The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.

NOT: Bu protokol, sekonder antikor -etiketli Bet v 1, ana huş poleni antijeni bileşeni, artı bir alofikosiyanin (APC) karşı bir monoklonal antikor ile PM10 partiküllerinin dolaylı boyama (monoklonal, fare IgG1 antikoru, klon MA-3B4) tarif (anti -fare IgG1 antikoru, klon A85-1) ve bir akış sitometresi üzerinde sonraki analiz. Uygun diğer antikorlar mevcut, bu yöntem, çevre hava taneciklerine bağlanmış diğer antijenlerin tespiti da kapsayacak şekilde genişletilebilir. 1. PM10 Örnekleme <ol><li> Politetrafloroetilen (PTFE) ile çevre havası arasında PM10 toplamak 2.3 m3 / saat olarak (Şekil 1) &#39;in bir akış oranı ile, bir düşük ses örnekleyici kullanılarak filtreler. Burada tarif edilen deneyler için kullanılan numune bir karakterizasyonu, 16 bulunur. çalışma süresi gerekli PM10 miktarı (genellikle 1 ila 10 gün) bağlıdır. </li><li> İnkübasyon süresi sonunda, örnekleyici filtreyi kaldırmak ve en dondurmak-20 ° C kadar kullanılması. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> Şekil 1. Düşük hacimli PM10 örnekleyici. Düşük hacimli PM10 numune örneği. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2. PM10 Kaldırma ve Partikül Sayımı <ol><li> yaklaşık 5 dakika boyunca PTFE filtre çözülme edelim. Sonra temiz bir polistirol Petri kabı (Şekil 2A) filtreyi koydu. birden fazla filtre işleme durumunda, her filtre için yeni bir Petri çanağı. </li><li> Daha sonra, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile PTFE filtresi kaplaması. Bu protokol ml başına 8x10 6 parçacıkların bir nihai PM10 konsantrasyon için kurulmuştur (adım 3.3). en azından konsantrasyonu elde etmek için, filtreyi bindirmek için PBS aşağıdaki ampirik hacmini kullanın: PM10 toplama zamanı olsaydı &lt;<html> 2 gün, 2 ml kullanın. İnkübasyon süreleri ≥2 gün boyunca, 4 ml kullanın. Not: Bu, uygun ise, PM10 süspansiyonunun parçacık konsantrasyonunu arttırmak için, farklı filtreler arasında süspansiyonlar, havuza. </li><li> 1 dakika için duyarlı bir fırça kafası (Şekil 2b, 2c) olan bir elektrik diş fırçası ile cımbız ve fırça ile PTFE filtresi tutun. Temiz bir reaksiyon tüpüne, parçacık-PBS-süspansiyon, bundan sonra adlandırılan PM10 süspansiyon aktarın. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> Elektrikli bir diş fırçasının Şekil 2. PM10 çıkarılması. Örneklenmiş PM10 ile politetrafluoroetilen filtresi polistirol Petri kabı (A) içine yerleştirilmiş ve 4 mL PBS ile kaplanır. Ardından, PM10 bir elektrik diş fırçası ile çıkarılır (B: 1 dakika fırçalama sonra: fırçalama ve C öncesi).= &quot;Http://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <ol start="4"><li> Bir tanecik sayacı kullanımı ile, örneğin, PM10 parçacıkların konsantrasyonu ölçümü. , PM10 süspansiyon 10 ml izotonik ölçüm tamponunda gibi 50 ul yeterli bir hacmi sulandırmak üç kez ölçmek ve ml başına partiküllerin ortalama toplam sayısını hesaplayın. İlgili boyutta parçacıkları tespit edebilen bir parçacık sayacı kullandığınızdan emin olun. </li></ol> 3. Bet v 1 Boyama <ol><li> örnek analiz için gerekli reaksiyon tüpleri sayısını hesaplayın: en az üç, reaksiyon tüpleri gereklidir: (i) örnek, yalnızca (yerel kontrol) ile birlikte bir boru numunesinin ve ikincil antikor (negatif kontrol) ile birlikte, (ii) bir boru ve ( iii) örnek ve primer ve sekonder antikor (spesifik numune) ile bir boru. İlk kez ölçülür ise, (I) için en az iki reaksiyon tüpleri hazırlanması, (ii),ve (iii) düzgün ayarlarla sitometre ayarlamak için yeterli malzeme var (adım 4.1). </li><li> Reaksiyon tüplerin sayısı için gerekli PM10 süspansiyon miktarını hesaplayın. Her bir reaksiyon tüpü süspansiyonuna 50 ul gerektirir. </li><li> PBS, uygun bir miktarda eklenmesi ile, ml başına 8x10 6 partiküllerin nihai bir konsantrasyona kadar adım 3.2 hesaplanan süspansiyon hacminin Aşama 2.4&#39;te ölçülen partikül konsantrasyonu ayarlayın. NOT: Bu protokol için yeni hazırlanmış PM10 süspansiyon önerilir rağmen kalan PM10 