この研究は、筋緊張性ジストロフィー基金（MDF-FF-2014-0013）の基金とアメリカ心臓協会（16SDG29320001）の科学者開発助成金によって部分的に支えられました。

野生型およびネスチン-GFPトランスジェニックマウスを、ミネソタ大学の動物施設に収容した。すべての実験手順は、ミネソタ大学の施設動物実験および使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに従っていた。 1.筋肉解離と単細胞分離<ol><li>トリブロモエタノール（250mg / kg、腹腔内）で成体マウス（男性および女性の両方）を安楽死させ、腹部皮膚を70％エタノールで滅菌する。 注：ケタミンはNMDA受容体と相互作用することが知られているので、試験に影響を与える可能性があるため、ここではトリブロモエタノールを麻酔/安楽死のためにケタミンの代わりに使用した。 </li><li>マウスを仰臥位に置き、メスを使用して腹部の皮膚を水平に切開する。後ろの筋肉を露出させるために反対方向に引っ張って手で皮膚を剥がします。 </li><li>コレク鉗子とハサミを使用して両方の後肢から筋肉を取り除く。氷上で1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を補充した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）にそれらを保存する。 </li><li> 1％P / Sを補充した氷冷PBSで解剖した後肢筋肉を2回洗浄し、滅菌10cmプレートに移す。 </li><li>慎重に2倍の倍率で解剖顕微鏡下で鉗子とハサミを使用して、筋肉から神経、血管、および結合組織を切開する。 </li><li>滅菌はさみと刃を使用して細かく切って筋肉を小さな片（1〜2mm 3 ）に切ります。必要に応じて、少量のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を加えて、筋肉が乾燥しないようにします。 </li><li>機械的に10mLの血清学的ピペットを10回上下にピペッティングすることにより組織を破壊する。 </li><li>新鮮な消化溶液（0.2％タイプ2コラゲナーゼを補充したDMEM）を混合物に加える。 gentlと37℃で2時間インキュベートする35回転/分で攪拌する。 </li><li>混合物を均質化するために18G針を用いて粉砕する。次に、500 xgで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを0.25％トリプシン/ EDTAに再懸濁する。 37℃で10分間インキュベートする。遠心分離を2回以上繰り返します。 </li><li> 20％ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM 10mLを加え、500xgで5分間遠心する。上清を捨て、ペレットを赤血球溶解緩衝液（155mM NH 4 Cl、10mM KHCO 3および0.1mM EDTA）に再懸濁する。 </li><li> 500xgで5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを選別バッファー（20mM HEPES、pH7.0; 1mM EDTA;およびCa / Mg 2+フリーPBS、pH7.0中の1％BSA）に再懸濁する。混合物を40μmセルストレーナに通して濾過して、単一細胞懸濁液を得る。 </li><li> 500xgで5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを1 mLの分取バッファーに再懸濁する。 </li><li>カウント血球計数器で細胞数を測定し、単一細胞懸濁液を選別緩衝液中で5×10 6 / mLに希釈する。 </li></ol> 2.細胞染色および選別<ol><li> 表1に記載されているようにコントロールとサンプルを準備する。 表1に記載されているように、氷上でそれぞれの抗体を含む単一細胞懸濁液を30分間染色する。 </li><li> 500xgで5分間遠心分離し、ペレットを選別バッファーで2回洗浄する。 </li><li>表1に示すように、DAPIを単一細胞溶液に添加する.DAPI単色対照については5μg/ mLのDAPI（最終濃度）を使用し、PDGFRβ-PE-FMO対照および試料については1μg/ mLのDAPIを使用する。実験を通して、すべてのチューブを氷上に保つ。 </li><li>ソーターとソフトウェアをオンにします。プロンプトが表示されたら、100μmのソーティングチップをスキャンして挿入します。 </li><li>自動セットアップ（ すなわち、チップアライメント、液滴較正、サイドストリーム較正、およびソート遅延較正自動セットアップビーズをロードすることにより、オンにすることができます。 </li><li>自動設定が完了したら、[テスト]タブの[新規作成]をクリックし、[パブリックテンプレート]から[空のテンプレート]を選択します。 </li><li> 「測定設定」で、「FL1」に「DAPI」、「FL2」に「Nestin-GFP」、「FL3」に「PDGFRβ」を入力します。「FL4」 - 「FL6」のチェックボックスをオフにします。 </li><li> 405、488、および561レーザーを有効にして[新しい実験を作成]をクリックすると、そのボックスにチェックマークが付いています。 </li><li> 「補正ウィザードの開始」オプションを選択し、補正ウィザードを実行して補正を設定するプロンプトに従います。 <ol><li>染色されていないコントロールを読み込み、「開始」をクリックします。 &quot;Detector＆Threshold Settings&quot;をクリックし、FSCおよびBSC検出器のセンサーゲインを調整して、人口をスケールに配置します。 </li><li>広告FL1-FL3蛍光チャネルのゲインレベルのみで、ヒストグラムの左側に陰性集団を配置する。 「記録」ボタンをクリックしてデータを記録します。 </li><li>プロンプトが表示されたら、単色のコントロールを1つずつ読み込みます。 &quot;Start and Record&quot;をクリックしてデータを記録します。ヒストグラム上の陽性集団のゲートを調整する。 [次へ]をクリックします。 </li><li> [補正]タブの[計算マトリックス]に移動し、[補正設定の計算]パネルで[計算]をクリックして補正を実行します。 「終了」をクリックして、「補償ウィザード」を終了します。 </li></ol></li><li> PDGFRβ-PE-FMOコントロールをロードし、 &quot;Start&quot;をクリックします。 「すべてのイベント」プロットの下で、関心のあるセルの周囲にポリゴンゲート（ゲートA）を描画します。 </li><li> Gate Aの内側をダブルクリックして、子プロットを作成します。 Y軸をDAPIに変更し、ライブ（DAPI 低 ）セルの周囲にポリゴンゲート（ゲートB）を描画します。 iをダブルクリック子のプロットを作成するにはGate Bの横にある。 X軸をFSC-Hに変更し、Y軸をFSC-Wに変更し、ダブルレットを除去するためにシングレットの周りにポリゴンゲート（ゲートC）を描画します。 </li><li>ゲートC内をダブルクリックして子プロットを作成します。 X軸をNestin-GFPに、Y軸をPDGFRβ-PEに変更する。 「記録」ボタンをクリックしてデータを記録します。 </li><li>サンプルをロードし、ステップ2.11-2.12を繰り返します。記録後、 &quot;Pause&quot;をクリックしてサンプルを保存します。 </li><li> PDGFRβ-PE-FMOコントロールに基づいて、PDGFRβ +およびNestin-GFP +細胞のゲーティング境界を定義する。 PDGFRβ +ネスチン-GFP -およびPDGFRβ +ネスチン-GFP +集団のためのゲートを描く。 </li><li> 「選別方法」で「2-way Tubes」を選択し、「PDGFRβ + Nestin-GFP - 」および「PDGFRβ + Nestin-GFP + 」細胞を左右の採取管に割り当て、明らかに。収集バッファーに充填した15 mLの収集チューブをコレクションステージにマウントし、 &quot;Load Collection&quot;ボタンをクリックします。 </li><li>サンプルを実行し続けるには、「Resume」ボタンをクリックしてください。 PDGFRβ +ネスチン-GFP - （タイプI周皮細胞）およびPDGFRβ +ネスチン-GFP + （タイプII周皮細胞）を収集するために、「ソート開始」をクリックしてください。 </li></ol> 3.ソート後の分析<ol><li>選別した細胞を500 xgで5分間遠心分離し、ペリサイトをペリサイト培地（ 材料表を参照）1 mLに再懸濁し、血球計数器を使用して細胞密度を数えます。 </li><li>約1×10 4細胞/ cm 2で、ポリ-D-リジン（PDL）被覆したカバースリップ上の種I型およびII型周皮細胞を接種する。 5％CO 2を含む37℃で3日間、周皮細胞で増殖させる。 </li><li> 3日目に、ペリサイト形態（位相差下）および内在性Nestin-GFP発現を蛍光マイクロ（励起レーザー：488nm、励起フィルター：470 / 40nm、発光フィルター：515 / 30nm）。 20倍の対物レンズ（0.45 NA）で画像を撮影します。 </li><li>以前に記載されているように、脂肪細胞培地を脂肪生成（マウスMSC基礎培地+脂肪生成刺激補助）および筋原性（DMEM + 2％ウマ血清）培地で置換して脂肪生成および筋原分化を開始する。 2〜3日ごとに培地を交換する。 </li><li>室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）中の17日目（脂肪生成/筋原性分化の14日後）に細胞を固定する。 注：注意、PFAは発癌物質です。 </li><li> 以前の刊行物19,20に記載されているように、ペリリピン（脂肪細胞マーカー）およびS-ミオシン（成熟筋管/筋線維マーカー）に対する免疫細胞化学を行う。 <ol><li>室温で10分間、固定した細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li>ブロッキング緩衝液（PBS5％ロバ血清、3％BSA、および0.3％Triton X-100を補充したもの）を添加し、室温で1時間インキュベートする。 </li><li>細胞を抗ペリリピン（2μg/ mL）および/または抗S-ミオシン（2μg/ mL）抗体と共に4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>室温で10分間、PBS中で細胞を3回洗浄する。 </li><li>室温で1時間、Alexa 555ロバ抗ウサギ（4μg/ mL）および/またはAlexa555ロバ抗マウス（4μg/ mL）抗体と細胞をインキュベートする。 </li><li>室温で10分間、PBS中で細胞を3回洗浄する。 </li><li>免疫染色された細胞をDAPIを含むマウント培地でマウントします（材料の表を参照）。蛍光顕微鏡（励起レーザー：543nm; 540 / 45nm励起および600 / 50nm発光）を用いてペリリピンおよびS-ミオシン発現を調べ、40倍対物レンズ（0.60NA）下で画像を撮る。 </li></ol></li></ol>

