mL) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 단일 색상 컨트롤, PDGFRβ - 체육 - FMO 컨트롤, 근육 샘플에 대한 얼룩 프로토콜.

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Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

이 연구는 골격근에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포를 쉽고 동시에 격리 할 수있는 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

마우스 골격근에서 I 형과 II 형 Pericytes 분리

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K 조회수.  University of Minnesota.  이 연구는 골격근에서 I 형 및 II 형 혈관 주위 세포를 쉽고 동시에 격리 할 수있는 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다. 

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories due to the large size of the pancreatic duct that allows for ready collagenase injection and subsequent tissue perfusion. In contrast, islet isolation from small pancreata, like that of neonatal mice, is challenging because perfusion is not readily achievable in the small pancreata. Here we describe a detailed simple procedure that recovers substantial numbers of islets from newly born mice with visual assistance. Freshly dissected whole pancreata were digested with 0.5 mg/mL collagenase IV dissolved in Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) at 37 &#176;C, in microcentrifuge tubes. Tubes were tapped regularly to aid tissue dispersal. When most of the tissue was dispersed to small clusters around 1 mm, lysates were washed three to four times with culture media with 10% fetal bovine serum (FBS). Islet clusters, devoid of recognizable acinar tissues, can then be recovered under dissecting stereoscope. This method recovers 20 - 80 small- to large-sized islets per pancreas of newly born mouse. These islets are suitable for most conceivable downstream assays, including insulin secretion, gene expression, and culture. An example of insulin secretion assay is presented to validate the isolation process. The genetic background and degree of digestion are the largest factors determining the yield. Freshly made collagenase solution with high activity is preferred, as it aids in endocrine-exocrine isolation. The presence of cations [calcium (Ca2+) and magnesium (Mg2+)] in all solutions and fetal bovine serum in the wash/picking media are necessary for good yield of islets with proper integrity. A dissecting scope with good contrast and magnification will also help.

We describe a protocol herein for isolating intact islets from neonatal mice. Pancreata were partially digested with collagenase, followed by washing and hand picking. 20 - 80 islet clusters can be obtained per pancreas from newly born mice, which are suitable for several islet studies.

신생아 마우스 췌장의 기능 독도의 효과적인 분리

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

골격 근 생검 절차에서 인간 근육 선조 세포의 격리, 배양, 특성화 및 분화

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

세포 유형 별 척도에서 애기장대 뿌리 개발을 조사하기 위해 리보솜 친화성 정제 (TRAP) 번역

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...