süspansiyon, gelecek deneyler için -20 ° C&#39;de donmuş olabilir. </li><li> Blok,% 1 BSA PBS ile hazırlanan bir stok çözeltisi,% 0.02 nihai konsantrasyonu, sığır serum albümini (BSA) ile PM10 süspansiyonu ilave ile spesifik olmayan bağlanma. Vorteks kısa ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Her bir numune, akış sitometrisi ile analiz edilmesi için, AC adım 3.4 süspansiyon 50 ul transferyalın reaksiyon tüpü. Kısaca, belirli boyama, girdap için belirlenmiş reaksiyon tüpleri 0.02 ug / ul bir son konsantrasyonda Bet v 1 karşı bir monoklonal fare antikoru ilave edin ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edilir. <ol><li> Yerel kontrol ve negatif kontrol de, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca kalacak için belirlenmiş PM10-BSA süspansiyonu ile reaksiyon tüpleri olsun. </li></ol></li><li> PBS, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4,700 x g&#39;de numuneler daha sonra her bir reaksiyon tüpüne, girdap kısaca ve santrifüj% 0.02 BSA ile takviye edilmiş 500 ul ilave edilerek tüm örnekler yıkayın. bir vakum pompası kullanılarak dikkatli bir şekilde süpernatant atın. </li><li> Adımı tekrarlayın 3.6. </li><li> PBS Reaksiyon tüp başına% 0.02 BSA ile takviye edilmiş 50 ul içinde çözülmüş 1 mg antikor gerekli APC etiketli ikincil anti-fare IgG1 antikoru toplam miktarını belirler. % 0.02 BSA ile takviye edilmiş PBS ilgili hacmi, antikorun uygun miktarda seyreltilir. </li><li> Yerel kontrol için belirlenmiş reaksiyon tüpü hariç tüm reaksiyon tüpleri seyreltilmiş sekonder antikor, 50 ul ekle. PBS,% 0.02 BSA ile takviye edilmiş 50 ul ikincisi Ek. Girdap birkaç saniye için tüm örnekler. </li><li> Karanlıkta 30 dakika için tüm örnekler inkübe edin. </li><li> Adımı yineleyin 3.6 kez. </li><li> her bir reaksiyon tüpü, girdaba 50 ul PBS ilave edin ve bir akış sitometresi üzerinde analiz örnekleri. </li></ol> 4. Akım Sitometrisi Analizi <ol><li> parametreler sitometri aşağıdaki yerli kontrolü adjust kullanarak veri analizi optimize etmek. <ol><li> aygıt kontrol gemide görüntülenen ileri saçılım (FSC) eşik denetleyicisi kullanarak, en düşük değer (200) de FSC eşik ayarlamak ve analiz başlatın. </li><li> dağılım gerilim kontrolörü kullanılarak, tüm PM10 parçacıkları tespit edilebilir bu şekilde FSC ve yana saçılma (SSC) ayarlamak ve parçacıkların nüfusu th takriben olduğuFSC ekseninin ve SSC ekseninin alt yarısında e orta. </li><li> Floresan gerilim kontrolörü kullanılarak APC gerilim ve gerektiğinde, APC gibi aynı dalga uzunluğunda yaymaz flöresin izotiyosiyanat (FITC), gibi bir floresan gerilimini ayarlamak. tüm parçacıkların hem floresan eksenleri alt yarısında görünür olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Ardışık, yerli kontrolü dahil olmak üzere her örnek incelemek ve örnek başına en az 10.000 parçacıkların FSC, SSC, APC ve FITC veri depolamak. </li><li> İlgili yazılım ile verileri değerlendirmek. Belirli numunedeki adsorbe allerjen içeriği iki şekilde belirlenebilir: <ol><li> Tüm PM10 parçacıkları üzerinde Bet v 1 yükünün bir ölçüsü olarak, tüm partiküllerin (ortalama değer) APC floresan yoğunluğu analiz edin. NOT: Belirli örnek alerjen içeriyorsa, APC floresan yoğunluğu negatif kontrole kıyasla spesifik numunede artmalıdır. Buna karşın, diğer florEscence yoğunlukları (örn., FITC floresan yoğunluk) önemli bir değişiklik gerekir. </li><li> bağlı anti-Bet v 1 antikoru ile PM10 partikülleri yüzdesini hesaplayın. Böylece, negatif kontrol olarak, kopyalama ve özel numune içine bu kapıyı yapıştırın ve belirli numune APC pozitif parçacıkların yüzde negatif kontrol APC pozitif partiküllerin yüzdesini çıkarmak, APC pozitif kabul parçacıklar etrafında bir kapı ayarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+air+pollution+increase+the+effect+of+aeroallergens+on+hospitalization+for+asthma?.">Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).