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すべての著者は、開示する利害の衝突はありません。

角質細胞は、毛細血管21,26の管腔外表面上に位置する多分化能血管周囲細胞22,23 である。骨格筋において、周皮細胞は、脂肪生成経路および/または筋形成経路19,20,24に沿って分化することができる。最近の研究により、異なるマーカー発現および明確な分化能を有する周皮細胞の2つの亜集団が明らかになった（19,24,25）。タイプI（NG2 +ネスチン- ）周皮細胞は脂肪生成性であり、タイプII（NG2 +ネスチン+ ）周皮細胞は筋原性である。 インビトロ研究のためのこれらの亜集団の単離は、NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウス系統を必要とする。この精製の依存性プロトコールは、その適用を著しく制限し、従って、周皮細胞亜集団の生物学に関する研究を制限する。 このビデオ記事は、マウスの骨格筋からのI型およびII型の周皮細胞の単離の代替方法を示しています。この新しい方法は、依然として細胞分離のためのFACSベースの技術に依拠している。しかし、トランスジェニックNG2-DsRed蛍光を利用する代わりに、それは内因性PDGFRβシグナルを標的とする。これは、NG2-DsRed発現が骨格筋におけるPDGFRβと共局在するという観察に基づく。元の方法と比較して、このプロトコルにはいくつかの利点があります。第1に、Nestin-GFPバックグラウンドは依然として必要であるが、NG2-DsRedの遺伝的背景を必要としない。第2に、NG2を標的化する代わりに、このプロトコルでは、有効性が確認され市販されている抗体を有する十分に特徴付けられたマーカーであるPDGFRβを使用する。第3に、それはboの同時分離を可能にするタイプIおよびタイプIIの周皮細胞を含む。例えば、このプロトコールを用いて単離したPDGFRβ-PE + Nestin-GFP -およびPDGFRβ-PE + Nestin-GFP +細胞は、明確な分化能力を示す。具体的には、PDGFRβ-PE + Nestin-GFP +ではなく、PDGFRβ-PE + Nestin-GFP-は脂肪生成状態で脂肪細胞に分化するが、PDGFRβ-PE +細胞は筋原性条件下で筋原性分化を受ける。これらのデータは、NG2-DsRed + Nestin-GFP-細胞（I型周皮細胞）が脂肪生成性であり、NG2-DsRed + Nestin-GFP +細胞（II型周皮細胞）が筋原性であり、単離されたPDGFRβ -PE +ネスチン-GFP-およびPDGFRβ-PE + Nエステイン-GFP +細胞は実際にそれぞれI型およびII型周皮細胞である。一緒に、これらの結果は、この新しいプロトコールが、マウス骨格筋およびおそらく他の組織からの周皮細胞亜集団の比較的容易な単離/精製を可能にすることを示唆している。これは、周皮細胞生物学および様々な障害に対するそれらの治療的翻訳に関する研究を促進する。 しかしながら、PDGFRβの使用に起因するこの方法には限界があることに留意すべきである。以前の研究では、PW1 +間質細胞（PIC）もPDGFRβ20を発現することが示されている。したがって、単離されたPDGFRβ-PE +ネスチン-GFP -およびPDGFRβ-PE +ネスチン-GFP +集団は、PICを含み得る。しかし、周皮細胞が骨格筋のPICよりも多く、そのタイプIの周皮細胞が私には受け入れられないことを考えると、これらのPICの周皮細胞分化への寄与は限られている起源19,25。 この方法を用いて、タイプIおよびタイプIIの周皮細胞がそれぞれ9.5％および2.1％の収率で得られた。これらの数値は、二重トランスジェニックマウスにおける報告された2.8％および3.4​​％の収率に匹敵した19 。わずかな違いは、異なるゲーティング戦略または消化プロトコルに起因する可能性があります。これらの結果は、提案されたプロトコルが、骨格筋からの周皮細胞のサブタイプを単離するために使用され得ることを再び示唆している。 このプロトコールの重要なステップには以下の点が含まれます：（1）骨格筋が完全に細かく、10mLの血清学的ピペットを容易に通過できることを確認する。大きな筋肉ブロックは酵素消化を妨げ、収量を有意に減少させる。 （2）筋肉消化のために新鮮なコラゲナーゼ溶液を使用し、インキュベーション中に穏やかに攪拌（35回転/分）させる。 （3）染色および選別工程の間、氷上でコントロールし、サンプルを採取する。 （4）FMOコントロールを使用してゲート境界を設定します。 分化能力に加えて、I型およびII型の周皮細胞も異なる形態を示す。具体的には、I型周皮細胞は、短いプロセスおよび比較的大きな核を有する丸い細胞体を有する。一方、II型周皮細胞は、通常、細長い細胞体を有し、細長いプロセスおよび小さな核を有する。形態学的相違は、I型およびII型の周皮細胞が本質的に異なり、周皮細胞の異種性と一致することを示唆している21 。 I型とII型の周皮細胞との間の差異を引き起こす/維持するメカニズムは、不明確なままであり、さらなる検討が必要である。この分離プロトコルは、これらの重要な質問に答えるのに役立ちます。

筋ジストロフィーは、これまでのところ有効な治療法を持たない筋変性疾患である。組織の再生を促進する治療法の開発は、常に大きな関心を集めています。損傷後の組織の再生と修復は、幹細胞/前駆細胞に依存する1 。衛星細胞は、筋肉再生に寄与する筋原性前駆細胞である2,3,4,5,6,7。しかしながら、それらの臨床的使用は、制限された移動および注射後の低い生存率、ならびにインビトロ増幅後のそれらの減少した分化能力によって妨げられる8,9,10,11。サテリに加えて骨格筋はまた、血小板由来成長因子受容体 - ベータ（PDGFRβ） - 陽性間質細胞などの筋原性ポテンシャル12,13,14,15,16を有する多くの他の細胞集団を含む。筋肉由来のPDGFRβ +細胞が筋原性細胞に分化し、筋病変および機能を改善することが示された証拠がある14,17,18,19,20。 PDGFRβは、主に多能性を有する血管周囲細胞である周皮細胞21を標識する22,23。 PDGFRβに加えて、Neuron-Glial 2（NG2）およびCD146を含む多くの他のマーカーもiに使用される周皮細胞を鑑定する21 。しかしながら、これらのマーカーのいずれも周細胞特異的21ではないことに留意すべきである。最近の研究では、異なる分子マーカーを発現し、異なる機能を果たすタイプIおよびタイプIIと呼ばれる筋肉周皮細胞の2つのサブタイプが明らかになった19,24,25。生化学的には、タイプIの周細胞はNG2 +ネスチンであり、タイプIIの周細胞はNG2 +ネスチン+19,24である。機能的には、I型周皮細胞は脂肪蓄積および/または線維化に寄与する脂肪生成分化を受けることができるが、II型周皮細胞は筋再生経路に沿って分化し、筋再生に寄与する19,24,25。これらの結果は、（1）I型の周皮細胞は、b（2）II型周皮細胞は、筋ジストロフィーに対して大きな治療可能性を有する。これらの集団のさらなる調査および特徴付けは、高レベルの純度でI型およびII型周皮細胞の分離を可能にする単離プロトコルを必要とする。 現在、周皮細胞亜集団の単離は、NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウスに依存している19,24。 NG2-DsRedマウスの利用可能性およびほとんどのNG2抗体の品質は、この方法の広範な使用を制限する。すべてのNG2 +周皮細胞もまた骨格筋19,20,24においてPDGFRβを発現することを考慮すると、我々は、NG2が、周皮細胞およびそれらの亜集団の単離のためにPDGFRβによって置換され得ると仮定する。この作業では、FACSベースのプロトコルについて説明します。PDGFRβ染色およびネスチン-GFPシグナルを使用する。この方法は、（1）NG2-DsRedバックグラウンドを必要とせず、（2）よく特徴付けられた市販のPDGFRβ抗体を使用するため、研究者の要求が少ない。さらに、これは、I型およびII型の周皮細胞を高純度で同時に単離することを可能にし、これらの周皮細胞亜集団の生物学および治療可能性をさらに調査することを可能にする。精製後、これらの細胞を培養で増殖させることができ、その形態を可視化することができる。この研究はまた、二重トランスジェニックマウスから精製されたものと同様に、この方法を用いて単離されたI型およびII型の周皮細胞が脂肪生成性および筋原性であることも示している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="705">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Cell Sorter</td>
			<td style="width:173px;">Sony</td>
			<td style="width:133px;">SH800</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Automatic Setup Beads</td>
			<td style="width:173px;">Sony</td>
			<td style="width:133px;">LE-B3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DMEM</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">11995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Avertin&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Pericyte Growth Medium</td>
			<td style="width:173px;">ScienCell</td>
			<td style="width:133px;">1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">MSC Basal Medium (Mouse)</td>
			<td style="width:173px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:133px;">5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)</td>
			<td style="width:173px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:133px;">5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">16000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">H1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Collagenase Type 2</td>