</li><li>Barraza-Villarreal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+pollution,+airway+inflammation,+and+lung+function+in+a+cohort+study+of+Mexico+City+schoolchildren.">Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren.</a> Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).</li><li>Chen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+ambient+air+pollution+with+airway+inflammation+in+schoolchildren.">The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren.</a> Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).</li><li>Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoor+allergens+in+settled+dust+from+kindergartens+in+city+of+Lodz,+Poland.">Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland.</a> Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+peanut+protein+in+the+home+environment.">Distribution of peanut protein in the home environment.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+allergic+inflammation.">The development of allergic inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).</li><li> World Health Organisation, R. O. f. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenology+and+human+health:+allergic+disorders:+report+on+WHO+meeting+Rome,+Italy.">Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy.</a> , 256 (2003).</li><li>Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+atopy+and+pollinosis+in+the+adult+population+of+Switzerland+(SAPALDIA+study).+Swiss+Study+on+Air+Pollution+and+Lung+Diseases+in+Adults.">Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults.</a> Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).</li><li>Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abortive+pollen+germination:+a+mechanism+of+allergen+release+in+birch,+alder,+and+hazel+revealed+by+immunogold+electron+microscopy.">Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy.</a> J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).</li><li>Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+allergens+adsorbed+to+ambient+air+particles+collected+in+four+European+cities.">Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities.</a> Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).</li><li>S&#252;ring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM10+contains+particle-bound+allergens:+Dust+analysis+by+Flow+Cytometry.">PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry.</a> Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).</li><li>Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+of+the+major+birch+tree+allergen+Bet+v+1+in+pollen+and+respirable+fine+particles+in+the+atmosphere.">Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere.</a> J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).</li><li>Buters, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allergen+Bet+v+1+in+fractions+of+ambient+air+deviates+from+birch+pollen+counts.">The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts.</a> Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).</li><li>Buters, J. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Bet+v+1+from+birch+pollen+from+5+European+countries.+Results+from+the+HIALINE+study.">Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study.</a> Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).</li><li>Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+house+dust+particles+and+diesel+exhaust+particles+as+allergen+carriers.">Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers.</a> Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peanut+protein+in+household+dust+is+related+to+household+peanut+consumption+and+is+biologically+active.">Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).</li><li>Jochner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+birch+and+grass+pollen+loads+and+allergen+release+at+two+sites+in+the+German+Alps.">Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps.</a> Atmos Env. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

protokol kritik bir safha, çevredeki havadan PM10 partiküllerinin toplanması için uygun bir filtre kullanımı (adım 1.1). Filtre bir elektrik diş fırçası ile fırçalama katlanmak için yeterince güçlü olmak zorunda değil, tüm filtre malzemeleri bu şartı yerine getirmek. Boyama protokolü ml başına 8x10 6 parçacık, bir PM10 partikül konsantrasyonu ile kurulmuştur. materyal sınırlıdır ve numunelerin havuzu uygun değildir, ancak eğer yöntem muhtemelen de işlev görecektir, ancak antikor konsantrasyonları ayarlanması gerekebilir (adımlarını 3.5 ve 3.8 bakınız). PM10 parçacıkların Bet v 1 boyama pozitif ve negatif boyanmış parçacıkların farklı popülasyonlarda sonuçlanmamıştır. Bu kadar çok az bir miktarda yüksek arasında değişen partiküller her adsorbe Bet v 1 alerjen değişen miktarlarda neden olabilir. Bu nedenle nüfus doğru kayması APC sinyali genişlemesine neden olabilirAPC pozitifliği. Tüm parçacıkların ortalama APC floresans yoğunluğunu ölçülmesi ile (I) &#39;e göre miktar: negatif parçacıklardan pozitif ayırmak zor olduğu için, iki belirleme yöntemi PM10&gt; 0.5 örneklerin Bet v 1 içeriğine farklılıkları belirlemek için kullanıldı ve (ii) APC pozitif parçacıkların oranının belirlenmesini içerir. Düşük ve yüksek polen sezonu PM10&gt; 0.5 parçacıkların Bet v 1 yükü ile ilgili olarak, her iki yöntem de benzer sonuçlar ortaya koydu. bu nedenle kapıyı yerleştirme bağımsız ve olduğu gibi Yine de, tüm parçacıkların ortalama floresan yoğunluğu göreceli ölçümü önerilmektedir muhtemelen daha az hata eğilimli. Bugüne kadar birçok çalışma ELISA 5,12-14,17 ile ilgili alerjen ve sonraki ölçümü çıkartarak ortam hava partiküler madde alerjen içeriğini incelemek. Burada anlatılan prosedürü ve quantificatio arasında temel bir fark vardırn ELISA ile: akış sitometri parçacık bağlı antijen analizleri ise ELISA, ayıklanır ve çözünmüş antijeni rakamlarla. ELISA vasıtasıyla test PM10 örneklerin Bet v 1 yük (n = 8) 1.2 ng / ml teşhis sınırının altında olduğunu (veriler gösterilmemiştir). Benzer şekilde, Buters ve diğerleri PM &lt;2.5 mikron fraksiyonu ve 10 um sadece yaklaşık% 7&gt; PM&gt; 2.5 mikron fraksiyonu, ancak PM ortam havasının 13&gt; 10 mikron kesir fazla% 93 hiçbir Bahis v 1 belirledi. Bir taraftan ve diğer taraftan da, FACS analizi, ELISA zıt sonuçları, birbirinden farklı hassasiyet ile bağlantılı olarak saptama yöntemi farklılıklardan kaynaklanabilir. Daha fazla araştırma ancak tam olarak bu farkı anlamak için gereklidir. Bir yöntem parçacık bağlı antijen elektron mikroskobu 10,14 tarıyor görselleştirmek için. Taramalı elektron mikroskopisi, Ormstad ve ark., Asılı partikül mat yüzeyi görsel Bet v 1r kurum parçacıkları yüksek polen mevsimi ve düşük polen sezon 15 örneklenmiş parçacıklar üzerinde daha az bir ölçüde örneklenmiş. Buna ek olarak, polen, lateks ve β-glukan alerjenleri, ortam havası 10 yanma parçacıklarına bulunmuştur. Bu yöntem, bununla birlikte, partikül bağlı allerjen miktarının izin vermez. akış sitometrisi kullanılmasıyla parçacık bağlı Bet v 1 alerjen nicelendirilebilir. Böylece, yandan diğer uygun antikorlar gibi PM10 10 ile 0,5 um biyolojik fraksiyonu karakterize etmek için yeni bir yol sunabilir akış sitometri, bu yöntem, ortam hava partiküllerinin, örneğin, kalıp, toz akarı diğer antijenlerin tespiti için uzatılabilir olabilir alerjenler veya LPS. PM10 partikülleri oldukça kolay da kimyasallar ve metaller sadece biyolojik madde absorbe, ancak, antikorların bağlanma belirsiz, ancak bir sorun teşkil edebilir. Yeni bir antikor test edilirse, kritik bir adımdır belirli bağlama kanıtlamak içining. Bu 11 boyanmadan önce ilgili antijen ile spesifik antikor bağlanma kapasitesini bloke örneğin yapılabilir. 14,18 saymak Bet v olarak ortam havasının 1 içerik huş poleni sayısı 12,13,18 farklı olabilir, alerjik belirtiler belki polen ile daha alerjen düzeyi ile daha iyi ilişki olabilir. Bu nedenle, klinik verilerle birlikte sunulan yöntem huş alerjik reaksiyonlar PM10&gt; 0.5 Bet v 1 alerjen yükü uygun olup olmadığını gelecek deneylerde incelemek için olanak sağlar.