			<td style="width:173px;">Worthington</td>
			<td style="width:133px;">LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">0.25% Trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">PDL</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">PDGFR&#946;-PE Antibody</td>
			<td style="width:173px;">eBioscience</td>
			<td style="width:133px;">12-1402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Perilipin Antibody</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">P1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">S-Myosin Antibody</td>
			<td style="width:173px;">DSHB</td>
			<td style="width:133px;">MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Alexa 555-anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Alexa 555-anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:173px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:133px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td style="width:173px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">HEPES</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:133px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:311px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:311px;">KHCO3</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">P184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">PBS</td>
			<td style="width:173px;">Gibco</td>
			<td style="width:133px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">18G Needles</td>
			<td style="width:173px;">BD</td>
			<td style="width:133px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10ml Serological Pipette</td>
			<td style="width:173px;">BD</td>
			<td style="width:133px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of type i and type ii pericytes from mouse skeletal muscles

角質細胞は血管周囲多分化能細胞であり、異なる器官または同じ組織内でさえも異質性を示す。骨格筋には、異なる分子マーカーを発現し、明確な分化能力を有する、少なくとも2つの周皮細胞亜集団（I型およびII型と呼ばれる）が存在する。 NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウスを用いて、I型（NG2-DsRed + Nestin-GFP-）およびII型（NG2-DsRed + Nestin-GFP + ）の周皮細胞が正常に単離された。しかしながら、これらの二重トランスジェニックマウスの利用可能性は、この精製方法の広範な使用を妨げる。この研究は、骨格筋からのI型およびII型の周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にする代替プロトコールを記載する。このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別（FACS）技術を利用し、Nestin-GFPシグナルと共にNG2ではなくPDGFRβを標的とする。分離後、I型とTy型pe II周皮細胞は異なる形態を示す。さらに、この新しい方法で単離されたI型およびII型の周皮細胞は、二重トランスジェニックマウスから単離されたものと同様に、脂肪生成性および筋原性である。これらの結果は、このプロトコルを用いて、周皮細胞亜集団を骨格筋から、場合によっては他の組織から単離することができることを示唆している。

レーザ強度およびチャネル補償を含むFACSパラメータは、無染色対照および単色対照の結果に基づいて補正される。 PDGFRβ-PE-FMOコントロールを用いてPDGFRβ-PE +集団のゲーティングを設定する（ 図1A ）。 PDGFRβ-PE-細胞の中で、Nestin-GFP +およびNestin-GFP-細胞を表す2つの集団が明確に分離されている（ 図1A ）。 PDGFRβ-PE +ネスチン-GFP +およびPDGFRβ-PE +ネスチン-GFP集団のゲーティング境界は、PDGFRβ-PE +およびネスチン-GFP +のゲーティングに基づいて設定される（ 図1A ）。これらの境界は、PDGFRβ-PE +ネスチン-GFP + （II型周皮細胞）およびPDGFRβ-PE +ネスチン-GFP-（タイプI周皮細胞（ 図1B ）。単離されたPDGFRβ-PE + Nestin-GFP-およびPDGFRβ-PE + Nestin-GFP +細胞は、それぞれ単一細胞溶液中の全細胞の9.5％および2.1％を占める。 FACS単離されたI型およびII型周皮細胞は、培養3日後に形態学的差異を示す。タイプI周皮細胞は、丸い細胞体および短いプロセスを有するアメーバ様形態を示す（ 図2 ）。しかしながら、II型周皮細胞は、小さな細胞体および長い、薄いプロセスによって特徴づけられる、分化した形態を示す（ 図2 ）。この時点で、ほとんどのII型周皮細胞はNestin-GFP +として残り、一方、I型周皮細胞はNestin-GFPである（ 図2 ）。 さらに、タイプI、タイプII、ページではない脂肪分泌培地中で14日後に、ペリリピン発現脂肪細胞に分化する（ 図3 ）。タイプIIは、タイプIではなく、筋原性培地中で14日後にS-ミオシン発現筋管に分化する（ 図4 ）。これらの結果は、I型周皮細胞が脂肪生成性であり、II型周皮細胞が筋原性であることを強く示している。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig1.jpg" /> 図1 ：ゲーティングの境界と代表的なソート。 （ A ）PDGFRβ-PE + FMO対照の蛍光プロットであり、PDGFRβ-PE + Nestin-GFP-およびPDGFRβ-PE + Nestin-GFP +ゲーティング境界を示す。 （ B ）PDGFRβ-PE +ネスチン-GFPの分布を示す試料の代表的蛍光プロット<s（タイプI周皮細胞）およびPDGFRβ-PE + Nestin-GFP + （タイプII周皮細胞）細胞を含む。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig2.jpg" /> 図2： 分類されたI型およびII型周皮細胞における形態およびネスチン-GFP発現。選別したI型およびII型周皮細胞をカバーガラス上に播種し、周皮細胞培地で3日間増殖させた。タイプI周皮細胞は、蛍光顕微鏡（励起レーザー：488nm;励起および発光フィルター：それぞれ470 / 40nmおよび515 / 30nm）下で、短いプロセスおよび内因性GFPシグナルを伴わない丸い細胞体を示した。 II型周皮細胞は、細長い細胞体、長くて薄い過程を示し、内因性GFPシグナルは強い同じ設定で蛍光顕微鏡で観察した。スケールバー= 100μm <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig3.jpg" /> 図3： 分類されたI型およびII型周皮細胞の脂肪細胞分化。選別したI型およびII型周皮細胞を、周皮細胞培地で3日間培養した。その後、それらを脂肪生成培地中で14日間分化させた。細胞を固定し、抗ペリリピン抗体、続いてAlexa555ロバ抗ウサギ抗体で免疫染色した。免疫細胞化学では、II型のII型ではなく、I型が、蛍光顕微鏡（励起レーザー：543nm;励起および発光フィルター：540 / 45nmおよび600 / 50nm、尊敬）下で脂肪細胞マーカーペリリピン<html> ）。スケールバー= 50μm <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55904/55904fig4.jpg" /> 図4 ：分類されたI型およびII型周皮細胞の筋分化。選別されたI型およびII型の周皮細胞は、周皮細胞において3日間培養され、次いで筋原性培地中で14日間分化された。細胞を固定し、抗S-ミオシン抗体およびAlexa555ロバ抗マウス抗体で免疫染色した。免疫細胞化学では、II型は、蛍光顕微鏡（励起レーザー：543nm;励起および発光フィルター：540 / 45nmおよび600 / 50nm）下で、成熟筋管/筋線維マーカーS-ミオシン（赤色） 、それぞれ）。スケールバー=50μm//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> チューブ </td><td> 染色 </td></tr><tr><td>無染色対照</td><td>野生型マウス由来の単一細胞懸濁液</td></tr><tr><td> DAPI単色コントロール（死細胞排除） </td><td>野生型マウス+ DAPI（5μg/ mL）由来の単一細胞懸濁液</td></tr><tr><td> GFP単色コントロール</td><td> Nestin-GFPマウス由来の単一細胞懸濁液</td></tr><tr><td> PE単色制御</td><td> OneComp eBeads +PDGFRβ-PE抗体（4μg/ mL） </td></tr><tr><td> PE-FMOコントロール</td><td>ネスチン-GFPマウス+ DAPI（1μg/ mL）由来の単一細胞懸濁液</td></tr><tr><td>サンプル</td><td>ネスチン-GFPマウス+PDGFRβ-PE抗体（4μg/ mL）+DAPI（1μg/ mL） </td></tr></tbody></table> 表1：単色コントロール、PDGFRβ-PE-FMOコントロール、および筋肉サンプルの染色プロトコール。