Hava kirliliği son yıllarda 1-3 gözlenen solunum alerji artan insidansı ve şiddeti önemli bir çevre nedeni olarak kabul ediliyor. Ayrıca, toz 4,5&#39;ten ortak allerjenlerin dağılımında giderek artan bir ilgi vardı. Huş ağacı polen saman nezlesi sebep olabilir ama aynı zamanda alerjik astım 6-8 önemli bir tetikleyicisi olabilir. Tüm huş poleni alt solunum yoluna veya boyutu (çapı 22 mm) bir sonucu olarak, PM10 bulunabilir olası değildir. Ancak, Bet v 1, büyük huş poleni alerjen bileşeni gibi huş ağacı poleni alerjenler polen rüptürü 9 sonra serbest bırakılabilir ve alt solunum yollarını böylece muhtemelen, ortam hava partiküllerinin 10 bağlanan girebilirsiniz. Gerçekten de, bir polen alerjisi Probandın 11 bazofil in vitro aktivasyonu ile gösterildiği gibi PM10 biyolojik olarak aktif alerjenler içerebilir gösterilmiştir </sus&gt;. PM10 örneklerinde Bet v 1 allerjen içeriği ELISA 12-14 ile ilgili alerjen ve sonraki ölçümü ayıklanması tarafından incelenmiştir. ELISA tekniği ile, çözünmüş alerjen ölçüldü, ancak allerjen yüklü parçacıkların miktarı hala bilinmemektedir. Taramalı elektron mikroskobu alerjen yüklü parçacıklar açığa ama miktarının 10,15 izin vermedi. Bu çalışma ortam havası örneklerinde Bet v 1-yüklü PM10 partikülleri oranını ölçmek için flow sitometri kullanır. akış saptama sınırının dolayı, sadece daha büyük 0,5 um incelenebilir parçacıkları sitometresi. PM10&gt; 0.5 mikron fraksiyon PM10 olarak&gt; 0.5 sevk edilecektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teflon filter</td>
			<td style="width:143px;">Pall Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:119px;">R2PL047</td>
			<td style="width:167px;">47 mm, 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">low volume sampler&#160;</td>
			<td>Sven Leckel Ingenieur B&#252;ro GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">LVS3</td>
			<td>air flow of 2.3 m3/h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:143px;">Biochrom, Germany</td>
			<td style="width:119px;">L1825</td>
			<td>without Ca/Mg, low endotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">electrical toothbrush&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Oral-B Vitality Sensitive</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casy cell counter&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sch&#228;rfe System GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Model TTC</td>
			<td>range of detectable particle size: 0.7 &#181;m to 45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCanto II&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">3-laser, 8-color (4-2-2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Diva Software v6.1.3&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:119px;">A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">&#160;MA-3B4</td>
			<td style="width:167px;">clone MA-3B4</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">560089</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SPSSTM software version 18&#160;</td>
			<td style="width:143px;">PASW Statistics 18, Hongkong, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Gosselin, France</td>
			<td style="width:119px;">BP50-02</td>
			<td>D 55mm, H 15mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACS Tube&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">REF 352054</td>
			<td>5ml Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CASYton</td>
			<td style="width:143px;">Roche 
			Germany</td>
			<td style="width:119px;">REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Matrix Blank Tubes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4140</td>
			<td>1,4 ml, PP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:143px;">Heraeus, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:143px;">INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">Model 158 320</td>