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Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

この研究は、骨格筋からのI型およびII型周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にするFACSベースのプロトコールを記載する。

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K ビュー.  University of Minnesota. この研究は、骨格筋からのI型およびII型周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にするFACSベースのプロトコールを記載する。 

ビデオ: Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

発生生物学

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

ラットヘッドBranchiomeric筋肉から衛星細胞の単離とキャラクタリゼーション

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories due to the large size of the pancreatic duct that allows for ready collagenase injection and subsequent tissue perfusion. In contrast, islet isolation from small pancreata, like that of neonatal mice, is challenging because perfusion is not readily achievable in the small pancreata. Here we describe a detailed simple procedure that recovers substantial numbers of islets from newly born mice with visual assistance. Freshly dissected whole pancreata were digested with 0.5 mg/mL collagenase IV dissolved in Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) at 37 &#176;C, in microcentrifuge tubes. Tubes were tapped regularly to aid tissue dispersal. When most of the tissue was dispersed to small clusters around 1 mm, lysates were washed three to four times with culture media with 10% fetal bovine serum (FBS). Islet clusters, devoid of recognizable acinar tissues, can then be recovered under dissecting stereoscope. This method recovers 20 - 80 small- to large-sized islets per pancreas of newly born mouse. These islets are suitable for most conceivable downstream assays, including insulin secretion, gene expression, and culture. An example of insulin secretion assay is presented to validate the isolation process. The genetic background and degree of digestion are the largest factors determining the yield. Freshly made collagenase solution with high activity is preferred, as it aids in endocrine-exocrine isolation. The presence of cations [calcium (Ca2+) and magnesium (Mg2+)] in all solutions and fetal bovine serum in the wash/picking media are necessary for good yield of islets with proper integrity. A dissecting scope with good contrast and magnification will also help.

We describe a protocol herein for isolating intact islets from neonatal mice. Pancreata were partially digested with collagenase, followed by washing and hand picking. 20 - 80 islet clusters can be obtained per pancreas from newly born mice, which are suitable for several islet studies.

新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

骨格筋生検手順からのヒト筋前駆細胞の単離、培養、特徴付け、分化

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...