			<td>Inetrgra Vacusafe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">recombinant Bet v 1a antigen&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">LTR-BV1A-1</td>
			<td>Concentration:&#160; 2.0 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10

Akış sitometri yaygın olarak 0.5 ila çapı onlarca mikrometre büyüklüğünde bir boyut aralığında hücreleri ya da bakteri gibi askıda katı madde miktarını belirlemek için kullanılan bir yöntemdir. ileri ve yana saçılma özellikleri bir karakterizasyonu ek olarak, ilgili yapıların tespit etmek için antikorlar gibi flüoresan etiketli markerlerin kullanımı sağlar. dolaylı bir antikor lekelemesi kullanılarak, huş polen alerjeni ölçmek için sitometrisi Burada kullanıldığı akış solunabilir parçacık halinde madde (PM10, parçacık boyutu çapı ≤10 um) çapı 0.5 ila 10 um parçacıklar -yüklü (tam olarak v, 1 BET). adsorbe olan alerjenlerin taşıyıcısı muhtemelen onlar alerjik reaksiyonlara yol açabileceğini alt solunum yollarının, onları taşımak olarak PM10 partikülleri hareket edebilir. Şimdiye kadar PM10 alerjen içeriği enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ve taramalı elektron mikroskobu ile incelenmiştir. ELISA parçacık çözündürüldü olup ölçerTT-bağlı allerjen. Alerjen yüklü parçacıklar görselleştirmek ayrıca onları ölçmek olabilir sitometrisi akabilir taramalı elektron mikroskobu ile karşılaştırıldığında. ortam havasının alerjen içeriği huş ağacı polen sayımı sapabilir gibi alerjik belirtiler belki polen sayımı daha alerjene maruz daha iyi korelasyon olabilir. klinik veriler ile birlikte, sunulan yöntem alerjik reaksiyonlar polen antijenleri PM10 partikülleri&gt; 0.5 um Bet v 1 allerjen içeriği ile ilişkilidir huş edip gelecek deneylerde test etmek için bir fırsat sunmaktadır.

PM10&gt; 0.5 parçacıklara Bet v 1 alerjen adsorpsiyon bir akış sitometresi üzerinde dolaylı bir antikor boyama ve daha sonra analizi ile nicelleştirilmiştir. yüksek polen mevsimi A PM10 örnek şablon olarak görev yaptı. Adım 3.1&#39;de belirtildiği gibi, negatif kontrol yalnızca sekonder antikor (Şekil 3A) etiketli APC ile inkübe PM10 parçacıklardan oluşur. Anti-Bet v 1 antikoru ve ikincil antikor ile boyandı PM10 parçacıkları alerjen yüklü parçacıklar (Şekil 3B) gösterilir. Aşama 4.3&#39;te tarif edildiği gibi, allerjen yükü miktarının iki yolu kullanılmıştır: Bir yandan, tüm partiküllerin APC floresan yoğunluğunun medyan değeri belirli bir numune için negatif kontrol için 137 ve 904 olmak analiz edilmiştir. Diğer tarafta, bağlanan bir anti-Bet v 1 antikoru olan partiküllerin yüzdesi tespit edilmiştir: bir kapı negatif kontrol APC pozitif partiküller etrafında yer alan ve daha sonra da kopied ve özel numune yapıştırılan. Negatif kontrol olarak, PM10&gt; 0.5 partiküllerin% 3 APC pozitif kabul edildi. Yanlış pozitif parçacıkların Bu yüzde, böylece% 77.5 APC pozitif PM10 ile sonuçlanan belirli bir numune pozitif partiküllerin yüzdesi&gt; Belirli örnek 0.5 partiküller çıkartılmıştır. gözlenen anti-Bet bağlayıcı v 1 antikor özel olduğunu kanıtlamak için, bağlama kapasitesi boyamadan önce ilgili antijen ile bloke edilmiştir. Bet v 1 pozitif PM10&gt; 0.5 partikülleri (Şekil 3C) yüzdesi ile belirlenir halinde APC floresan yoğunluğu ile belirlenir ve% 84 oranında, bu,% 69, anti-Bet v 1 antikorun azaldı. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> Şekil 3. Parçacık bağlı 1 alerjen yüksek po bir PM10 numune akışı sitometri. APC floresan yoğunluğu tarafından görüntülenmiştir olabilir Bet vSadece APC ile lekelenmiş llen sezonu ve rekombinant Bet v 1 antijen ile birincil antikor engelleme sonra ikincil antikor (B) etiketli anti-Bet v 1, birincil antikor, ve daha sonra da APC ile lekeli ikincil antikoru (A) işaretli (Cı ). Geçitli, P APC + APC pozitif kabul parçacıkların çevresinde kurulmuştur (kırmızı gösterilir) ve ilgili yüzdeler verilmiştir. Bu rakam biraz 11&#39;den modifiye edilmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bu yöntem, yüksek gelen ve düşük polen sezon PM10&gt; 0.5 örneklerin adsorbe Bet v 1 içerik miktarı farklılıkları ortaya çıkarmak için kabul edilebilir olup olmadığını test etmek için, yüksek 13 PM10 örnekleri ve düşük polen mevsimi 6 PM10 örnekleri analiz edildi. Şekil 4APC floresan ve Bet v 1 pozitif PM10&gt; düşük polen sezon PM10 örneklere göre yüksek polen sezon PM10 örneklerinin 0.5 parçacıkların oranında önemli farklılıklar göstermektedir. Hem miktar yöntemleri burada benzer sonuçlar göstermiştir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> Düşük ve yüksek polen mevsimi gelen Şekil 4. PM10 örnekleri (1. Düşük polen sezonu PM10 sonbahar / kış 2013 örneklenmiş (n = 6), yüksek polen sezonu PM10 Mayıs 2012 ile 2013 yılında oldu adsorbe Bet v kendi miktarında farklılık n = 13). (A) PM10 APC floresan yoğunluğu&gt; yüksek polen mevsimi 0.5 parçacıklar düşük polen mevsimi (medyan / min / max yüksek polen sezonu dan anlamlı olarak daha yüksek olduğu: 796/313/1097; medyan / min / max düşük polen sezonu: 197 / 85/277). (B) PM10 yüksek polen mevsimi gelen significan içeriyorduDüşük polen sezon PM10 daha tly fazla Bet v 1-pozitif PM10&gt; 0.5 partiküller (medyan / min / max yüksek polen sezonu: 45.2 / 18.5 / 74.5; medyan / min / max düşük polen sezon: 11.8 / 4.4 / 19.8). Kutu grafiği sırasıyla medyan değerleri (kutunun iç hat), 25. ve 75. yüzdelik (kutunun alt ve üst sınırları) ve minimum ve maksimum değerler (bıyık) göstermektedir. *** Düşük polen mevsimi karşı p &lt;0.001, Mann Whitney U testi. Bu rakam biraz 11&#39;den modifiye edilmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Burada, flow sitometri alerjen yüklü parçacıklar ölçmek için bir protokol mevcut. Ortam partiküler madde parçacıkları adsorbe alerjenlerin taşıyıcıları olarak hareket edebilir. Bu akış sitometrisi, bir yöntem olup çok çapı 0.5 um, bu alerjene yüklü parçacıkları ölçmek için kullanılabilir&gt; askıda katı madde karakterize etmek için kullanılan burada gösterir.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

flow-cytometric-analysis-of-particle-bound-bet-v-1-allergen-in-pm10

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Görüntüleme.  Federal Environment Agency.  Burada, flow sitometri alerjen yüklü parçacıklar ölçmek için bir protokol mevcut. Ortam partiküler madde parçacıkları adsorbe alerjenlerin taşıyıcıları olarak hareket edebilir. Bu akış sitometrisi, bir yöntem olup çok çapı 0.5 um, bu alerjene yüklü parçacıkları ölçmek için kullanılabilir> askıda katı madde karakterize etmek için kullanılan burada gösterir. 

Video: Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Alerjen Bağlı Astım murin Modeli

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in response to various immune stimuli. ROS generated during immune activation exerts potent antimicrobial activity primarily through the ability of ROS to damage DNA and proteins, causing death of microorganisms. Being able to measure ROS production reproducibly and with ease is necessary in order to assess the contribution of various pathways and molecules to this mechanism of host defense. In this paper, we demonstrate the use of fluorescent probes and flow cytometry to detect ROS production. Although widely used, fluorescent measurement of ROS is notoriously problematic, especially with regards to measurement of ROS induced by specific and not mitogenic stimuli. We present a detailed methodology to detect ROS generated as a result of specific Fc&#947;R stimulation beginning with macrophage generation, priming, staining, Fc&#947;R cross-linking, and ending with flow cytometric analysis.

This study demonstrates the use of flow cytometry to detect reactive oxygen species (ROS) production resulting from activation of the Fc&#947;R. This method can be used to assess changes in the antimicrobial and redox signaling function of phagocytes in response to immune complexes, opsonized microorganisms, or direct Fc&#947;R cross-linking.

Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...